Name: DNA双链断裂时转录活性的活细胞成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: 学习利用荧光显微镜和报告基因系统对活细胞中DNA双链断裂位点的转录活性进行单分子水平成像的技术。该方法可实时追踪转录动态，为研究DNA损伤应答机制提供重要工具。

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我们感谢 R.H. Singer、J.A. Chao、T. Misteli 和 M. Carmo-Fonseca 惠赠质粒和试剂。我们还感谢 iMM 生物成像平台的工作人员 A. Temudo、A. Nascimento 和 J. Rino 对稿件的审阅与宝贵意见。本研究由葡萄牙科学技术基金会（FCT）资助，项目编号为 PTDC/MED-OUT/32271/2017、PTDC/BIA-MOL/30438/2017 和 PTDC/MED-OUT/4301/2020，并由 FEDER 通过葡萄牙 2020 区域运营计划—里斯本计划（POR Lisboa）与 FCT 共同资助，项目编号为 LISBOA-01-0145-FEDER-007391。本研究还获得了欧盟“地平线 2020”研究与创新计划（RiboMed 857119）的资助。M.A. 获得了 FCT 2020 年博士奖学金 2020.05899.BD 的资助。

1. 活细胞显微镜观察用细胞的准备与转染
<ol>
	<li>准备一个25 cm2 在活细胞显微镜实验前一天，向报告细胞系（EX2、EX2-AS 或 PROM）的细胞培养瓶中加入 5 mL DMEM，使细胞汇合度达到 80–90%。</li>
	<li>用移液管吸出25 cm²培养瓶中的培养基2 细胞培养瓶中加入2.5 mL 1x PBS洗涤细胞。</li>
	<li>加入1 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA，于37 °C孵育2-3分钟，使细胞脱落。</li>
	<li>细胞脱离后，加入4 mL不含酚红、含HEPES缓冲液的DMEM培养基，该培养基需补充10%（v/v）去炭处理的胎牛血清，并轻柔重悬细胞。</li>
	<li>将1 mL细胞溶液接种至带有10 mm玻璃底孔（直径No. 1.5）的35 mm圆形培养皿中，并混匀。将35 mm圆形培养皿置于100 mm标准细胞培养皿内，在37 °C、5% CO₂的湿润环境中孵育。2.</li>
	<li>接种后约6小时，对玻璃底培养皿中的细胞进行转染。每份转染混合物需按以下方式配制两种溶液：
	<ol>
		<li>在1.5 mL 微量离心管中，配制溶液A，包含150 µL 低血清最低必需培养基（MEM）和质粒DNA（如所述） 表1），以及2.5 µg/µL的转染辅助试剂DNA（参见 材料表).</li>
		<li>同时，配制溶液B，其中包含150 µL的&#160;低血清 MEM 培养基和 1.5 µg/µL DNA 的脂质转染试剂（参见 材料表).</li>
		<li>将两种溶液在室温（RT）下孵育5分钟。然后，轻轻将溶液A加入溶液B中，并在室温下孵育20分钟。</li>
		<li>转染细胞时，将300 µL A+B混合溶液逐滴加入每皿中，并轻轻混匀。将玻璃底培养皿置于100 mm标准细胞培养皿内，在37 °C、含5% CO₂的湿润环境中孵育。2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在1.5 mL微量离心管中加入200 µL含HEPES、不含酚红的DMEM培养基，该培养基需补充10%（v/v）活性炭处理过的胎牛血清，并加入TA使其终浓度达到7.5 × 10-7 M.</li>
</ol>
2. 实验装置
<ol>
	<li>在通用控制单元中，将大型亚克力显微镜培养箱和顶置式载物台培养箱的温度设置为 37 °C。将载物台培养箱内的环境条件设置为 5% CO2 和 100% 湿度。 
	注意：显微镜笼体和载物台培养箱的温度必须在实验开始前至少提前 1 小时设定，以确保整个系统充分预热，从而最大限度减少温度波动。同时启动所有其他显微镜控制和操作单元。</li>
	<li>在开始显微观察前约 1 小时，向生长培养基中加入强力霉素（0.5 µg/mL）以诱导报告基因的转录，并使用 200 µL 移液器轻轻吹打混匀。 
	注意：将含有转染细胞的玻底培养皿置于一个 100 mm 标准细胞培养皿内，以便于操作和运输；将其放入泡沫塑料容器中，从细胞培养室转移至显微镜室，以尽可能保持温度稳定。</li>
	<li>在开始观察前至少 30 分钟将细胞运送至显微镜处，到达后立即将装有细胞的 100 mm 培养皿放入已预热的大型显微镜培养箱中。</li>
	<li>将步骤 1.7 中预先稀释的 TA 置于微量离心管中，并放入大型显微镜环境培养箱内，使其升温至 37 °C。</li>
	<li>将玻底培养皿的盖子更换为与之前制备相同的、带有直径 3 mm 孔洞的盖子（图 2A）。 
	注意：后续将通过盖子上的小孔加入 TA，无需移动已安装在显微镜载物台上的培养皿。</li>
	<li>在显微镜控制面板中选择 100 倍（复消色差物镜，数值孔径 1.4）油浸物镜，并在物镜上滴加一滴浸油。
	<ol>
		<li>将装有细胞的玻底培养皿放入显微镜载物台培养箱中并固定到位。关闭载物台培养箱的盖子以及显微镜外壳的所有门。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>启动显微镜操作与控制软件，打开 聚焦控制 窗口（图 2B），点击 Scope 面板，在 发射光选择 面板中点击 100% Eye 框，以设置目镜光路，实现通过眼睛直接观察样品。
	<ol>
		<li>在 滤光片组 菜单中，切换至 Eye 滤光片组，点击 明场，然后按下 打开明场 按钮。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>移动显微镜物镜靠近玻底培养皿，直至浸油接触玻璃表面。然后通过目镜观察，手动对焦至细胞所在的焦平面。随后关闭 打开明场 按钮。</li>
	<li>在开始实验观察前，让细胞静置 30 分钟，以适应环境条件，并避免因温度梯度导致成像过程中出现焦平面漂移。</li>
	<li>将一支 200 µL 移液器和若干 200 µL 滤芯吸头在室温下放置备用。</li>
</ol>
3. 图像采集
<ol>
	<li>在显微镜控制软件的焦距控制窗口中，将激光强度设置为5%，并将曝光时间设为50 ms（图2B）。</li>
	<li>打开采集窗口，调整设置以执行三维（3D）延时成像的自动图像采集（图2C）。</li>
	<li>选择3D采集模式，设置12至16个光学切片，切片间距为0.4 µm，勾选围绕当前位置和采集后返回当前位置的复选框。</li>
	<li>在延时采集面板中，将时间点数量设为120，时间间隔设为30 s。</li>
	<li>根据转染的荧光蛋白标签选择共聚焦滤光片组：λ = 488 nm用于GFP，λ = 561 nm用于TagRFPt，以及λ = 640 nm用于iRFP713，并将每个通道的曝光时间设置为50 ms。</li>
	<li>在焦距窗口中选择的5%值的基础上，将激光功率的设置设为当前（图2C）。</li>
	<li>在焦距控制窗口中，进入相机面板，选择缩放图像显示控制，点击手动按钮以设定固定的图像强度显示范围。输入低值：500，高值：5000（见图2B）。 
	注意：该设置将实时预览中相机采集的动态范围限制在一定区间内，以便选择具有相似荧光强度范围的细胞（图2D）。</li>
	<li>选择在DNA双链断裂（DSB）诱导后用于3D延时成像的转录位点细胞。筛选细胞，并根据“讨论”部分所述条件选择三个视野。</li>
	<li>对先前已定位在视野中心的每个目标细胞进行调焦，使转录位点位于Z轴堆栈的中层平面上。 
	注意：在XYZ三维空间中居中定位细胞和转录位点，可适应细胞的轻微移动。</li>
	<li>在焦距控制窗口的XY面板中，点击设定点以标记每个XYZ位置。 
	注意：在接下来的5分钟内重复访问所选位置2-3次，以确认报告基因的持续转录以及细胞在XYZ维度上的位置相对稳定。</li>
	<li>按照图2F所示，向细胞中加入200 µL步骤1.7中预先稀释的TA。 
	注意：添加TA时务必小心，避免触碰玻璃底培养皿或盖子，以防偏离已标记的XY位置。在DSB诱导后，确认细胞位于视野中心，且转录位点处于Z轴中心平面。重新调焦和位置更新应不超过1-2分钟。</li>
	<li>在采集窗口中点击开始，启动3D时间序列成像。</li>
	<li>将成像数据以显微镜控制软件的数据格式保存至显微镜控制计算机的硬盘中。</li>
</ol>
4. 数据分析
<ol>
	<li>在显微镜控制软件中打开成像数据，并以16位TIFF格式文件导出。</li>
	<li>使用StaQtool21软件打开导出的文件。选择Single Spot 3D模式，然后点击Go按钮加载图像文件。 
	注意：所选的时间序列将在Max Projection Timelapse Viewer中打开，显示第一个时间点z层堆栈的最大强度投影（图3A）。</li>
	<li>通过左侧的垂直MAX滑块调整图像强度显示。</li>
	<li>使用水平Timepoint 滑块选择要分析的时间点。</li>
	<li>将光标悬停在标记的转录位点位置，以进行手动标记；或使用Auto detect功能，若检测到多个对象，则点击相应的转录位点。</li>
	<li>使用Auto Track功能确定转录位点随时间变化的XYZ位置。 
	注意：如果某个位置未被正确追踪，请根据StaQtool软件手册手动选择转录位点。</li>
	<li>点击Auto按钮，对每个时间点执行高斯拟合，并测量总荧光强度（TFI）。 
	注意：如果转录活性停止，追踪工具将停留在最后一次检测到衍射极限对象（即标记的转录位点）的位置。如果转录位点标记消失后细胞在XY方向发生移动，则需要手动重新定位search square。</li>
	<li>完成每个时间点的TFI值拟合后，点击End timelapse按钮，关闭当前时间序列图像文件，并继续处理下一个文件。 
	&#8203;注意：TFI值将自动导出并保存至Excel文件中。</li>
</ol>
5. 显微镜校准测量与分析
<ol>
	<li>将种子细胞接种至35 mm玻璃底培养皿中，并按照第1节所述方法转染荧光标记的MS2和PP7衣壳蛋白。 
	注意：校准测量应使用引言中所述的相同报告基因细胞系。</li>
	<li>在开始显微镜图像采集前1小时，向细胞培养基中加入0.5 µg/mL的多西环素。</li>
	<li>将玻璃底培养皿安装至显微镜载物台培养箱内，并按此前步骤准备图像采集（参见第2节）。 
	注意：校准实验中不更换玻璃底培养皿的原始盖子。</li>
	<li>使用与第3.1点所述相同的激光强度和曝光设置。</li>
	<li>设定 捕获 2D时间序列设置（取消选中3D选项） 捕获类型 （面板）并以500 ms为间隔设置120个时间点 延时拍摄 面板（图 2C). 
	注意：此图像采集设置将导致在单个光学层面内以极短的时间间隔获取时间序列。</li>
	<li>从多个位置获取数十条校准时间序列，以生成数据集，用于计数数百个单转录本的 TFI 测量值。</li>
	<li>对于校准时间序列的分析，按照第4.1节将文件转换为16位TIFF格式文件。</li>
	<li>使用 StaQtool 打开导出的文件21 软件（图3）。按压 选择 LOG 文件 按钮，选择按照第4.2步所述获取的相应二维时间序列的日志文件。</li>
	<li>选择 多点二维 复选框并按下 GO 单击按钮将时间序列加载到分析软件中。</li>
	<li>在 延时成像查看器窗口 (图3A)，在PSF FWHM中，输入字段插入根据显微镜系统和物镜计算出的值，如所述21.</li>
	<li>要开始分析过程，请按下 自动检测 单击按钮以检测当前时间点显示的所有衍射极限物体，然后单击 AutoFit 进行高斯拟合以确定每个对象的 TFI 值（图3A).</li>
	<li>或者，将光标悬停在衍射极限物体上并单击以选中（出现白色方框内的绿色圆圈），然后按 高斯拟合 用于手动选择和高斯拟合过程的按钮。 
	注意：建议使用最后一种模式来排除未被计数的物体，例如在同一细胞核内含有多个新生转录本的明亮转录位点。</li>
	<li>按压 结束延时拍摄 单击按钮以完成上一步骤。 
	注意：结果将自动保存为与图像文件相同文件夹中的 Microsoft Excel 文件格式。</li>
	<li>开始 TFI 和 W 分布 通过按下相应按钮来选择多点模块（图3B).</li>
	<li>加载 Excel 文件 通过 的 添加文件 按钮，并点击“Go”按钮开始TFI分析。 
	注意：输出结果为通过对多个单转录本TFI值测量后确定的平均TFI值。</li>
	<li>在第5.10步中插入先前使用的PSF FWHM，然后开始W分析，并按下 开始 使用 Bin 的默认值按下按钮。 
	&#8203;注意：W 参数用于单转录本 TFI 测量的质量控制，以确保符合所用显微镜系统的点扩散函数（PSF）半高全宽（FWHM）的正确值。</li>
</ol>
6. 数据与校准合并
<ol>
	<li>将从第4.8步保存的Excel表格中获得的时间序列TFI值输入到一个新的Excel表格中，并将每个时间点的数值除以第5.15步获得的单个转录本的平均TFI值。 
	注意：为标准化此过程，使用了自定义准备的Excel模板表格。</li>
</ol>

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</ol>

作者无利益冲突需要披露。

复制、转录、DNA损伤与DNA修复等基本生物过程之间的冲突已被确认为基因组不稳定性的重要来源22。这些研究还发现了DNA损伤位点存在转录现象，并揭示了断裂诱导转录本在调控DNA损伤修复过程中的功能作用23。本文所述的新工具和实验方案可进一步研究RNA聚合酶II在DNA双链断裂（DSB）处的转录动态。该方案的一个关键环节是构建稳定细胞系，使报告基因以单拷贝形式整合入基因组。这一关键特征消除了多个拷贝报告基因在同一基因组位点整合所导致的转录噪声，从而能够获取转录动态的动能参数及单个RNA转录本的信息。要观察单个报告基因整合事件的转录，一个重要的技术前提是具备能够检测活细胞中通过MS2或PP7系统标记的单个RNA转录本的显微镜系统4,12。本研究中，活细胞显微成像采用安装在倒置显微镜上的共聚焦转盘系统，配备100 mW固态激光器，并通过声光可调滤波器耦合，具体配置见其他文献描述24。此外，为了利用报告系统研究单个DNA双链断裂位点的转录，必须对单个细胞进行精确监测，以实现最高时间分辨率，这需要对细胞进行数小时的连续成像，因此该方法通量较低。尽管如此，我们仍可通过压电驱动的显微镜载物台精确控制位置，实现多个细胞的并行观察。为确保活细胞长时间观察期间的最佳环境条件，显微镜主体（包括样品载物台）被置于一个有机玻璃环境培养舱内。此外，显微镜载物台上还安装了封闭式培养舱，并连接至CO2和湿度供给控制系统。
该实验方案的第一个关键步骤是选择用于成像的含细胞感兴趣区域。每个标记用于成像的XY位置必须包含一个或多个细胞，这些细胞需根据第1节、表1以及图2D、E中描述的报告基因和转染方案，显示出荧光RNA茎环结合蛋白的转染信号。此外，细胞必须表现出明亮的标记转录位点，且需共转染I-SceI-GR-iRFP713构建体，且该蛋白最初必须定位于细胞质中（图2D和E）。
细胞的荧光强度水平应足够低，以确保未结合的荧光标记MS2和/或PP7外壳蛋白的背景荧光不会干扰单个标记转录本的检测。同时，荧光标记的MS2和/或PP7外壳蛋白必须具有足够强的荧光强度，以便在至少60分钟内进行成像，且因部分光漂白导致的荧光损失较小。如第3.7节所述，使用固定范围的&#34;Scale image display&#34;功能，可依据荧光强度水平对细胞进行标准化筛选。
第二个关键的实验步骤是通过玻璃底培养皿盖上的预钻小孔，将处理剂（TA）添加到预先确定的XY位置的细胞中。任何对玻璃底培养皿的操作都可能导致细胞偏离已标记的XY位置，因此必须避免。因此，在向细胞生长培养基中加入稀释后的处理剂时，小心操作微量移液器对于成功观察预选细胞至关重要，如图2F所示。若采用其他系统在显微镜载物台上向细胞加药，例如灌流系统，则需要配备管路进出孔和泵或注射装置的独立载物台培养室。其他方法，如使用具有类似盖玻片底部表面的通道载玻片，会导致所加药物在通道内扩散缓慢，从而在加药与产生效应之间引入额外延迟。此外，若不慎从通道载玻片的开口处进行移液操作，也可能导致样本位置发生偏移。因此，本研究所采用的在玻璃底培养皿盖上定制钻孔的系统具有易于改装、成本低的优点，并适用于添加不同的培养基、药物及其他组分。小孔的直径较小，结合载物台培养室内的加湿环境，还可有效防止细胞培养基干燥。
该方案中的第三个关键步骤是数据分析，需要人工检查由于DSB诱导导致转录终止的时间点。转录终止的时间点表现为报告基因转录位点先前明亮的标记区域释放出最后的转录本。类似地，必须仔细检查断裂诱导的转录起始事件，以在单个荧光标记mRNA信噪比较低的情况下识别出独立的转录事件。
修复诱导的双链断裂（DSB）的动力学为使用这些报告基因所产生数据的分析增加了额外的复杂性，限制了研究仅能针对DSB诱导后最初的几分钟内进行。报告基因的转基因性质以及MS2和PP7茎环阵列富含重复序列的特点，可能形成独特的染色质结构，从而干扰假定的稳定断裂诱导转录程序的建立。尽管如此，与电离辐射或紫外照射相比，通过I-SceI介导在报告基因中诱导DSB是一种更为可靠的方法，可用于研究单个DSB位点的转录活动。
可以将具有或不具有人类基因组内额外识别位点的多种内切酶系统（如 I-CreI、I-PpoI 或 AsiSI）与当前的报告基因系统相结合，以可能更高效地产生DNA双链断裂（DSB）。然而，这些系统首先需要将内切酶识别位点引入报告基因中。其次，它们在单个细胞中诱导DSB的时间和效率方面可能存在类似的变异性。另一方面，插入内切酶识别位点的串联拷贝可能会提高DSB诱导的效率。此外，在不同细胞系中测试所介绍的报告基因系统，将有助于比较不同细胞背景下DSB位点的转录动态，以及不同DNA损伤修复通路的可用性，例如在癌细胞、原代细胞和终末分化的非增殖细胞中。然而，目前报告基因的构建需与Flp/FRT系统兼容，这限制了其在现有Flp/FRT宿主细胞系中的整合应用。
除了显微镜相关的应用外，目前的报告基因还可与生物化学检测方法（如染色质免疫沉淀）相结合，用于研究DNA修复因子或转录因子在单个DNA双链断裂位点的招募情况，或评估断裂位点周围的核小体占据、组蛋白修饰以及染色质状态。此外，将该系统与其他不同的报告系统联合使用，还可用于研究DNA损伤与基因组结构或DNA复制等生物学过程之间的功能联系。

DNA双链断裂（DSBs）是一类具有毒性的DNA损伤，会破坏细胞功能，并促进多种疾病的发生以及衰老过程1。DSB修复不准确所导致的突变会影响基因表达，并成为细胞功能衰退的基础。近年来的研究发现，DSBs可在损伤位点驱动de novo断裂诱导的转录2,3,4,5,6,7，这表明DSBs也可能通过断裂诱导产生的RNA影响细胞功能。多项近期研究表明，DSBs足以启动程序性转录（例如，在刺激可诱导基因处）和非计划性转录（例如，在非经典启动子区域）4,5,7。然而，尽管已有大量研究探索DNA损伤与转录之间的关联，该领域在对DNA断裂位点处转录事件进行精确（即单分子水平）表征方面仍存在不足。造成这一局限的一个重要原因在于缺乏合适的实验工具。细胞辐照（γ射线、X射线、重离子）和药物处理（如拓扑异构酶抑制剂或嵌入剂）缺乏空间精确性，且会诱导除DSBs以外的其他DNA损伤，包括单链断裂和DNA加合物8。内切核酸酶（如I-PpoI和AsiSI）虽可产生位点特异性的DSBs，但尚未与能够在单一位点以高时间分辨率同时实现活细胞中转录实时可视化的方法相结合8。为克服这一限制，我们实验室率先开发了一系列前沿报告系统，可在精确控制产生单一DSB后，以单分子分辨率直接可视化转录过程4。本文中，我们描述了这些报告系统，提供了在DSBs处进行活细胞转录成像的详细实验方案，并展示了揭示单个DSB处转录起始的数据。
本实验方案中使用的报告基因系统基于已充分表征的小鼠IgM报告基因，包含IgM µ重链膜结合型（µm）的M1和M2外显子9,10,11。两个外显子之间由一段杂合内含子隔开，其中含有强效的腺病毒主要晚期转录本（AdML）PY区段12。报告基因的表达由人巨细胞病毒启动子（CMV）驱动，该启动子中插入了两段串联的四环素操纵子（TetO）序列。每个报告基因均被插入含有Flp重组靶点（FRT）位点的质粒载体中，并进一步整合至HEK293宿主细胞基因组中的特异性FRT靶位点。该细胞系还组成型表达四环素阻遏蛋白，可通过四环素/多西环素的有无来调控报告基因的表达via。为了实现对报告基因转录过程的可视化，在报告基因的不同位置（相对于转录起始位点以及外显子/内含子结构）分别插入了24个串联重复的MS2茎环序列和24个串联重复的PP7茎环序列。MS2/PP7 RNA茎环在转录过程中形成，并可被外源表达的、分别标记有绿色和红色荧光蛋白的MS2/PP7外壳蛋白特异性结合，该策略此前已被广泛用于转录成像研究13,14,15。此外，在报告基因中还插入了一段18 bp的识别序列，供归巢核酸内切酶I-SceI识别，该识别序列直接位于RNA茎环阵列的两侧。所有质粒均采用标准克隆技术构建&#160;，其中PROP报告基因所含的I-SceI-24xMS2茎环片段由商业基因合成服务合成。
启动子近端DSB报告基因（PROP）通过在假定的转录起始位点下游45个碱基对（bp）处的外显子I中插入I-SceI切割位点构建，随后间隔149 bp至24×MS2茎环盒的起始位置；该MS2茎环盒为de novo设计，包含两个交替的非相同茎环序列16，以及额外的五个非重复的20 bp间隔序列以降低冗余性。MS2茎环阵列之后为72 bp序列，接着是1844 bp的内含子和1085 bp的外显子II，直至切割与多聚腺苷酸化位点。外显子II编码一种青色荧光蛋白（CFP），其与人过氧化物酶体酰基辅酶A氧化酶来源的C端过氧化物酶体靶向序列（PTS）融合，以实现对报告基因表达的独立筛选（图1A）。
外显子II DSB报告基因（EX2）包含一个167 bp的外显子I，其后为内含子和编码CFP-PTS的外显子II。在其下游169 bp处插入了一个含有24个MS2茎环结构的盒式序列，随后是一个84 bp的连接序列，其中心位置含有一个I-SceI位点，接着是24个PP7茎环结构，再延伸221 bp直至切割和多聚腺苷酸化位点17（图1B）。
最后，带有反义转录标记的外显子II双链断裂报告基因（EX2AS）基于人源泛素B（UBB）基因转录本UBB-201构建，包含两个外显子和一个内含子。外显子I全长1534 bp，其中反向插入了24×MS2茎环序列。因此，相对于CMV启动子驱动的报告基因正义方向转录，MS2茎环RNA序列将以反义方向转录。内含子长度为490 bp，其后是含有I-SceI位点的外显子II，并插入了一段编码两个同框泛素亚基的编码区。在UBB基因下游，存在一段在报告基因正义转录时可形成24×PP7茎环结构的序列（图1C）。
通过瞬时转染可诱导的归巢核酸内切酶I-SceI表达载体，可在每个报告基因中插入的识别位点处可控地产生DNA双链断裂（DSB）18。I-SceI核酸内切酶与糖皮质激素受体的配体结合域以及远红光荧光蛋白iRFP713进行同框融合。在未添加曲安奈德（triamcinolone acetonide, TA）时，该融合蛋白定位于细胞质；当向细胞培养基中加入TA后，蛋白迅速转入细胞核（图1D）。I-SceI系统诱导DSB的效率很高，已有研究证实18,19,20。同时，可通过可视化荧光标记的RNA茎环系统MS2和PP7来实时监测报告基因的转录情况。

<table><tbody><tr><td>100 mW 固态激光器</td><td>Coherent公司，美国加利福尼亚州圣克拉拉</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3i Marianas SDC 共聚焦旋转盘系统</td><td>Intelligent Imaging Innovations Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>气冷式EMCCD相机Evolve 512</td><td>Photometrics，图森，亚利桑那州，美国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer Z1 倒置显微镜</td><td>卡尔·蔡司显微成像公司，德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>杀稻瘟菌素</td><td>InvivoGen</td><td>ant-bl-1</td><td></td></tr><tr><td>活性炭处理的胎牛血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6765-500 ML</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 模块 S</td><td>PeCon GmbH，德国埃尔巴赫</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CSU-X1 共聚焦转盘成像系统</td><td>横河电机，日本东京</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>含HEPES不含酚红的DMEM</td><td>Gibco</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>多西环素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td>用于诱导报告基因表达；使用0.5 mg/ml的储存液，按1:1000比例稀释于细胞培养基中</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Flp-In T-REx 293 细胞系</td><td>赛默飞世尔科技公司英维特罗根</td><td>R75007</td><td></td></tr><tr><td>I-SceI-24x MS2 干环序列</td><td>GeneArt，赛默飞世尔科技</td><td></td><td>包含单个 I-SceI 识别序列和 24 个串联 MS2 发夹环序列的定制合成 DNA 片段</td></tr><tr><td>加热装置 湿度 2000</td><td>PeCon GmbH，德国埃尔巴赫</td><td></td><td></td></tr><tr><td>潮霉素B</td><td>罗氏</td><td>10843555001</td><td></td></tr><tr><td>浸油 Immersol 518 F</td><td>卡尔·蔡司显微成像公司（Carl Zeiss MicroImaging Inc.）</td><td>444960-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamin 3000 辅助试剂 P3000</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>L3000001</td><td>转染辅助试剂</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 试剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>L3000001</td><td>基于脂质的转染试剂</td></tr><tr><td>MatTek 35 mm 培养皿，玻璃底，No. 1.5</td><td>MatTek Corporation，美国马萨诸塞州阿什兰</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>显微镜培养箱</td><td>PeCon GmbH，德国埃尔巴赫</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pcDNA5/FRT/TO</td><td>赛默飞世尔科技公司旗下英杰公司</td><td>V652020</td><td></td></tr><tr><td>pOG44 质粒</td><td>赛默飞世尔科技公司英维特罗根</td><td>V600520</td><td></td></tr><tr><td>SlideBook 6.0 软件</td><td>Intelligent Imaging Innovations Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PeCon P-Set 2000 型载物台培养室</td><td>PeCon GmbH，德国埃尔巴赫</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StaQtool 软件</td><td>iMM-JLA 葡萄牙里斯本</td><td></td><td>可从以下网址获取：https://imm.medicina.ulisboa.pt/facility/bioimaging/lib/exe/fetch.php?media=STaQTool_setup.zip</td></tr><tr><td>曲安奈德（TA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6501</td><td>合成糖皮质激素；可诱导糖皮质激素受体从细胞质迁移至细胞核</td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA 溶液（TE）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>R001100</td><td></td></tr></tbody></table>

活细胞成像技术在dna双链断裂位点转录活性研究中的应用

Live-Cell Imaging of Transcriptional Activity at DNA Double-Strand Breaks

DNA双链断裂（DSB）是最严重的DNA损伤类型。尽管DSB对基因组完整性具有灾难性的影响，但迄今为止，DSB如何影响转录仍不清楚。造成这一状况的原因之一是缺乏合适的工具，无法以足够的时间和空间分辨率同时监测转录活动以及基因区域中DSB的诱导。本研究描述了一组新型报告系统，可在DNA模板中诱导DSB后立即在活细胞中直接可视化转录过程。该系统利用噬菌体RNA茎环结构，实现对转录的单分子灵敏度监测。为了将DSB靶向特定基因区域，报告基因被设计为包含一个归巢内切酶I-SceI的单一识别序列，该序列在人类基因组中原本不存在。每个报告基因的单拷贝被整合到人类细胞系的基因组中。该实验系统能够检测由经典基因转录或DNA断裂诱导的转录起始所产生的单个RNA分子。这些报告系统为解析转录与DNA损伤之间的相互作用提供了前所未有的机会，并有助于揭示DNA断裂诱导转录中此前未被重视的各个方面。

携带报告基因的细胞系（如图1A-C所示）可用于在活细胞中研究单个DNA双链断裂（DSB）处的转录动态。在图1A-C中每个报告基因示意图下方的数字表示以千碱基对（kbp）为单位的长度。CMV表示巨细胞病毒启动子，TetO表示四环素操纵序列，pA表示基因末端的3'切割和多聚腺苷酸化位点。CFP-PTS表示编码的与过氧化物酶体靶向信号融合的青色荧光蛋白，2UBB表示编码的人类泛素B串联单元。通过遵循上述实验方案和分析流程，可以获得随时间变化的荧光标记报告基因转录本数量的图表，时间分辨率为秒级，观测时间可持续数小时（图4A-D）。图4A中的图表显示了由新生转录本上累积的MS2-GFP分子所标记的PROM报告基因转录位点的TFI值随时间的变化过程。该图表代表未添加TA的对照实验，因此未诱导产生DNA双链断裂。在整个60分钟的观察期间，转录持续进行，呈现爆发式峰形，每次产生2-8个转录本。EX2和EX2-AS报告基因也获得了类似结果（此处未展示数据）4。通过使用I-SceI-GR-iRFP诱导报告基因中产生单个DNA双链断裂，可研究DSB对正在进行的报告基因转录的影响，并监测源自DSB位点的转录事件，即断裂诱导的转录（图4B-D）。
DNA断裂诱导的转录动态依赖于DSB在基因内的位置 
通过诱导产生单个 DSB I-SceI-GR-iRFP 报告基因中靠近启动子的区域 I-SceI 识别位点导致在TA加入后约11分钟报告基因的转录沉默，且在60分钟的观察期内转录未恢复（图4B）。在观察EX2报告基因转录时，加入TA约30分钟后，可检测到由经典启动子驱动的转录被完全抑制，同时MS2-GFP和PP7-RFP信号均完全消失。然而，在10分钟内转录即重新启动，表现为PP7-RFP荧光信号的重新出现。PP7-RFP信号的完全恢复（而非MS2-GFP荧光）表明发生了断裂诱导的转录起始图4C断裂诱导的转录在长时间内不稳定，表现为爆发式且峰值强度较低，表明仅有少量断裂诱导的转录本从DSB位点起始。
EX2AS 报告基因在其内含子 II 中 I-SceI 位点下游包含一个 24× PP7 发夹结构阵列，用于检测正义链转录。在添加 TA 后约 25 分钟内，可观察到由典型启动子驱动的转录在 EX2AS 报告基因内部终止。随后被反义链断裂诱导的转录所取代，这一点通过结合来自反义链 MS2 发夹结构序列 RNA 的 MS2-GFP 蛋白的积累得以证实（图 4D）。在 DSB 诱导导致正义链转录中断之前，未检测到反义链转录活性；本示例显示，在断裂发生后约 15 分钟内，已有多个转录本从断裂位点启动。此处获得的代表性数据表明，DSB 对转录的影响因其在基因内的位置不同而异，这与近期报道结果一致4。数据还揭示了由 I-SceI-GR-iRFP 诱导 DSB 的时间在细胞间存在变异性，其发生在添加 TA 后 12 至 30 分钟之间。此外，对单个转录本的检测使得研究人员能够发现细胞间以及不同断裂位点在断裂诱导转录活性强度上的差异。断裂诱导的转录仅在基因内部的 DSB 位点被检测到，而在启动子近端的 DSB 位点则未观察到该现象——在这些位点，典型的转录在 DSB 发生后即终止，并在整个后续观察期间不再恢复。
<img alt="基因编辑示意图；A-C 外显子-内含子模型；D 随时间变化的实验性TA结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62968/62968fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1报告基因及诱导DNA双链断裂的系统 （示意图A) 到 (C) 显示了用于研究DNA双链断裂诱导后转录的三个报告基因的结构。含有启动子近端的报告基因 I-SceI 第一个外显子中的位点（PROM），其下游被一段24倍MS2茎环（MS2-SL）序列阵列所包围，如图所示（A）。带有报告基因的 I-SceI 位于第二个外显子（EX2）的一个位点，其上游紧邻24个MS2茎环序列，下游紧邻24个PP7茎环（PP7-SL）阵列，如图所示（B）。带有报告基因的 I-SceI 位于外显子II的位点，在I-SceI位点上游反向插入了24×MS2茎环序列，用于检测反义链转录（EX2-AS），如图所示（C）。该功能的 I-SceI-GR-iRFP 融合蛋白构建体如图所示（D通过下方活细胞的图形显示及相应图像展示。在报告基因细胞系中瞬时表达该构建体（红色）后，蛋白 exclusively 定位于细胞质，从而防止了靶位点被过早切割 I-SceI 核酸内切酶。加入TA后，融合蛋白开始向细胞核内迁移（以虚线表示），并在5-15分钟之间开始积累。比例尺 = 10 µm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62968/62968fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="培养皿成像装置、软件界面、MS2-GFP 和 I-SceI-GR-iRFP 蛋白的荧光显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62968/62968fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：选择用于转录位点三维时间序列成像的细胞。 （A）中的照片显示了一个用于活细胞成像的 35 mm 玻璃底培养皿，配有定制改造的盖子，盖子上钻有一个直径为 3 mm 的孔，用于直接加入稀释在生长培养基中的 TA。孔的位置用红色圆圈标出。图（B）展示了显微镜控制软件中“Focus”窗口的截图，用于设置实时观察的曝光时间、滤光片设置、激光强度以及图像在屏幕上的显示比例，以筛选适合后续时间序列成像的细胞。图（C）为相应的“Capture”窗口截图，用于调整活细胞三维时间序列采集的所有参数。滤光片、采集类型、时间序列采集和三维采集面板的具体设置详见第 3 节。在此所示界面中，参数设置用于对转染了 MS2-GFP 和 I-SceI-GR-iRFP 构建体的 PROM 报告基因细胞系进行三维时间序列成像，以观察报告基因启动子近端区域诱导 DNA 双链断裂后的转录情况。图（D）为 GFP 和 iRFP 通道的合并图像，显示通过显微镜系统观察到的视野，其中包括多个 293-PROM 报告基因细胞系的细胞。这些细胞共转染了串联二聚体 MS2 衣壳蛋白构建体（融合有核定位序列，即两个绿色荧光蛋白 GFP-MS2CP）以及 I-SceI-GR-iRFP 构建体。多个细胞显示出 GFP-MS2CP 构建体的表达，从而标记出细胞核，而 I-SceI-GR-iRFP 构建体则标记出细胞质。虚线方框表示（E）中放大的区域。在进行三维时间序列成像时，根据讨论部分所述的要求选择细胞，例如（D）中放大区域内具有较大细胞核的细胞。该细胞同时转染了两种荧光构建体，并通过 GFP-MS2CP 在新转录的报告基因前体 mRNA 上的积累，显示出一个明亮标记的转录位点（箭头所示，左图）。细胞的生长培养基中不含 TA，因此 I-SceI-GR-iRFP 构建体仅定位于细胞质（右图）。图（F）显示将玻璃底培养皿安装在显微镜载物台的培养箱中，用于进行三维时间序列成像实验，并配备带有 TA 加样孔的定制盖子。将 200 µL 移液枪头小心插入孔中，将稀释的 TA 加入细胞的生长培养基中。比例尺 = 10 µm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62968/62968fig2v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜分析、高斯拟合图、数据分布图、斑点追踪。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62968/62968fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：图像采集与分析软件。（A）面板展示了STaQTool（斑点追踪与定量工具）的截图。图像显示了PROM报告基因细胞系的一个时间序列示例，其中在中央的最大强度投影图中，转录位点以绿色圆圈/白色方框标出。右侧窗口展示了所选转录位点斑点的放大视图、当前时间点对应的带阴影的三维强度曲面图以及二维高斯拟合网格，同时还显示了转录位点斑点在z轴堆栈中的Z位置、高斯拟合宽度（W）以及随时间变化的转录荧光强度（TFI）测量结果。显微图像（B）展示了转染了MS2-GFP的PROM报告基因细胞系细胞核的一个放大的单个光学切面。该图像代表了一个包含120个时间点的二维校准时间序列中的一个时间点。细胞核中可见多个荧光标记的转录本，表现为核质中受衍射极限限制的物体（以白色方框标出）。右侧面板展示了STaQTool中的TFI与W分布工具截图，用于分析二维延时采集中的多个斑点。在此示例分析中，该工具检测到408个衍射极限斑点，代表由MS2-GFP标记并在核质中扩散的报告基因转录本。右侧的图表显示了这些物体的TFI和高斯拟合宽度分布直方图及相应的高斯拟合曲线。TFI和W的平均值由高斯拟合曲线中心峰的位置得出，并显示了相应的置信区间。比例尺 = 10 µm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62968/62968fig3v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="基因表达图谱；MS2-GFP，PP7-RFP；转录本数量 vs. 时间；TA 添加的影响。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62968/62968fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：DNA 双链断裂位点转录检测的代表性结果。 图（A）至（D）展示了单个转录位点随时间变化的校准后 TFI 曲线。TFI 值通过校准实验中测得的相应报告基因构建体及实验所用的荧光标记 RNA 发夹结构结合蛋白 MS2 或 PP7 的单个转录本平均 TFI 转换为转录本数量。在（A）中，显示的是未添加 TA 的 PROM 报告基因对照实验的曲线图，其中被 MS2-GFP 标记的转录本表明在整个观察期间持续存在转录活性。图（B）显示了添加 TA 并诱导产生 DSB 后 PROM 报告基因的转录情况，结果表现为在后续整个观察时间内转录受到抑制。图（C）中的 EX2 报告基因曲线显示，在添加 TA 后，由经典启动子驱动的转录被抑制；而在同一时间序列的后期，仅出现由 PP7-RFP 标记的转录活性。图（D）中的 EX2-AS 报告基因在添加 TA 后，其正向转录（即经典启动子驱动的正义方向转录）的抑制情况与图（C）中的 EX2 报告基因相似；然而，源自反向插入的 MS2 发夹序列并由 MS2-RFP 标记的转录本的出现，表明在 TA 添加后出现了正义转录活性消失前并不存在的反义转录。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62968/62968fig4v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>报告细胞系</td>
			<td>EX2 和 EX2-AS</td>
			<td>PROM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">转染用质粒</td>
			<td>1.5 µg pI-SceI-GR-iRFP</td>
			<td>1.5 µg pI-SceI-GR-iRFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.65 µg pUBC-mCherry-nls-tdPP7-mCherry</td>
			<td>0.5 µg pUBC-GFP-nls-tdMS2-GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.35 µg pUBC-GFP-nls-tdMS2-GFP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：报告基因细胞系的转染。 该表格描述了用于瞬时转染不同报告基因细胞系的转染方案及所用各种质粒的用量。

本方案介绍了一种新的报告基因系统及实验装置，可用于在单分子灵敏度水平下检测DNA双链断裂处的转录活动。

活细胞成像技术在DNA双链断裂位点转录活性研究中的应用

DNA双链断裂（DSB）是最严重的DNA损伤类型。尽管其对基因组完整性具有灾难性的影响，但迄今为止仍...

本方案可用于观察和检测转录事件，并揭示DNA双链断裂对基因正在进行的转录过程的影响。该技术的主要优势在于，能够在单个细胞中以秒级时间间隔、持续一小时或更长时间地观察单独标记的RNA转录本。该方法有助于深入研究DNA损伤应答，探究转录与DNA复制、DNA损伤等细胞过程之间的相互作用。我们的建议是使用强力霉素观察细胞，并进行校准测量，以训练对转录位点和标记RNA分子的检测。在1.5毫升的微量离心管中，配制溶液A，其中包含150微升低血清MEM培养基、质粒DNA（终浓度为2.5微克/微升）以及转染辅助试剂。同时，配制溶液B，其中包含150微升低血清MEM培养基和1.5微克/微升DNA的脂质体转染试剂。将两种溶液在室温下孵育5分钟，然后将溶液A轻轻加入溶液B中，并在室温下继续孵育20分钟。进行细胞转染时，将300微升混合后的溶液A和溶液B逐滴加入每皿中，并轻轻混匀。将玻璃底培养皿置于100毫米标准细胞培养皿内，在37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润环境中孵育。准备一个1.5毫升微量离心管，加入200微升含HEPES但不含酚红的DMEM培养基，并添加10%活性炭处理过的胎牛血清，然后加入TA。在开始显微镜观察前约一小时，通过向生长培养基中加入多西环素以诱导报告基因的转录，并用200微升移液器轻轻吹打混匀。在开始观察前至少30分钟将细胞转移至显微镜处，并将含有细胞的100毫米培养皿放入预热的大型显微镜培养箱中。将装有预先稀释TA的微量离心管放入大型显微镜环境培养箱内，使其升温至37摄氏度。将玻璃底培养皿的盖子更换为带有直径三毫米钻孔的盖子。在显微镜控制面板中选择100倍油镜物镜，并在物镜上滴加一滴浸油。将装有细胞的玻璃底培养皿放入显微镜载物台培养箱中并固定到位，然后关闭载物台培养箱的盖子以及显微镜外壳的所有门。启动显微镜操作与控制软件，打开焦距控制窗口并单击显微镜窗格。在发射光选择窗格中，单击“100%eye”复选框，以设置目镜光路，实现通过眼睛直接观察样本。在滤光片组菜单中，切换至目视滤光片组，选择明场（Brightfield），然后按下打开明场按钮。将显微镜物镜移向玻底培养皿，直至油浸接触到玻璃表面。通过目镜观察，手动对细胞所在平面进行聚焦，然后关闭明场光源按钮。在开始实验观察前，让细胞静置30分钟，以使其适应环境条件，并防止因温度梯度导致成像过程中出现焦平面漂移。在室温下准备好200微升微量移液器和200微升滤芯吸头。在显微镜控制软件的焦距控制窗口中，将激光强度设置为5%，曝光时间设置为50毫秒。打开采集窗口，调整设置以执行三维时间序列的自动图像采集。选择3D捕获采集类型，并设置12到16个光学切片，切片间距为0.4微米。勾选“围绕当前位置范围”和“采集后返回当前位置”的复选框。在时间序列采集面板中，输入时间点数量为120，时间间隔为30秒。根据文稿中提到的被截断的荧光蛋白标签，选择相应的共聚焦滤光片组，并将每个通道的曝光时间设置为 50 毫秒。在激光功率设置中使用当前设定，于聚焦窗口中选择 5% 的激光强度。在焦点控制窗口中，进入相机面板，选择“缩放图像显示控制”，然后选择“手动”按钮，以设定固定的图像强度显示范围。选择在DNA双链断裂诱导后用于转录位点三维延时成像的细胞。对细胞进行筛选，并根据文中讨论部分所述条件选取三个视野。将此前已定位在视野中心的选定细胞进行聚焦，使转录位点位于Z轴堆栈的中位平面。通过点击“设置点”在聚焦控制窗口的XY平面中标记每个XYZ位置。向细胞中加入200 µL预稀释的TA，并通过点击采集窗口中的“开始”启动3D时间序列成像。将成像数据以显微镜控制软件的数据格式保存至显微镜控制计算机的硬盘中。在开始显微镜图像采集前一小时，向细胞培养基中加入终浓度为 0.5 微克/毫升的多西环素。将玻璃底培养皿安装至显微镜载物台培养箱内，并按照此前演示的方法设置图像采集参数。激光强度和曝光时间设置与之前相同。在延时成像采集面板中设置2D时间序列的采集参数，以500毫秒为间隔采集120个时间点。从多个位置采集数十个校准时间序列，以生成包含数百个单转录本TFI测量值的数据集。采用本方案可获得一条图表，显示荧光标记报告基因转录本数量随时间的变化，时间分辨率达秒级，观测时长可持续数小时。此处展示了通过新生转录本上积累的绿色荧光蛋白标记的MS2衣壳蛋白标记的PROM报告基因转录位点的TFI值随时间变化的过程。在报告基因中诱导产生单个DNA双链断裂（DSB），可研究其对正在进行的报告基因转录的影响，并监测源自DSB位点的转录事件，即断裂诱导的转录。加入TA并诱导DSB后，PROM报告基因的转录在约11分钟后受到抑制，且在60分钟内未恢复。PP7-RFP 信号的完全恢复表明发生了断裂诱导的转录起始。EXON 2 反义报告基因显示了由启动子驱动的转录终止，随后被反义链断裂诱导的转录所取代，这一点通过携带红色荧光蛋白标记的 MS2 衣壳蛋白在反义 MS2 发夹结构序列转录生成的 RNA 上的累积得以揭示。在成像前对细胞进行筛选，并设置处理后的延时成像，针对每个 XY 位置，将标记的转录位点的 Z 位置调整至待采集的 Z 轴层扫图像的中心位置。最后，必须极其小心地将稀释于生长培养基中的TA加入，以防止预先选定的待成像细胞位置发生任何偏移。在活细胞中对单个RNA转录本进行三维随时间成像，可用于研究DNA复制过程中的RNA转录，或细胞周期进程中转录的变化。

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科研

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Biology

生物学

DNA双链断裂时转录活性的活细胞成像

哺乳动物细胞中DNA双链断裂（DSB）修复的分析

本实验方案描述了一种用于可视化DNA损伤应答中被激活的DNA双链断裂信号蛋白及其在有丝分裂过程中定位的方法。...

活细胞中DNA损伤应答蛋白的二维与三维实时成像

在本视频中，我们介绍了免疫荧光显微技术，用于检测定位于人单个核细胞DNA双链断裂位点的特定DNA损伤应答蛋白。这些蛋白可被特异性的一抗识别，一抗进而结合带有荧光染料标记的二抗；在显微镜观察时，二抗发出荧光，从而使得细胞核内这些蛋白呈现为清晰可辨的荧光焦点，实现可视化观察。...

用于分析DNA双链断裂的免疫荧光显微镜技术

共聚焦荧光显微镜与激光显微照射技术可用于在细胞核内特定区域诱导DNA损伤，并监测DNA修复蛋白的响应。该技术极大地推动了我们对损伤识别、信号传导及蛋白募集过程的理解。本文展示了如何利用这些技术研究单链和双链断裂的修复过程。...

激光微照射技术在哺乳动物细胞单链与双链断裂修复研究中的应用

研究DNA损伤修复动力学需要一种能够在细胞核内特定区域诱导损伤的系统。本文介绍一种利用配备405...

利用405 nm激光显微照射技术研究蛋白质向DNA损伤位点的招募

双链DNA断裂的修复是一个动态过程，不仅需要在断裂位点形成修复复合物，还要求在损伤被处理后对这些复合物进行解聚。本文中，我们采用免疫荧光显微技术，针对瞬时性和持久性双链断裂，作为解析基因组维持机制的工具。...

通过免疫荧光显微镜表征瞬时性和持久性DNA双链断裂中的DNA修复过程

DNA损伤后，人类细胞会激活重要的修复通路，以恢复基因组的完整性。本文描述了间接免疫荧光方法，用于检测DNA修复蛋白，分析其在时空上的招募动态，并有助于研究DNA损伤位点处的蛋白质-蛋白质相互作用。...

通过免疫荧光技术观察DNA修复蛋白的相互作用

本文介绍了免疫染色和染色质免疫沉淀的关键步骤。这些实验方案常用于研究与DNA损伤相关的细胞过程，并用于可视化及定量分析参与DNA修复的蛋白质的募集情况。...

可视化与定量内切酶介导的位点特异性DNA损伤

在本实验方案中，我们演示了如何利用基于免疫荧光的方法，在细胞周期的 S/G2 期可视化 DNA...

利用BrdU-DNA标记联合细胞周期区分成像评估全基因组DNA双链断裂末端切除

以下实验方案介绍了通过细胞周期同步化后进行RPA2免疫荧光染色，以检测细胞周期G1期中单链DNA焦点的方法。...

可视化细胞周期G1期中的单链DNA焦点

我们介绍了利用基于发光的染色体外报告底物体系来评估细胞中双链断裂修复通路功能完整性的实验方案。...

基于高通量定量发光报告系统的DNA双链断裂修复活性评估

学习利用荧光显微镜和报告基因系统对活细胞中DNA双链断裂位点的转录活性进行单分子水平成像的技术。该方法可实时追踪转录动态，为研究DNA损伤应答机制提供重要工具。

活细胞成像技术在DNA双链断裂位点转录活性研究中的应用

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