在微流控装置中生成具有功能性神经肌肉接头的人类运动单元

这种相对简单的方法有助于针对健康和疾病状态下运动神经元及神经肌肉接头的研究。本方案采用标准的干细胞技术和市售的微流控装置，从而提高了可重复性。运动神经元与肌细胞之间的分离是多种神经肌肉疾病中的早期现象。

一种简单的人源化模型可能有助于开发应对这一现象的策略。我们利用该模型研究运动神经元疾病——肌萎缩侧索硬化症，然而该模型也可用于其他以运动单位为核心机制的疾病。首先用镊子将装置从运输容器中转移至含有10毫升70%至100%乙醇的培养皿中，进行10秒的消毒处理。

用镊子将装置转移至一张纸上，在超净工作台中晾干约30分钟。装置干燥后，用镊子将每个装置转移至单独的10厘米培养皿中。为用多聚-L-鸟氨酸（Poly-L-ornithine）或PLO包被装置，向顶部小孔加入100微升PLO溶液，并观察液体从顶部小孔经通道流至底部小孔的过程。

然后，向底部小孔中加入 100 µL 多聚赖氨酸（PLO）溶液，并在微通道的另一侧重复此操作。最后，在一侧加入 100 µL PLO 溶液，以在装置两侧形成体积梯度，从而包被微通道。于 37 °C 及 5% CO₂ 条件下孵育 3 小时。

三小时后，用DPBS清洗装置三次，每次五分钟。使用类似于PLO包被的方法，用20微克/毫升的层粘连蛋白和Neurobasal培养基对装置进行包被。在37°C和5%二氧化碳条件下将装置孵育过夜。

次日，使用200微升移液器，将枪头置于与通道开口相对的孔中，以去除孔内的层粘连蛋白包被。向所有孔中加入DPBS后，将装有DPBS的装置置于室温下的层流环境中，用于细胞接种。裁剪SCM膜片至与装置相同大小，每边预留数毫米。

将器械和SCM膜片置于含有10毫升70%至100%乙醇的培养皿中消毒10秒后，用镊子将器械转移至六孔板中，将SCM膜片转移至10厘米培养皿中，在超净工作台内晾干约30分钟。将器械竖直放置，以确保所有表面充分干燥。在六孔板中每孔加入1毫升PLO溶液，对器械进行包被。

确保装置漂浮在PLO溶液表面，通道和微沟槽面朝下浸入液体中。向10厘米的培养皿中加入10毫升PLO溶液以包被SCM膜片，并用镊子将SCM膜片压入液体中。将装置和SCM膜片按照之前所示方法孵育3小时。

三小时后，用DPBS将装置和SCM片清洗两次，每次五分钟，随后再用无菌水清洗五分钟。然后将每张SCM片转移至单独的10厘米培养皿中，使其自然风干。在超净工作台内的显微镜下操作，使用镊子将硅胶装置的微通道和微沟槽面朝下、以90度角垂直放置在SCM片上，并确保所有边缘对齐。

轻轻按压装置，确保不仅外缘密封，而且孔、通道和微沟槽周围也完全密封。在层流条件下并在显微镜下，使用200 µL移液器将100 µL浓度为20 µg/mL的层粘连蛋白溶液加入顶部孔中，以对装置进行层粘连蛋白包被。观察液体从顶部孔经通道流至底部孔，确保孔和通道周围无任何泄漏。

随后，向底部小孔中加入 100 微升层粘连蛋白溶液，重复此操作于微沟槽的另一侧，并在其中一侧额外再加入 100 微升层粘连蛋白溶液，以在装置两侧形成体积梯度，从而包被微沟槽，然后将装置过夜孵育。次日，使用 200 微升移液器将包被液从小孔中移除，移液时将枪头置于与通道开口相对的小孔中；在向所有小孔加入 DPBS 后，将装置置于室温下的层流环境中，并加入 DPBS 以备细胞接种。为在微流控装置中接种神经前体细胞（NPCs），使用 200 微升移液器移除装置中微沟槽一侧两个小孔内的 DPBS。

每个装置接种总共250,000个NPC以及10天的运动神经元培养基60至100微升。在右上孔中，将一半细胞悬液以45度角靠近通道开口处接种。暂停数秒，使细胞悬液流经通道，然后在下方孔中加入剩余的一半细胞悬液。使用记号笔标记接种侧为NPC或相应标识，以便在无显微镜条件下轻松识别装置方向，并于5分钟后进行孵育以促进细胞贴壁。

接下来，缓慢向两个已接种NPC的孔中加入额外的第10天运动神经元培养基，使每孔总体积达到200微升。使用200微升移液器，移除位于微沟槽另一侧、与新接种NPC相对的两个孔中的DPBS。向未接种细胞的孔中每孔加入200微升第10天运动神经元培养基。

然后在每个10厘米培养皿中的装置周围加入6毫升DPBS，以防止孵育过程中培养基蒸发。更换培养基时，将200微升移液器吸头置于与通道开口相对的井壁底边，缓慢吸出含神经前体细胞（NPCs）的两个井中的培养基。为防止较强的液体流动损伤通道内的细胞，通过持续交替向顶部和底部的井中缓慢加入50至100微升新鲜运动神经元培养基。

重复该步骤，直至每个孔中含有200 µL培养基。在运动神经元分化第17天，使用200 µL移液器移除装置中微沟道未接种侧的运动神经元培养基，并用DPBS洗涤各孔。每台装置中加入总量为200,000个人类原代中血管祖细胞（mesoangioblasts）或MABs，接种体积为60至100 µL生长培养基，将细胞悬液的一半接种于上方孔中。

暂停数秒，使细胞悬液流经通道，然后将剩余一半的细胞悬液接种到底部孔中，操作方式与之前接种NPCs的方法相同。将装置孵育5分钟，以使细胞贴壁。随后，向两个新接种MAB的孔中补充额外的生长培养基，并按照前述方法再次孵育。

在运动神经元分化第21天，为建立化学趋向性和体积梯度，向肌管区每孔加入200微升含有生长因子的运动神经元神经基础培养基，然后向运动神经元区每孔加入100微升不含生长因子的运动神经元基础培养基。在将细胞系共培养于微流控装置之前，评估其分化潜能至关重要。已测定MABs的融合指数，估计约8%的融合率足以进行共培养。

所获得的运动神经元培养物中，85%至95%表达运动神经元标志物。为表征和定量神经肌肉接头（NMJ）的数量，通过每组疾病样本的Z轴层扫图像，统计运动神经元与突触前标志物——神经丝重链和突触素，以及突触后乙酰胆碱受体标志物α-银环蛇毒素——之间的共定位数量，并以Z轴层扫图像中肌球蛋白重链标记的肌管数量进行归一化处理。这些神经肌肉接头表现为单一接触点的结构，即神经突触与一个乙酰胆碱受体簇在单个相互作用位点接触。

或者为多个接触点的神经肌肉接头（NMJ），其中神经突起呈扇形展开，并在较大表面上与微弱的乙酰胆碱受体簇发生连接。对具有运动神经元支配的肌管所占百分比进行定量分析表明，并非所有肌管均含有神经肌肉接头。当使用氯化钾激活运动神经元时，在Fluo-4标记的肌管中观察到钙离子内流，证实了运动神经元突起与肌管之间存在功能性连接；而在肌管区室中加入神经肌肉接头阻断剂d-筒箭毒碱（DTC）后，则导致钙离子内流被抑制。

为了使该模型获得最佳效果，进行细胞系质量检测以及避免装置通道中产生气泡至关重要。将培养皿中的神经肌肉接头与其他诱导性多能细胞直接分化的细胞类型相结合，能够更真实地模拟体外环境，同时也可研究这些细胞类型的作用。