完全麻醉的A型血友病小鼠尾静脉横断出血模型

尾部出血模型可作为评估止血化合物在体内的药理作用的重要工具，以确保实验间的可重复性。与其他敏感的出血模型相比，本模型采用失血量和出血时间作为终点指标，而非存活率。此外，该模型在麻醉状态下进行，从而减轻动物的疼痛和痛苦。

该技术对于血友病及其他凝血功能障碍疾病的临床前研究尤为有用，因为它能够测量血液在受伤后形成凝块并止血的能力。我们已广泛使用该模型，在利用血友病A小鼠开发新型血友病疗法的研究中测试促凝血化合物。然而，也可使用其他血友病小鼠品系，或通过抗凝血因子VIII抗体诱导血友病的小鼠。

本实验将由我实验室的资深技术员 Sarah 和 Dennis 进行演示。将小鼠麻醉后，将其放置于加热板上，并确保其鼻部位于鼻罩内。在麻醉期间，应使用适当的眼药膏以防止角膜干燥。

使用尾部标记块在尾部直径为2.5毫米处做标记，注意不要强行将尾部插入切口，确保尾部贴合紧密。然后将尾部放入生理盐水管中至少五分钟，以确保尾静脉充分温热，达到静脉给药的最佳状态。如有必要，可在五分钟后再进行静脉给药。

然后，将塑料覆盖物盖在小鼠身上以减少热量散失。在给予测试溶液后，将尾巴浸入液体中持续五分钟，随后进行尾静脉横切：将尾巴放入切割槽中并旋转90度以暴露静脉。在与测试溶液给药侧相反的一侧进行切割。

握住尾部，将11号手术刀片穿过切割块的切口，以造成出血。然后立即将尾部放回生理盐水中，并重置秒表。出血应立即可见。

将尾部浸入生理盐水中对于保持稳定的出血至关重要，因为在暴露于空气的情况下出血会迅速停止。观察出血情况，并在血流记录纸上标注40分钟内出血的开始和停止时间。如果在剪切后3分钟内原发性出血仍未停止，则应淘汰并更换小鼠，这可能表明剪切过深或小鼠存在原发性止血功能缺陷。

如果受伤后无出血，分别在10、20和30分钟时对尾部切口进行挑战。使用浸有温盐水的纱布拭子，将尾巴从盐水中提起，用湿润的纱布朝尾尖方向在尾部切口处轻轻但有力地擦拭两次。每次挑战后立即重新将尾巴浸入盛有盐水的试管中。

实验结束后，将小鼠尾部从生理盐水中取出，根据需要采集血液样本，并在小鼠仍处于完全麻醉状态下实施安乐死。将含有生理盐水的15毫升血液收集管在室温下以4,000 × g离心5分钟。弃去管中的上清液。

将沉淀重悬于2 mL红细胞裂解液中。然后，加入最多12 mL额外的裂解液进行稀释，直至溶液呈现浅咖啡色。记录总体积，并将2 mL稀释液转移至血红蛋白测定管中。

将其冷藏直至进行血红蛋白分析。使用优化后的方案，重组凝血因子VIII治疗组的失血量显著减少。每千克体重20国际单位的剂量可使出血完全恢复正常，而每千克体重10国际单位的剂量也具有显著效果，可使失血量降低至接近野生型范围的上限。

在出血时间方面也观察到了类似的结果。5、10 和 20 IU/千克剂量组均出现出血时间缩短，其中 20 IU/千克组的出血时间完全恢复正常。在野生型小鼠中，总失血量为 200 至 840 纳摩尔血红蛋白，而在对照溶剂处理小鼠中，总失血量为 5,300 至 7,100 纳摩尔血红蛋白。

对照组小鼠的平均出血量为5,200 纳摩尔，20 IU/千克剂量组为720 纳摩尔。野生型小鼠的出血时间范围为1至9分钟，10 IU/千克和20 IU/千克剂量组的出血时间均缩短至该范围内。在合并数据中，观察到出血量与出血时间之间存在强相关性。

所有记录的出血事件均被绘制成图，以直观展示每只小鼠出血的持续时间和出血次数。需要注意的是，在对照组中，经过第二次攻击后，大多数动物持续出血直至实验结束。血浆因子VIII浓度的测定证实，观察到的减少失血量和出血时间的效果呈重组因子VIII浓度依赖性。

接受中等和较高剂量重组 VIII 因子的动物，其血小板计数未受到明显影响，红细胞压积水平也在正常范围内；而在发生广泛出血的动物中（如对照组和每千克体重 1 IU 组），红细胞压积水平显著降低。在出现严重出血的动物中，血液计数可能受到轻微影响，尤其是总血红蛋白或红细胞压积。为了评估性别在此优化模型中的影响，对失血量和出血时间的结果进行了双因素方差分析（two-way ANOVA），以性别和剂量作为分析因素。

这些结果表明，不同性别的治疗反应没有差异。正确标记尾部并进行切割是确保该技术可靠性和可重复性的关键步骤，若无出血则构成挑战。此外，良好的麻醉诱导以及动物体温的维持尤为重要。

我们还利用该模型，在诱导出血10分钟后给予VIIa因子治疗，以模拟更接近按需治疗的情境，研究其对已发生出血的止血效果。