双色荧光互相关光谱研究活细胞中蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质动力学

荧光互相关光谱是一种统计方法，它使用时间结果荧光来精确定位活细胞中G蛋白偶联受体的动态特征。在这里，我们对β-2肾上腺素能受体特别感兴趣。鞘脂受体主要提供有关平移扩散动力学的信息，并且在荧光各向异性的帮助下也提供旋转扩散。

通过引入额外的标签，如果促进所探测的标签之间的共振能量转移，我们还可以亲结合甚至构象变化。定量时间分辨荧光需要仔细对准设置和校准测量。在接下来的几分钟里，我们将提供生命细胞荧光相关光谱学，交叉相关光谱学和G蛋白偶联受体的Forster共振能量转移的实验指南，使用克隆标签和合成流力。

细胞坐位和转置需要在无菌条件下进行。将干净的盖子滑杠铃放在六孔培养板上，然后用无菌磷酸盐缓冲盐水冲洗，加入两mL含有酚红的细胞培养基，其中补充有10%胎牛血清，100微克，每胺青霉素和100微克每毫升链霉素到每个孔中，并将其放在一边。取在37摄氏度下以5%CO 2的苯酚红培养基培养的CHO细胞，并用5 mL PBS洗涤它们以除去死细胞。

加入两毫升胰蛋白酶，在室温下孵育两分钟。用8 mL含酚红培养基稀释数据细胞，并通过移液小心混合。在Neubauer室中计数细胞，并将细胞以每孔150， 000个细胞的密度置于含有盖玻片的六孔培养板中。

让细胞在培养箱中生长24小时，以达到约80%的汇合度。稀释两微克所需的载体DNA。例如，CT SNAP或NT SNAP，并将六微升的该转染试剂放入两个单独的管中。

每个孔含有500微升的还原血清培养基，并在室温下孵育五分钟。将两种溶液混合在一起以获得转染混合物，并在室温下再孵育20分钟。同时，用无菌PBS洗涤一次坐着的CHO细胞。

用每孔1毫升酚红游离培养基代替PBS，补充10%胎牛血清，不含抗生素。将一毫升滴的整个构建混合物加入每个孔中，并在37度下在5%的CO 2中孵育细胞过夜。为了标记，将适当的SNAP底物稀释在一个mL培养基中，补充10%胎牛血清，以获得一个微摩尔的最终浓度。

用PBS洗涤转染的细胞一次，每孔加入一个微摩尔SNAP底物溶液一mL。将细胞在37度下在5%的CO 2中孵育20分钟。用酚红游离培养基洗涤细胞三次，每孔加入两mL酚红游离培养基。

将细胞在37摄氏度下在5%的CO 2中孵育30分钟。随后将所有样品的盖玻片转移到成像室中，并用500微升成像缓冲液洗涤。在移动到FRED FCS设置之前添加500微升成像缓冲液。

FRED FCS装置配备了一个共聚焦显微镜水物镜，两条激光线，一个时间缝合器单一外来计数系统，两个混合BMT以及两个用于光子收集和数据收集软件的股票。在活细胞中每次测量之前，对设置进行校准非常重要。为了调整焦点，针孔和着色位置，将两个纳米摩尔绿色校准溶液放在玻璃盖滑轨上，然后打开在桩，交错激发或PI模式下操作的485纳米和560纳米激光器。

专注于溶液并调整针孔和环的位置，以获得最高的计数率和最小的共聚焦体积，以获得最大的分子亮度。用10纳摩尔红校准溶液和两者的混合物对红色通道重复此过程。将10纳米摩尔DNA溶液放在玻璃盖玻片上，调整针孔的焦点和环的位置，使绿色和红色检测通道之间的交叉颜色最高。

这是最高振幅的来源。对于活细胞的测量，通过用标记灯限制并通过眼观察来找到合适的细胞。在PI模式下打开两个激光器，并通过查找每秒的最大计数来聚焦膜。

请注意，可能需要降低细胞样品的激光功率。优选在物镜处小于五微瓦。这在很大程度上取决于所使用的花卉和设置。

在数据收集软件的在线预览中观察绑定到EGP和捕捉标签探头的beta-2 AR的自动和交叉碰撞曲线，并收集多个排序测量值，采集时间在60到180秒之间。导出所有测量值的相关过程和对比度。请在此处小心正确定义提示和延迟时间窗口，并在数据关联软件中使用一些微时间获取选项。

总共需要三种不同的相关性。绿色通道提示时间窗口的自动关联。红色通道和延迟时间窗口的自动关联。

最后是绿色通道信号的互相关，提示时间窗口是延迟时间窗口中的红色通道信号。以下是用于解的绿色和红色FRED的自动相关函数，并将它们拟合到3 DT扩散模型中，并具有额外的三重项，用于校准两个使用颜色通道的共聚焦检测体积的形状和大小，其中B是曲线的基线以及分子和焦点的数量， TD的扩散时间和S，零超过欧米茄零的共聚焦体积元件的形状因子。三重闪烁和光物理被描述为振幅AR和弛豫时间TR。使用绿色和红色校准的已知扩散系数，并获得形状因子以确定感染共聚焦体积元件的尺寸和体积。

计算跨越的光谱像IFR一样，将绿色荧光信号采集到的通道为零，并将两个通道放入正确的检测通道，通道1和3，作为背景收集的信号的比率。通过红色校准测量值的背景收集对比度与绿色激光激发的提示时间窗口激发到背景正确帐户的比率，确定供体激发波长对受体数据流的直接期望值。根据采集的背景对比度计算B的分子亮度，同时将绿色和红色两者的流动力两者收集到对比，并得到分子数并聚焦于3 DT扩散拟合。

拟合来自绿色和红色通道的超相关，以及从双水平DNA的绿色提示和红色延迟到3 DT扩散模型的跨相关，使获得的形状因子对于自动相关函数保持恒定。互相关函数的形状因子通常介于这两个值之间。根据分子表观数的字体值和焦点确定零相关时间的振幅。

计算样品的振幅比是绿色和红色地板力的100%共扩散。将细胞样本拟合到适当的模型。它们如何以双模态方式显示膜受体扩散并不好奇，这是一个短的，没有长的扩散时间。

此外，还必须考虑照片物理和眨眼地板力。这里到TD1和TD2，是两者所需的扩散时间。与自由骰子和DNA链扩散的校准测量相比，所有方向的膜受体仅显示沿细胞膜的2D扩散，从分子数量和焦点的角度计算绿色或红色标记蛋白的浓度。

和共聚焦体积元件的体积，使用偏置质量。使用与单能级构造相同的模型拟合双标记样本的两个中音相关性，并使用双模态扩散模型拟合互相关函数，注意系统的全局描述。所有三种作物必须共同适合。

所有三种作物的扩散项都是相同的。唯一的区别是信誉时间下降，互相关函数。根据各自的分子数量和焦点以及共聚焦体积元件的体积来计算绿色或红色劳动蛋白的浓度。

使用从DNA样品中获得的校正因子，细胞样品的振幅比和各自获得的浓度来估计细胞样品中相互作用的绿色和红色标记蛋白的分数或浓度。将FRED样本的两个变化相关性拟合为单个标记样本和前交叉相关到包含反相关项的双模态扩散模型，其中AF反映总反相关项的振幅，AR和TR反映各自的振幅和弛豫时间。在由于FRED引起的反相关荧光变化的情况下，可能需要一个或多个反相关项，这导致Fred互相关函数在低相关时间的下降与两个自动相关函数的增加相吻合。

绿色和红色花卉溶液的校准测量值为6.5和绿色通道，红色通道中的系数为6.8。因此，共聚焦体积在此测量日的晚些时候具有1.4和1.9毫微特的大小，分子亮度为每分子12.5千赫兹，每分子2.6千赫兹。我们有15%的串扰从绿色花卉进入供体激发后的红色通道和38%的直接（除了绿色激发红色花型的激发），从我们的DNA测量中，我们确定共聚焦重叠体积的校正因子到0.6和0.7，用单标签结构转染的细胞在细胞膜上显示出双模态二维扩散，其中大约一半的分子在细胞膜上缓慢扩散在两种构造中，50 到 100 毫秒的时间尺度和另一半相对较快的时间范围约为两毫秒。

此外，存在三重闪烁。然而，在红色水平捕捉构造中，在180微秒处获得了另一个松弛时间，这可能源于未绑定的快照直。从双标签本身，用抗卡扣结构进行横切，其中两个标签在细胞膜的两个不同侧面，两个较少的测量值已经收集了噪声和红色涂层的相关性。

这里的PI互相关相当高。这里70%的分子，如果你慢慢地在一百毫秒的时间尺度下，并且在一毫秒左右只有30%的速度，那么双释放分子的比例很低，介于15%到25%之间CT快照的数据看起来更好，噪音更小。然而，预期的前部最深的反相关是看不见的，并且很可能是通过大量的串扰，直接接受激发和两种花力的三重闪烁来质量，并且一旦数据分析方案利用收集的荧光强度DKS可能有助于挽救这一点，如模拟数据集所示。

Fred FCS技术的优势在于，除了移动性之外，我们还可以研究GPCR的会议动态。然而，在实验室中执行FRED FC具有挑战性，需要良好的转染细胞，有效的标记和完美的校准设置。只是一个FRED对专业力量也是非常关键的。

关键的实验步骤包括转染优化的优化、背景的最小化和自动荧光。此外，原子分析管道将有助于了解活细胞中受体的各种动力学。我们希望该协议在活细胞实验中执行FRED FCS方法将是有用的。