双色荧光交叉相关光谱法研究活细胞中蛋白质-蛋白质相互作用及蛋白质动力学

荧光交叉相关光谱是一种统计学方法，利用时间分辨荧光来精确定位活细胞中G蛋白偶联受体的动态特征。本文特别关注β-2肾上腺素能受体。鞘脂类受体主要提供有关平移扩散动力学的信息，结合荧光各向异性，还可获得旋转扩散信息。

通过引入额外的标记，我们还可以探测标记之间是否促进共振能量转移，从而判断是否存在促进结合或甚至构象变化的情况。定量的时间分辨荧光实验需要精确调整装置并进行校准测量。在接下来的几分钟内，我们将提供一份实验指南，介绍如何利用可克隆标签和合成荧光染料，对G蛋白偶联受体进行活细胞荧光相关光谱、交叉相关光谱以及福斯特共振能量转移研究。

细胞静置和固定操作需在无菌条件下进行。将洁净的盖玻片哑铃状载体放入六孔培养板中，用无菌磷酸盐缓冲液冲洗，随后向每孔加入2 mL含酚红的细胞培养基，培养基中需补充10%胎牛血清、100 微克/毫升青霉素和100 微克/毫升链霉素，并暂时放置备用。取在含酚红的相同培养基中、37摄氏度、5% CO2条件下培养的CHO细胞，用5 mL PBS洗涤以去除死细胞。

加入 2 mL 胰蛋白酶，在室温下孵育 2 分钟。用 8 mL 含酚红的培养基稀释数据细胞，并通过移液小心混匀。在 Neubauer 计数板中对细胞进行计数，并以每孔 150,000 个细胞的密度将细胞接种于六孔培养板中含盖玻片的孔内。

将细胞置于培养箱中培养24小时，使其融合度达到约80%。将两微克目的载体DNA（例如CT SNAP或NT SNAP）和六微升转染试剂分别加入两个独立的离心管中。

每个孔中加入500 µL含减血清培养基，于室温孵育5分钟。将两种溶液混合，得到转染混合物，并在室温下继续孵育20分钟。在此期间，用无菌PBS洗涤贴壁的CHO细胞一次。

用每孔 1 ml 不含酚红的培养基替换 PBS，培养基中添加 10% 胎牛血清，不加抗生素。将 1 ml 构建混合物逐滴加入每孔中，于含 5% CO2 的 37 摄氏度条件下孵育细胞过夜。用于标记时，将适量的 SNAP 底物稀释于 1 mL 添加了 10% 胎牛血清的培养基中，使终浓度为 1 µM。

用 PBS 清洗转染的细胞一次，每孔加入 1 mL 1 微摩尔的 SNAP 底物溶液。在 37 摄氏度、5% CO2 条件下孵育细胞 20 分钟。用不含酚红的培养基清洗细胞三次，每孔加入 2 mL 不含酚红的培养基。

将细胞在37摄氏度、5% CO2条件下孵育30分钟。随后将所有样品的盖玻片转移至成像室中，并用500 µL成像缓冲液洗涤。在转移至FRED FCS系统前，加入500 µL成像缓冲液。

FRED FCS 装置配备了一个共聚焦显微镜水镜物镜、两条激光线、一个时间门控单分子荧光计数系统、两个混合型 BMT 以及两个用于光子采集的探测器，同时还配有数据采集软件。每次在活细胞中进行测量前，对装置进行校准至关重要。为调节焦距、针孔及光路位置，需将两纳米浓度的绿色校准溶液滴加在玻璃盖玻片上，并开启485纳米和560纳米激光器，使其以堆叠式交错激发（PI模式）运行。

聚焦于溶液，并调整针孔和环形圈的位置，以获得最高的计数率和最小的共聚焦体积，从而得到最大的分子亮度。使用10纳摩尔的红色校准溶液以及两种溶液的混合物，对红色通道重复此过程。将10纳摩尔的DNA溶液置于玻璃盖玻片上，调整针孔的焦平面和环形圈的位置，使绿色和红色检测通道之间的交叉信号达到最强。

该信号具有最高的振幅。在活细胞中进行测量时，通过使用指示灯标记并经由目镜观察，找到一个合适的细胞。在PI模式下打开两台激光器，并通过寻找每秒最大计数来聚焦于细胞膜。

请注意，细胞样品可能需要降低激光功率，物镜处最好低于五微瓦。这在很大程度上取决于所使用的荧光染料和实验装置。

在数据采集软件的在线预览中观察结合了EGP和Snap标签探针的β-2肾上腺素受体的自相关和互相关曲线，并采集多个分选测量数据，每个测量的采集时间介于60至180秒之间。导出所有测量的相关曲线和对比度数据。请注意正确定义脉冲和延迟时间窗口，并在数据相关软件中使用微时间获取选项。

总共需要三种不同的相关性分析：绿色通道即时时间窗口的自相关，红色通道的自相关，以及延迟时间窗口的自相关。

最后，绿色通道信号与延迟时间窗口中的红色通道信号进行了互相关分析。此处展示了绿色和红色荧光信号在溶液中的自相关函数，并将其拟合至一个包含三重态项的三维扩散模型，以校准两种颜色通道下共聚焦检测体积的形状和大小。其中，B 为曲线的基线，表示焦点处的分子数；TD 为扩散时间；S 为零点处横向与轴向半径之比（ω₀），即共聚焦体积单元的形状因子。三重态闪烁及光物理过程由振幅 AR 和弛豫时间 TR 描述。利用已知的绿色和红色校准样品的扩散系数，获得形状因子，从而确定有效共聚焦体积单元的尺寸与体积。

通过计算类似IFR的光谱，将通道零和通道二收集到的绿色荧光信号与在正确检测通道（通道一和通道三）中收集到的背景信号的比值进行分析。通过供体激发波长下受体信号的直接预期值，结合红色校准测量中背景校正对比度的比值，以及绿色激光在即时时间窗口激发与红色激光在延迟时间窗口激发下获得的背景校正信号，确定数据的受体流动特性。基于背景校正对比度，计算绿色和红色通道中的分子亮度B，并由此获得分子数量，进而对3D扩散拟合进行分析。

将绿色和红色通道的自相关，以及双标记DNA的绿色激发光与红色延迟光之间的互相关，同时拟合到3D扩散模型中，并保持自相关函数的形状因子恒定。互相关函数的形状因子通常介于这两个值之间。根据表观分子数和聚焦参数的拟合值，确定零相关时间处的振幅。

计算样品中绿色和红色膜张力完全共扩散（100%共扩散）的振幅比。将细胞样品拟合到适当的模型中。结果显示膜受体扩散在短时间扩散而非长时间扩散时，并不呈现双峰分布特征。

此外，还需要考虑光物理特性以及基底力导致的闪烁现象。其中，TD1 和 TD2 是两个必需的扩散时间，a1 是第一个扩散时间的分数。与自由 DNA 链在各个方向上扩散的校准测量不同，膜受体仅沿细胞膜进行二维扩散，需根据分子数量和焦点计算绿色或红色标记蛋白的浓度。

利用偏置质量计算共聚焦体积单元的体积。使用与单标记构建体相同的模型拟合双标记样品的两个自相关曲线，并使用双模扩散模型拟合互相关函数，以实现对系统的全局描述。所有三条曲线必须进行联合拟合。

扩散项在所有三种作物中均相同。唯一的区别在于声誉时间下降时的互相关函数。根据绿色或红色荧光蛋白各自的分子数量以及共聚焦体积单元的焦点和体积，计算其浓度。

利用从 DNA 样本获得的校正因子、细胞样本的振幅比以及相应的浓度，估算细胞样本中相互作用的绿色和红色标记蛋白的比例或浓度。将 FRED 样本的两种交替相关性拟合为单标记样本，并将前向交叉相关性拟合至包含反相关项的双峰扩散模型，其中 AF 反映总反相关的振幅，AR 和 TR 分别反映相应的振幅和弛豫时间。当由于 FRED 导致荧光变化呈反相关时，可能需要一个或多个反相关项，这会导致 FRED 交叉相关函数在低相关时间处出现下陷，同时两个自相关函数相应上升。

绿色和红色荧光溶液的校准测量得到的缩放因子在绿色通道为6.5，在红色通道为6.8。因此，在本次测量当天，共聚焦体积的大小分别为1.4和1.9飞升，分子亮度分别为每分子12.5千赫兹和每分子2.6千赫兹。在供体激发后，绿色荧光分子对红色通道的串扰为15%，绿色激发光对红色荧光分子的直接激发为38%。根据我们的DNA测量结果，确定共聚焦重叠体积的校正因子分别为0.6和0.7。转染了单标记构建体的细胞在细胞膜上表现出双峰式的二维扩散行为，其中大约一半的分子在50至100毫秒的时间尺度上缓慢扩散，另一半则在约2毫秒的时间尺度上相对快速地扩散，该现象在两种构建体中均存在。

此外，还存在三重闪烁现象。然而，在红色水平的 Snap 融合蛋白中，在 180 微秒处检测到另一个弛豫时间，这可能源于未结合的 Snap 直链形式。从双标记本身来看，当与抗 Snap 构建体相交时，两个标记位于细胞膜的两侧，此时收集到的测量数据较少，且噪声和红色外套相关性降低。

而此处的 PI 互相关值相当高。在此情况下，70% 的分子表现为慢速过程，时间尺度在一百毫秒以下，仅有 30% 表现为快速过程，约在一毫秒左右，双释放分子的比例较低，介于 15% 至 25% 之间。CT 快照的数据看起来更优，噪声也更少。然而，预期的最深前向反相关无法观察到，很可能被高水平的串扰、直接受体激发以及两种荧光团的三重态闪烁所掩盖。采用能够利用所收集荧光强度 DKS 的数据分析方案，可能有助于挽救这一情况，正如在模拟数据集中所展示的那样。

Fred FCS 技术的优势在于，除了可以研究 GPCR 的流动性外，还能够探究其构象动态。然而，在实验室中进行 FRED FCs 实验具有挑战性，需要转染效率高的细胞、高效的标记方法以及经过精确校准的仪器设备。此外，选择合适的 FRED 荧光对也极为关键。

关键的实验步骤包括转染条件的优化、背景信号的最小化以及自发荧光的控制。此外，Atoms 分析流程将有助于理解活细胞中受体的各种动态行为。我们希望本方案能为在活细胞实验中开展 FRED FCS 方法提供有用的参考。