Name: 在微流体装置中生成具有功能性神经肌肉接头的人类运动单元 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: 了解利用微流体装置构建功能性人类运动单元的方法，通过共培养诱导多能干细胞来源的运动神经元与肌管形成神经肌肉接头。该模型可用于研究肌萎缩侧索硬化症等运动神经元疾病的发病机制与早期事件。

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作者感谢来自LiMoNe、分子神经生物学研究组（VIB-KU Leuven）的Nikky Corthout和Sebastian Munck在活细胞钙瞬变荧光记录方面的建议。本研究得到了比利时和卢森堡富布赖特委员会、KU Leuven（C1和&#34;Opening the Future&#34;基金）、VIB、科技创新署（IWT；SBO-iPSCAF）、&#34;弗拉芒科学基金会&#34;（FWO-Vlaanderen）、Target ALS、比利时肌萎缩侧索硬化症协会（A Cure for ALS）、比利时政府（由比利时联邦科学政策办公室发起的Interuniversity Attraction Poles Program P7/16）、Thierry Latran基金会以及&#34;比利时神经肌肉疾病协会&#34;（ABMM）的支持。T.V.和J.B.获得了FWO-Vlaanderen颁发的博士研究生奖学金。

L.V.D.B. 拥有组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂用于治疗腓骨肌萎缩症（Charcot-Marie-Tooth disease）的专利（专利号：US-2013227717-A1），是 Augustine Therapeutics 的科学联合创始人，并担任该公司科学顾问委员会成员。其他作者声明无竞争利益。

本方案描述了一种相对易于使用的方法，可在不到30天的时间内在市售的微流控装置中生成具有功能性神经肌肉接头（NMJ）的人类运动神经元单位。文中阐述了如何通过免疫细胞化学（ICC）和扫描电镜（SEM）等标准技术对NMJ进行形态学评估，以及如何通过活细胞钙成像进行功能评估。
该方案的一大优势在于采用了干细胞技术。这使得神经肌肉接头（NMJ）可以在健康和疾病状态下进行评估，且不受供体特征的影响。该模型在肌萎缩侧索硬化症（ALS）研究中已显示出成功和益处，我们此前已鉴定出由于 FUS 基因突变导致的神经突生长、再生以及神经肌肉接头数量减少等新型表型18。利用该模型，可进一步将研究扩展至病因尚不明确的散发性ALS，通过使用散发性ALS患者的诱导多能干细胞（iPSCs）进行研究。这相较于传统的动物模型具有优势，后者依赖于突变基因的转基因过表达来模拟人类疾病23,24。此外，我们完全基于人类细胞的系统有望重现人类特有的生理特征及疾病表现。先前的研究已揭示了啮齿类动物与人类在神经肌肉接头形态上的差异25，提示在利用啮齿类动物研究人类神经肌肉接头病理时需谨慎。尽管该系统是一种相对简单的体外（in vitro）体系，缺乏体内（in vivo）模型的复杂性，但已有研究表明，微流控装置中所呈现的神经肌肉接头形态与人类截肢样本中的神经肌肉接头相似25。此外，该模型允许在神经肌肉接头形成和成熟过程中对其进行评估，可能揭示出在人类尸检样本中缺失、无法识别或被忽视的早期疾病表型。
MABs 提供了一种生成肌管的有效方法，尽管其存活时间仅限于10天，这是该体系的一个缺点。肌管的存活依赖于其与培养表面的贴附，而肌纤维的自发性收缩可能会破坏这种贴附。超过10天后，大多数肌管会脱落，导致神经肌肉接头（NMJ）培养体系无法继续使用。理想情况下，肌管也应由诱导多能干细胞（iPSCs）产生。然而，由于融合指数存在较大差异26，目前的实验方案已被证明难以重复27,28,29,30。
通过使用市售的微流控装置，我们构建了一个完全可及的标准化系统。其他神经肌肉接头模型也存在31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42然而，这些方法通常依赖于单一腔室，缺乏不同细胞类型之间的区室化和流体隔离，或者依赖于定制的培养装置，这会降低实验的可及性以及潜在的可重复性。本实验方案所用的微流控装置可购买带有不同长度微沟槽的产品，从而允许进行轴突运输等进一步分析。43,44 或轴突切断术18,45,46 研究。隔室间的流体隔离进一步实现了对运动神经元或肌管的分区药物处理，这在治疗开发中具有优势。越来越多专注于微流控技术的公司涌现，提供了大量设备设计和功能选择，进一步提升了该技术的可及性。 体外 研究
综上所述，我们建立了一种可靠的、多功能且简便的方法，用于培养具有功能性神经肌肉接头的人类运动单位。

神经肌肉接头（NMJs）通过释放神经递质介导脊髓下运动神经元与骨骼肌纤维之间的通信1。在肌萎缩侧索硬化症（ALS）和脊髓性肌萎缩症（SMA）等运动神经元疾病中，神经肌肉接头发生退化，导致与肌肉的通信中断2,3,4,5,6,7。这使得患者逐渐丧失肌肉功能，最终因膈肌等重要肌群进行性萎缩而需要依赖轮椅，并需呼吸机维持生命。目前尚不清楚这些疾病中神经肌肉接头严重丧失的确切潜在机制。已有许多研究利用转基因动物模型，使我们对神经肌肉接头退行性变的发病机制有了一定认识5,6,8,9,10,11。然而，要全面理解其病理过程并对抗去神经化，建立一个可完全访问的人类研究系统至关重要。
在此方案中，介绍了一种相对简便的方法，通过使用市售的微流控装置共培养由人诱导多能干细胞（hiPSC）分化的运动神经元和由人原代肌源性祖细胞（MAB）分化的肌管，从而生成人神经肌肉接头（NMJ）。利用微流控技术对神经元的胞体与轴突进行极化及流体隔离的方法，自“Campenot”室首次被描述以来已有报道。12 20世纪70年代末以来，微流控技术不断发展，已开发出多种微流控设计，包括商业化产品。本方案所用装置包含两个腔室，每个腔室由两个通过通道相连的孔组成13两个腔室呈对称分布，并通过多个微通道相连。这些微通道的尺寸可促进神经突的生长，同时借助毛细管静水压实现两个腔室之间的流体隔离。13,14利用该系统，可在不同区室中分别培养运动神经元和肌细胞，并使用各自特定的培养基，同时通过微沟道中神经突的延伸实现与肌细胞的物理连接。该模型具有完全可及性和可调节性 体外 人类运动单位系统，可用于研究肌萎缩侧索硬化症（ALS）和脊髓性肌萎缩症（SMA）等疾病中神经肌肉接头的早期病理变化。

<table><tbody><tr><td>&amp;alpha;-bungarotoxin (Btx) Alexa fluor 555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B35451</td><td>抗体 (1:1000)</td></tr><tr><td>乙酸</td><td>CHEM-Lab NV</td><td>CL00.0116.1000</td><td>包被组分。H226，H314。P280</td></tr><tr><td>Aclar 33C 片材（SEM 片材）</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>50425-25</td><td>厚度：7.8 mil</td></tr><tr><td>聚集蛋白（重组人蛋白）</td><td>R&amp;D systems</td><td>6624-AG-050</td><td>培养基添加剂</td></tr><tr><td>Alexa fluor IgG (H+L) 488 驴抗兔</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21206</td><td>抗体 (1:1000)</td></tr><tr><td>Alexa fluor IgG (H+L) 555 驴抗山羊</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21432</td><td>抗体 (1:1000)</td></tr><tr><td>Alexa fluor IgG (H+L) 555 驴抗小鼠</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A31570</td><td>抗体 (1:1000)</td></tr><tr><td>Alexa fluor IgG (H+L) 647 驴抗小鼠</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A31571</td><td>抗体 (1:1000)</td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma</td><td>A4403</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>&amp;beta;III-微管蛋白（Tubulin）</td><td>Abcam</td><td>ab7751</td><td>抗体 (1:500)</td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31350010</td><td>培养基组分。H317。P280。</td></tr><tr><td>B-27（不含维生素A）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587-010</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>BDNF（脑源性神经营养因子）</td><td>Peprotech</td><td>450-02B</td><td>生长因子</td></tr><tr><td>bFGF（重组人碱性成纤维细胞生长因子）</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>生长因子</td></tr><tr><td>胆碱乙酰转移酶（ChAT）</td><td>Millipore</td><td>ab144P</td><td>抗体 (1:500)</td></tr><tr><td>小牛皮胶原蛋白</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17104019</td><td>包被组分</td></tr><tr><td>CNTF（睫状神经营养因子）</td><td>Peprotech</td><td>450-13B</td><td>生长因子</td></tr><tr><td>DAPI Nucblue 活细胞染色 ReadyProbes 试剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37605</td><td>免疫细胞化学组分</td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Tocris Bioscience</td><td>2634</td><td>培养基添加剂</td></tr><tr><td>结蛋白</td><td>Abcam</td><td>Ab15200</td><td>抗体 (1:200)</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11330032</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650-100ML</td><td>冷冻保存组分。H315，H319，H335。P280。</td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190250</td><td>无钙，无镁</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>VWR</td><td>20.821.296</td><td>消毒。H225。P280</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>Fluo-4 AM 活细胞染料</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F14201</td><td>钙成像染料</td></tr><tr><td>荧光封片介质</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td>免疫细胞化学组分</td></tr><tr><td>GDNF（胶质细胞系源性神经营养因子）</td><td>Peprotech</td><td>450-10B</td><td>生长因子</td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>Agar Scientific</td><td>R1020</td><td>固定组分。EUH071，H301，H314，H317，H330，H334，H410。P280。</td></tr><tr><td>马血清</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16050122</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>人碱性磷酸酶</td><td>R&amp;D systems</td><td>MAB1448</td><td>抗体</td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>NIH</td><td></td><td>ICC 分析</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12440053</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>胰岛素-转铁蛋白-硒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41400045</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>Islet-1</td><td>Millipore</td><td>ab4326</td><td>抗体 (1:400)</td></tr><tr><td>无血清替代物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828-028</td><td>冷冻保存组分</td></tr><tr><td>来自 Engelbreth-Holm-Swarm 小鼠肉瘤基底膜的层粘连蛋白</td><td>Sigma</td><td>L2020-1MG</td><td>包被组分及培养基添加剂</td></tr><tr><td>Leica SP8 DMI8 共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td>ICC 共聚焦显微镜</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-024</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>肌细胞生成素（MyoG）</td><td>Abcam</td><td>Ab124800</td><td>抗体 (1:500)</td></tr><tr><td>肌球蛋白重链（MyHC）</td><td>本实验室，SCIL</td><td></td><td>抗体 (1:20)</td></tr><tr><td>N-2 添加剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103049</td><td>包被及培养基组分</td></tr><tr><td>神经丝重链（NEFH）</td><td>Abcam</td><td>AB8135</td><td>抗体 (1:1000)</td></tr><tr><td>Nikon A1R 共聚焦显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td>活细胞钙成像显微镜</td></tr><tr><td>NIS-Elements AR 4.30.02 软件</td><td>Nikon</td><td></td><td>活细胞钙成像分析</td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140050</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>正常驴血清</td><td>Sigma</td><td>D9663-10ML</td><td>免疫细胞化学组分</td></tr><tr><td>Olig2</td><td>IBL</td><td>18953</td><td>抗体 (1:1000)</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td>储存设备</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>固定组分。H302，H312，H315，H317，H319，H332，H335，H341，H350。P280。</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（5000 U/mL）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15070063</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>培养皿（3 cm）</td><td>nunc</td><td>153066</td><td>直径：3 cm</td></tr><tr><td>培养皿（10 cm）</td><td>Sarstedt</td><td>833.902</td><td>直径：10 cm</td></tr><tr><td>培养板（6 孔）</td><td>Cellstar Greiner bio-one</td><td>657160</td><td>培养板</td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3000MP</td><td>Fluo-4 染料溶剂</td></tr><tr><td>多聚-L-鸟氨酸（PLO）</td><td>Sigma</td><td>P3655-100MG</td><td>包被组分</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>CHEM-Lab NV</td><td>CL00.1133.1000</td><td>钙成像试剂</td></tr><tr><td>视黄酸</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>培养基添加剂。H302，H315，H360FD，H410。P280。</td></tr><tr><td>RevitaCell 添加剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A2644501</td><td>ROCK 抑制剂溶液</td></tr><tr><td>Smoothened 激动剂</td><td>Merck Millipore</td><td>566660</td><td>培养基添加剂</td></tr><tr><td>二甲胂酸钠缓冲液</td><td>Sigma</td><td>C0250</td><td>固定组分。H301，H331，H350，H410。P280。</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>突触素（SYP）</td><td>Cell Signaling</td><td>5461S</td><td>抗体 (1:1000)</td></tr><tr><td>T75 培养瓶</td><td>Sigma</td><td>CLS3276</td><td>培养板</td></tr><tr><td>肌联蛋白</td><td>发育研究杂交瘤库</td><td>9D10</td><td>抗体 (1:300)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-250ML</td><td>免疫细胞化学组分。H302，H315，H318，H319，H410，H411。P280</td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12605010</td><td>MAB 解离溶液</td></tr><tr><td>氯化筒箭毒碱五水合物</td><td>Sigma</td><td>T2379-100G</td><td>乙酰胆碱受体阻断剂。H301。P280。</td></tr><tr><td>XonaChips 预组装微流控装置</td><td>Xona Microfluidics</td><td>XC150</td><td>微沟道长度：150 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>Xona 硅基微流控装置</td><td>Xona Microfluidics</td><td>SND75</td><td>微沟道长度：75 &amp;mu;m</td></tr></tbody></table>

在微流控装置中生成具有功能性神经肌肉接头的人类运动单元

Generation of Human Motor Units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices

神经肌肉接头（NMJs）是下运动神经元轴突与肌肉之间形成的特化突触，介导肌肉收缩的启动。在运动神经元疾病中，例如肌萎缩侧索硬化症（ALS）和脊髓性肌萎缩症（SMA），神经肌肉接头发生退变，导致肌肉萎缩和进行性瘫痪。由于缺乏可转化的研究模型，神经肌肉接头退变的潜在机制尚不明确。本研究旨在建立一种多功能且可重复的 体外 具有功能性神经肌肉接头（NMJs）的人体运动单元模型。因此，将人诱导性多能干细胞（hiPSC）来源的运动神经元与人原代中血管母细胞（MAB）来源的肌管在市售的微流控装置中进行共培养。利用流体隔离的微区室结构，可在允许细胞通过微沟槽接触的同时，维持各自细胞特异性的微环境。通过施加趋化性与体积梯度，促进运动神经元的神经突经由微沟槽生长，从而增强与肌管的相互作用并诱导NMJs的形成。这些NMJs通过免疫细胞化学方法鉴定，表现为运动神经元突触前标志物突触素（SYP）与肌管上突触后乙酰胆碱受体（AChR）标志物α-银环蛇毒素（Btx）的共定位，并利用扫描电子显微镜（SEM）进行形态学表征。通过在运动神经元去极化后检测肌管内的钙信号反应，验证了NMJs的功能性。利用标准微流控装置与干细胞技术构建的运动单元模型，可为未来研究健康与疾病状态下NMJs的功能提供有力工具。

在微流控装置中生成神经肌肉接头 
为了在商用微流控装置中构建具有功能性神经肌肉接头（NMJ）的人类运动单位，采用了由人诱导多能干细胞（iPSC）分化的运动神经元和由人肌源性祖细胞（MAB）分化的肌管细胞。起始细胞材料的质量至关重要，尤其是MAB融合形成肌管的能力，对本实验方案的成功尤为关键。MAB在体外培养中易于维持，但在将其应用于微流控装置之前，必须评估每一批细胞的融合能力（补充图1A,B）18。任何一批在分化10天后仍未观察到肌管形成的细胞均不应使用。在补充图1B中，融合指数通过计算每张图像中所有细胞核内，位于表达肌管标志物的肌管中的细胞核所占百分比来确定。我们发现，在共培养体系中生成神经肌肉接头时，约8%的融合指数已足够。
始终需要从纯化的iPSCs培养物开始进行运动神经元分化。输入的细胞越纯，获得的结果也就越纯。该运动神经元分化方案所生成的运动神经元培养物中，通常有85%–95%的细胞表达运动神经元标志物（补充图1C,D）18。剩余的细胞通常为未分化的前体细胞，在某些情况下可能发生大量增殖，从而对培养物的质量产生不利影响。为了获得本方案的最佳结果，应在将第10天的运动神经元-NPCs接种到装置之前，评估其运动神经元分化效率。此外，可在第11天进行NPC质量检测，以评估NPC标志物Olig2的表达情况（补充图1E,F）。
最初，运动神经元-NPCs 和 MABs 在第 10 天的同一时间点进行铺板。此处，MAB 的分化从第 11 天开始。在第 14 天实施的体积和生长因子梯度使我们能够在第 21 天评估神经肌肉接头（NMJ）的形成，从而将实验周期缩短了一周。有趣的是，我们可通过免疫细胞化学（ICC）观察到典型的 NMJ 形成（补充图 2A）。然而，在运动神经元分化的这一早期阶段，我们尚无法通过活细胞钙成像获得功能性信号输出（数据未显示）。我们得出结论：尽管 NMJ 的形态学特征具有潜力，但运动神经元尚未成熟到足以与成肌细胞形成功能性神经肌肉接头连接。这与我们此前的观察结果一致，即通过膜片钳电生理分析记录到的运动神经元自发性动作电位仅在运动神经元分化的第 35 天才会出现15。
此外，我们尝试通过在培养装置中将运动神经元成熟培养2周（第24天）后再接种MABs，以延长运动神经元的成熟过程以及共培养体系的稳定性。然而，观察到大量运动神经元的神经突自发穿过微沟道，导致MABs的贴附受到抑制（补充图2B）。由于通道内缺乏肌管形成，我们未能在第36天识别到神经肌肉接头，因此采用了28天的实验方案（图1）。
鉴定、定量与形态学表征 体外 神经肌肉接头 
在完成28天的实验方案后（图1），可获得完全功能性的神经肌肉接头（NMJs）。两者 体内 和 体外，通过突触前标志物与突触后标志物的共定位，可利用免疫组织化学或免疫细胞化学方法对神经肌肉接头（NMJs）进行表征。本研究采用神经丝重链（NEFH）与突触素（SYP）联合标记作为突触前标志物组合，从而能够追踪从运动神经元胞体至最远端突起的单个神经突。在肌肉侧，α-银环蛇毒素（Btx）被广泛用作乙酰胆碱受体（AChRs）的突触后标志物，本研究同样采用了该标记方法。添加聚集蛋白（agrin）和层粘连蛋白（laminin）可促进AChRs在肌膜上的聚集19,20,21，从而更易于鉴定乙酰胆碱受体（AChRs） 体外 同样增加了存在的乙酰胆碱受体（AChRs）和神经肌肉接头（NMJs）的数量18.
为了以无偏倚的方式定位并计算神经肌肉接头（NMJ），需通过肌球蛋白重链（MyHC）阳性来识别每条肌管，并使用倒置共聚焦显微镜在40倍放大倍数下以z轴层扫方式成像。对于非常长的肌管，需采集多个z轴层扫图像。在图像分析过程中，通过逐层检查每个z轴层扫图像，手动统计NEFH/SYP与Btx之间的共定位数量，并将共定位数量归一化为该z轴层扫图像中肌管的总数（图2A-C）18。并非所有肌管都具有神经肌肉接头，这一点在有神经支配的肌管定量结果中可见（图2D）。因此，必须采用无偏倚的记录方法，即对所有肌管进行成像，而不考虑是否存在Btx信号。
可以识别出两种形态类型 体外 系统。神经肌肉接头（NMJs）可表现为单接触点型，即一个神经突触仅在一个相互作用位点接触乙酰胆碱受体（AChR）簇；或表现为多接触点型，即一个神经突触展开并以更大的表面积与AChR簇发生接触。这两种形态均可通过免疫细胞化学方法鉴定（图 2A)18 以及扫描电子显微镜（SEM）图2B)18，同样可以被定量（图2C)18总体而言，多个接触点通过大范围的肌肉嵌入促进了更广泛的连接，表明神经肌肉接头（NMJ）的形成更为成熟。相比之下，单个接触点的神经肌肉接头由于培养体系处于早期发育阶段，被认为成熟度较低。
功能评估 体外 神经肌肉接头 
为了评估神经肌肉接头的功能，采用了活细胞钙瞬变记录技术（图3)18利用微流控装置的流体隔离系统，在运动神经元胞体侧施加高浓度（50 mM）氯化钾刺激，同时记录加载了钙离子敏感性染料Fluo-4的肌管中钙离子内流情况。图3A). 运动神经元激活后几乎立即可通过特征性的波形变化观察到肌管内的钙离子内流，这证实了运动神经元-神经突与肌管之间存在功能性连接（图 3A- C)18未观察到自发性钙波或自发性肌管收缩，但在氯化钾直接刺激下可观察到肌管收缩。通过向肌管区加入竞争性乙酰胆碱受体拮抗剂氯化琥珀胆碱五水合物（DTC）进一步验证了连接的特异性图3A)，从而抑制了钙离子内流（图3C）。该结果证实了运动神经元与肌管之间的连接形成了功能完整的神经肌肉接头（NMJs）。为了评估通过神经肌肉接头刺激激活的肌管数量，直接使用氯化钾刺激肌管区，以确定该区域内全部可激活肌管的数量。约70%的肌管可通过运动神经元刺激并经氯化钾激活而产生反应。图3D)18.
这些结果证实，在为期28天的共培养方案中，通过将诱导多能干细胞来源的运动神经元与MAB来源的肌管共培养，可实现神经肌肉接头在形成、数量、形态及功能方面的最优化。
<img alt="神经肌肉接头（NMJ）定量；显微镜图像、示意图和柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62959/62959fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：微流控装置中的神经肌肉接头（NMJ）形成。 （A）在第28天，预组装微流控装置中神经肌肉接头形成的共聚焦显微图像。通过轴突前标志物（NEFH 和 SYP）与肌管上经 MyHC 染色的突触后乙酰胆碱受体标志物（Btx）的共定位（箭头所示）来识别神经肌肉接头。神经肌肉接头在形态学上表现为神经突与乙酰胆碱受体簇之间形成单个或多个接触点。DAPI 标记细胞核。比例尺为 25 µm。插图显示一个神经肌肉接头的放大图像，插图比例尺为 10 µm。（B）在第28天，硅基微流控装置中神经肌肉接头形态的扫描电镜（SEM）图像。箭头表示神经突嵌入肌管中。比例尺为 2 µm。插图显示神经肌肉接头的放大图像，插图比例尺为 1 µm。（C）每根肌管上神经肌肉接头总数，以及每根肌管上具有单个和多个接触点的神经肌肉接头数量的定量分析。图表数据表示四次生物学重复实验的均值 ± 均值标准误。统计学显著性通过 Mann-Whitney 检验确定，* p &lt; 0.05。（D）受神经支配肌管百分比的定量分析。图表数据表示四次生物学重复实验的均值 ± 均值标准误。本图经 Stoklund Dittlau, K. 等人18 修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62959/62959fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="神经元兴奋性实验；示意图、荧光显微镜、神经肌肉接头功能图、饼状图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62959/62959fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3神经肌肉接头功能的验证 (A) 在第28天，于微流控装置中对预先组装的神经肌肉接头（NMJ）功能进行活细胞瞬时钙记录的示意图，记录在使用筒箭毒碱（DTC）阻断NMJ前后进行22. 浅绿色区室中的运动神经元用 50 mM 氯化钾（KCl）刺激，通过神经突引起细胞内运动神经元反应。这会引发钙离子（Ca2+) 在用钙敏感性Fluo-4染料标记的肌管中（深绿色区室）。B) 使用KCl刺激运动神经元后，肌管内钙离子浓度升高的荧光显微图像，显示刺激前、荧光强度峰值及刺激后的Fluo-4荧光变化。插图为受神经支配的活跃肌管的放大图像。比例尺， 100 µm插图比例尺， 200 µm. (C) 运动神经元经KCl刺激后（箭头所示）肌管中典型的钙内流曲线，证实神经肌肉接头（NMJ）功能正常。肌管1-3显示通过运动神经元-肌管支配产生的特征性钙信号曲线，而肌管A-C在使用DTC阻断NMJ后呈现相应的钙信号曲线。D) 运动神经元刺激的活性肌管占总活性肌管数的比例。此图经 Stoklund Dittlau, K. 等人修改。18细胞示意图已根据 Smart Server 医学艺术图库修改22. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62959/62959fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
补充图 1：运动神经元验证、MAB 融合指数及 NPC 质量控制。（A）MAB 来源的肌管在启动分化后第 10 天的共聚焦图像。肌管使用肌管标志物 desmin、MyHC、myogenin（MyoG）和 titin 进行标记。细胞核用 DAPI 染色。比例尺，100 µm。（B）启动分化后第 10 天 MAB 融合指数的定量分析。在饥饿处理后，MAB 融合形成多核肌管，并对肌管标志物阳性（AB+）情况进行量化。图中数据表示三次生物学重复实验的均值 ± 均值标准误。（C）iPSC 来源的运动神经元在分化第 28 天的共聚焦图像，使用运动神经元标志物 NEFH、胆碱乙酰转移酶（ChAT）和 Islet-1，以及泛神经元标志物 βIII-tubulin（Tubulin）进行标记。细胞核用 DAPI 染色。比例尺，75 µm。（D）运动神经元标志物和泛神经元标志物（AB+）阳性细胞数量的定量分析。图中数据表示三次生物学重复实验的均值 ± 均值标准误。（E）iPSC 来源的神经前体细胞（NPC）在运动神经元分化第 11 天的共聚焦图像，使用 NPC 标志物 Olig2 和泛神经元标志物 βIII-tubulin（Tubulin）进行标记。细胞核用 DAPI 染色。比例尺，50 µm。（F）Olig2 和 βIII-tubulin（AB+）双阳性 NPC 数量的定量分析。图中数据表示三次生物学重复实验的均值 ± 均值标准误。本图经 Stoklund Dittlau, K. 等人18 修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62959/Supplemental%20Figure%201.tif" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图 2：共培养方案的优化（A）在运动神经元分化的第 21 天，于第 10 天与 NPCs 同时接种 MABs 时的神经肌肉接头（NMJ）形成的共聚焦图像。NMJ 通过突触前标志物（NEFH 和 SYP）与突触后乙酰胆碱受体标志物（Btx）在 MyHC 染色的肌管上的共定位（箭头）来识别。比例尺（左），10 µm；比例尺（右），5 µm。（B）第 24 天肌管通道的明场图像，显示自发的运动神经元神经突延伸阻碍了 MABs 的附着。比例尺，100 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62959/Supplemental%20Figure%202.tif" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>储存浓度</td>
			<td>终浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>1x</td>
			<td>80%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>胎牛血清</td>
			<td></td>
			<td>15%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>青霉素/链霉素</td>
			<td>5000 U/mL</td>
			<td>0.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-谷氨酰胺</td>
			<td>50x</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>丙酮酸钠</td>
			<td>100 mM</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>非必需氨基酸</td>
			<td>100x</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>胰岛素-转铁蛋白-硒</td>
			<td>100x</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF（新鲜添加）</td>
			<td>50 μg/mL</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：MAB生长培养基. 培养基可在 4 °CbFGF 需在使用当天新鲜添加。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>储存浓度</td>
			<td>终浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
			<td>50%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal 培养基</td>
			<td></td>
			<td>50%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>青霉素/链霉素</td>
			<td>5000 U/mL</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-谷氨酰胺</td>
			<td>50x</td>
			<td>0.5 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 添加剂</td>
			<td>100x</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>不含维生素 A 的 B-27</td>
			<td>50x</td>
			<td>2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>β-巯基乙醇</td>
			<td>50 mM</td>
			<td>0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>抗坏血酸</td>
			<td>200 μM</td>
			<td>0.5 μM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：运动神经元基础培养基. 培养基可在 4 °C.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>天数</td>
			<td>试剂</td>
			<td>储存浓度</td>
			<td>终浓度</td>
			<td>作用部位</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">第10/11天</td>
			<td>Smoothened激动剂</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>500 nM</td>
			<td rowspan="5">两者</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>视黄酸</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>0.1 μM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>100 mM</td>
			<td>10 μM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>0.1 mg/mL</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>0.1 mg/mL</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">第14天</td>
			<td>DAPT</td>
			<td>100 mM</td>
			<td>20 μM</td>
			<td rowspan="3">两者</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>0.1 mg/mL</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>0.1 mg/mL</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">第16天</td>
			<td>DAPT</td>
			<td>100 mM</td>
			<td>20 μM</td>
			<td rowspan="4">两者</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>0.1 mg/mL</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>0.1 mg/mL</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNTF</td>
			<td>0.1 mg/mL</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">第18天</td>
			<td>BDNF</td>
			<td>0.1 mg/mL</td>
			<td>10 ng/mL</td>
			<td rowspan="3">运动神经元</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>0.1 mg/mL</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNTF</td>
			<td>0.1 mg/mL</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">第21天起</td>
			<td>BDNF</td>
			<td>0.1 mg/mL</td>
			<td>30 ng/mL</td>
			<td rowspan="5">肌管</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>0.1 mg/mL</td>
			<td>30 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNTF</td>
			<td>0.1 mg/mL</td>
			<td>30 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrin</td>
			<td>50 μg/mL</td>
			<td>0.01 μg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>1 mg/mL</td>
			<td>20 μg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>第21天起</td>
			<td>无添加物</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>运动神经元</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：运动神经元培养基添加剂. 添加剂需在使用当天新鲜加入运动神经元基础培养基中。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>天数</td>
			<td>试剂</td>
			<td>储存浓度</td>
			<td>终浓度</td>
			<td>反应室</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">第18天</td>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
			<td>97%</td>
			<td rowspan="4">MAB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>丙酮酸钠</td>
			<td>100 mM</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>马血清</td>
			<td></td>
			<td>2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrin</td>
			<td>50 μg/mL</td>
			<td>0.01 μg/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表4：MAB分化培养基. 培养基在4 °C下可保存2周。使用当天需新鲜添加Agrin。

我们描述了一种在市售微流控装置中生成人类运动单位的方法，该方法通过共培养人诱导多能干细胞来源的运动神经元与人原代中血管母细胞来源的肌管细胞，从而形成功能性活跃的神经肌肉接头。

神经肌肉接头（NMJs）是下运动神经元轴突与肌肉之间的特化突触，可促进肌肉的激活……

这种相对简单的方法有助于针对健康和疾病状态下运动神经元及神经肌肉接头的研究。本方案采用标准的干细胞技术和市售的微流控装置，从而提高了可重复性。运动神经元与肌细胞之间的分离是多种神经肌肉疾病中的早期现象。一种简单的人源化模型可能有助于开发应对这一现象的策略。我们利用该模型研究运动神经元疾病——肌萎缩侧索硬化症，然而该模型也可用于其他以运动单位为核心机制的疾病。首先用镊子将装置从运输容器中转移至含有10毫升70%至100%乙醇的培养皿中，进行10秒的消毒处理。用镊子将装置转移至一张纸上，在超净工作台中晾干约30分钟。装置干燥后，用镊子将每个装置转移至单独的10厘米培养皿中。为用多聚-L-鸟氨酸（Poly-L-ornithine）或PLO包被装置，向顶部小孔加入100微升PLO溶液，并观察液体从顶部小孔经通道流至底部小孔的过程。然后，向底部小孔中加入 100 µL 多聚赖氨酸（PLO）溶液，并在微通道的另一侧重复此操作。最后，在一侧加入 100 µL PLO 溶液，以在装置两侧形成体积梯度，从而包被微通道。于 37 °C 及 5% CO₂ 条件下孵育 3 小时。三小时后，用DPBS清洗装置三次，每次五分钟。使用类似于PLO包被的方法，用20微克/毫升的层粘连蛋白和Neurobasal培养基对装置进行包被。在37°C和5%二氧化碳条件下将装置孵育过夜。次日，使用200微升移液器，将枪头置于与通道开口相对的孔中，以去除孔内的层粘连蛋白包被。向所有孔中加入DPBS后，将装有DPBS的装置置于室温下的层流环境中，用于细胞接种。裁剪SCM膜片至与装置相同大小，每边预留数毫米。将器械和SCM膜片置于含有10毫升70%至100%乙醇的培养皿中消毒10秒后，用镊子将器械转移至六孔板中，将SCM膜片转移至10厘米培养皿中，在超净工作台内晾干约30分钟。将器械竖直放置，以确保所有表面充分干燥。在六孔板中每孔加入1毫升PLO溶液，对器械进行包被。确保装置漂浮在PLO溶液表面，通道和微沟槽面朝下浸入液体中。向10厘米的培养皿中加入10毫升PLO溶液以包被SCM膜片，并用镊子将SCM膜片压入液体中。将装置和SCM膜片按照之前所示方法孵育3小时。三小时后，用DPBS将装置和SCM片清洗两次，每次五分钟，随后再用无菌水清洗五分钟。然后将每张SCM片转移至单独的10厘米培养皿中，使其自然风干。在超净工作台内的显微镜下操作，使用镊子将硅胶装置的微通道和微沟槽面朝下、以90度角垂直放置在SCM片上，并确保所有边缘对齐。轻轻按压装置，确保不仅外缘密封，而且孔、通道和微沟槽周围也完全密封。在层流条件下并在显微镜下，使用200 µL移液器将100 µL浓度为20 µg/mL的层粘连蛋白溶液加入顶部孔中，以对装置进行层粘连蛋白包被。观察液体从顶部孔经通道流至底部孔，确保孔和通道周围无任何泄漏。随后，向底部小孔中加入 100 微升层粘连蛋白溶液，重复此操作于微沟槽的另一侧，并在其中一侧额外再加入 100 微升层粘连蛋白溶液，以在装置两侧形成体积梯度，从而包被微沟槽，然后将装置过夜孵育。次日，使用 200 微升移液器将包被液从小孔中移除，移液时将枪头置于与通道开口相对的小孔中；在向所有小孔加入 DPBS 后，将装置置于室温下的层流环境中，并加入 DPBS 以备细胞接种。为在微流控装置中接种神经前体细胞（NPCs），使用 200 微升移液器移除装置中微沟槽一侧两个小孔内的 DPBS。每个装置接种总共250,000个NPC以及10天的运动神经元培养基60至100微升。在右上孔中，将一半细胞悬液以45度角靠近通道开口处接种。暂停数秒，使细胞悬液流经通道，然后在下方孔中加入剩余的一半细胞悬液。使用记号笔标记接种侧为NPC或相应标识，以便在无显微镜条件下轻松识别装置方向，并于5分钟后进行孵育以促进细胞贴壁。接下来，缓慢向两个已接种NPC的孔中加入额外的第10天运动神经元培养基，使每孔总体积达到200微升。使用200微升移液器，移除位于微沟槽另一侧、与新接种NPC相对的两个孔中的DPBS。向未接种细胞的孔中每孔加入200微升第10天运动神经元培养基。然后在每个10厘米培养皿中的装置周围加入6毫升DPBS，以防止孵育过程中培养基蒸发。更换培养基时，将200微升移液器吸头置于与通道开口相对的井壁底边，缓慢吸出含神经前体细胞（NPCs）的两个井中的培养基。为防止较强的液体流动损伤通道内的细胞，通过持续交替向顶部和底部的井中缓慢加入50至100微升新鲜运动神经元培养基。 重复该步骤，直至每个孔中含有200 µL培养基。在运动神经元分化第17天，使用200 µL移液器移除装置中微沟道未接种侧的运动神经元培养基，并用DPBS洗涤各孔。每台装置中加入总量为200,000个人类原代中血管祖细胞（mesoangioblasts）或MABs，接种体积为60至100 µL生长培养基，将细胞悬液的一半接种于上方孔中。暂停数秒，使细胞悬液流经通道，然后将剩余一半的细胞悬液接种到底部孔中，操作方式与之前接种NPCs的方法相同。将装置孵育5分钟，以使细胞贴壁。随后，向两个新接种MAB的孔中补充额外的生长培养基，并按照前述方法再次孵育。在运动神经元分化第21天，为建立化学趋向性和体积梯度，向肌管区每孔加入200微升含有生长因子的运动神经元神经基础培养基，然后向运动神经元区每孔加入100微升不含生长因子的运动神经元基础培养基。在将细胞系共培养于微流控装置之前，评估其分化潜能至关重要。已测定MABs的融合指数，估计约8%的融合率足以进行共培养。所获得的运动神经元培养物中，85%至95%表达运动神经元标志物。为表征和定量神经肌肉接头（NMJ）的数量，通过每组疾病样本的Z轴层扫图像，统计运动神经元与突触前标志物——神经丝重链和突触素，以及突触后乙酰胆碱受体标志物α-银环蛇毒素——之间的共定位数量，并以Z轴层扫图像中肌球蛋白重链标记的肌管数量进行归一化处理。这些神经肌肉接头表现为单一接触点的结构，即神经突触与一个乙酰胆碱受体簇在单个相互作用位点接触。或者为多个接触点的神经肌肉接头（NMJ），其中神经突起呈扇形展开，并在较大表面上与微弱的乙酰胆碱受体簇发生连接。对具有运动神经元支配的肌管所占百分比进行定量分析表明，并非所有肌管均含有神经肌肉接头。当使用氯化钾激活运动神经元时，在Fluo-4标记的肌管中观察到钙离子内流，证实了运动神经元突起与肌管之间存在功能性连接；而在肌管区室中加入神经肌肉接头阻断剂d-筒箭毒碱（DTC）后，则导致钙离子内流被抑制。为了使该模型获得最佳效果，进行细胞系质量检测以及避免装置通道中产生气泡至关重要。将培养皿中的神经肌肉接头与其他诱导性多能细胞直接分化的细胞类型相结合，能够更真实地模拟体外环境，同时也可研究这些细胞类型的作用。

generation-human-motor-units-with-functional-neuromuscular-junctions

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

在微流体装置中生成具有功能性神经肌肉接头的人类运动单元

该视频展示了利用微流控装置形成神经肌肉接头的过程。将神经前体细胞和肌源性前体细胞分别接种到装置内的不同小室中，并使其分别成熟为运动神经元和肌管。通过建立体积和化学梯度，诱导形成具有活性的神经肌肉接头。...

使用微流控装置生成神经肌肉接头

本视频展示了通过以下步骤创建运动神经类器官的方法：首先将人诱导多能干细胞在特定培养基中培养形成球状体，然后利用特定抑制剂将其分化为运动神经元，最后在微流控芯片中进行培养，以促进轴突延伸并形成运动神经类器官。...

利用微流控芯片开发人诱导多能干细胞来源的运动神经类器官

本实验详细介绍了一种利用人诱导性多能干细胞生成神经肌肉接头的方法。该方法通过分阶段的分化过程，促进肌管和运动神经元的发育以及突触的形成，从而获得具有功能的神经肌肉接头。...

利用基因编辑的人诱导多能干细胞体外诱导神经肌肉接头

本视频展示了一种评估功能性神经肌肉接头的方法。通过使用包含肌肉组织和运动神经元的生物反应器，并结合荧光显微镜技术，对神经元中的光敏通道进行刺激，从而产生电信号，引发肌纤维收缩。...

通过同步光学刺激与视频记录评估功能性神经肌肉接头

轴突运输是维持运动神经元健康的关键机制。在本方案中，我们提供了一种详细的方法，利用微流控小室对运动神经元轴突中酸性区室和线粒体的轴突运输进行示踪。...

使用微流控室系统研究运动神经元培养中细胞器的轴突运输

本文提供了一种利用人诱导性多能干细胞（iPSCs）在体外生成神经肌肉接头（NMJs）的实验方案。该方法可在单个孔中于一个月内诱导形成具有成熟形态和功能的神经肌肉接头。所获得的神经肌肉接头有望用于相关疾病的建模、病理机制的研究，或用于药物化合物的治疗性筛选。...

由人诱导性多能干细胞体外诱导生成神经肌肉接头

本方案提供了一种全面的流程，通过在组织培养芯片中由类球体自发组装延伸出强健的轴突束，从而构建人诱导多能干细胞来源的运动神经类器官。...

三维运动神经类器官的生成

本研究中，我们介绍了一种仅通过微流控系统中直流脉冲刺激诱导神经干细胞和前体细胞（NPCs）分化的实验方案。...

微流控装置中电场诱导的神经前体细胞分化

本文描述了一种详细的方案，用于制备三维人源骨骼肌微组织阵列，并进行微创的下游原位功能检测，包括收缩力和钙处理分析。...

评估人类骨骼肌微组织中骨骼肌健康的各项功能指标

我们描述了一种可重复、自动化且无偏倚的成像系统，该系统利用人源工程化骨骼肌组织和光遗传学运动神经元来表征神经肌肉接头功能。该系统能够随时间对神经肌肉连接的功能进行定量分析，并可检测由神经毒素及重症肌无力患者血清引起的神经肌肉功能下降。...

构建与表征人源神经肌肉接头的光遗传学模型

本方案描述了一种微流控系统的设计、制备和表征方法，该系统能够自动排列、固定并精确压缩数百个黑腹果蝇（Drosophila...

通过高通量微流控压缩系统对多细胞生物体进行机械刺激

了解利用微流体装置构建功能性人类运动单元的方法，通过共培养诱导多能干细胞来源的运动神经元与肌管形成神经肌肉接头。该模型可用于研究肌萎缩侧索硬化症等运动神经元疾病的发病机制与早期事件。

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