Name: 全卵巢免疫荧光、清除和多光子显微镜用于小鼠发育中卵巢储备的定量3D分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-03T14:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 36 s
Description: 了解全卵巢免疫荧光染色与多光子显微镜技术在小鼠卵巢储备定量3D分析中的应用。该方法通过透明化处理实现高通量生殖细胞计数，为生殖生物学和毒理学研究提供可靠工具。

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本工作得到了美国国立卫生研究院基金（R01 HD093778 资助 E.B-F，T32 HD007065 资助 R.B）的支持。我们感谢 Zachary Boucher 在辐射实验中的协助。我们感谢 Mary Ann Handel 对稿件的审阅。我们衷心感谢 Sonia Erattupuzha 以及杰克逊实验室显微成像核心服务中心在本出版物所述显微成像工作中提供的专业协助，同时感谢杰克逊实验室科学仪器服务中心的 Jarek Trapszo 为设计3D打印适配器载玻片所做的贡献。

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本文介绍了一种针对产前和产后卵巢组织的详细三维免疫染色与成像方案，适用于高通量及比较性研究，可用于生殖细胞定量分析和蛋白质定位。我们开发该方案旨在分析10至16个不同品系小鼠在6个发育时间点（每组N=6-12）卵巢中的卵母细胞数量，通常每次处理2至4块24孔板。该方法可适用于其他器官或细胞标记物的研究。例如，通过选用适当的抗体，本方案可用于标记和可视化卵巢中的体细胞（如颗粒细胞），从而促进对体细胞-生殖细胞相互作用或其他卵巢细胞类型发育的研究。
该方案及抗体组合的一个局限性在于无法明确鉴定不同的卵泡发育阶段。在免疫荧光和二维成像中，通常利用DNA染料通过颗粒细胞核的层数来识别卵泡阶段，但这种方法在三维成像中效果不足。4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）或Hoechst染料由于光穿透能力有限且在大块组织内部信号衰减，很少用于全器官染色。碘化丙啶（PI）是一种小分子染料，能够深入组织内部，但由于其光谱与其他荧光信号重叠，在多光子成像系统中难以捕获。通过添加针对颗粒细胞的特异性标记物（如抗苗勒管激素（AMH）或FOXL247...

大多数哺乳动物的雌性个体出生时携带有限数量的处于减数分裂阻滞状态的卵母细胞，这些卵母细胞储存在原始卵泡中，构成了卵巢储备（OR）1,2。卵巢储备决定了雌性整体的生殖寿命和生殖健康3。卵巢储备的规模通常会随着年龄增长而自然减少，并可能因暴露于某些基因毒性物质（如辐射/化疗）或环境应激（如营养不良）而提前耗竭，从而导致不孕4,5,6。特发性女性不孕往往与来自卵巢储备的卵子在发育过程中的遗传和生理质量有关，但其机制仍不甚清楚7,8。由于雌性个体的卵泡储备在出生时已基本确定，因此深入理解卵巢储备建立与维持过程中的调控机制至关重要。
在小鼠中，卵泡（OR）的形成始于胚胎第（E）7.5天左右原始生殖细胞（PGCs）的特化2。PGCs迁移至生殖嵴，并于约E10.5时定植于此9。随后发生广泛的增殖，但由于胞质分裂不完全，形成囊状结构，这些结构将在后续发育过程中被分解10,11。约在E12.5时，性腺性别被确定，卵巢中的PGC增殖停止。在雌性个体中，PGCs此时已转变为卵母细胞，并于约E13.5进入减数分裂前期I（MPI）12,13。&#160;卵母细胞经历漫长的MPI后，在出生前后停滞于网状期（dictyate stage）。出生后的第一周内，每个停滞的卵母细胞被颗粒细胞包裹，从而形成原始卵泡。
雌性个体卵巢中原始卵泡的数量，取决于在减数分裂前期 I（MPI）阻滞之前和期间，通过凋亡、自噬或坏死等机制得以存活的卵母细胞数量14,15。第一波卵母细胞淘汰发生在胎儿发育阶段，称为胎儿期卵母细胞凋亡（FOA）。FOA 是雌性个体中一种进化上保守的过程（包括哺乳类和非哺乳类动物），根据物种不同，大约有 50–80% 的卵母细胞在此过程中被淘汰16,17,18,19。在小鼠中，FOA 发生于胚胎期 15.5 天至 18.5 天（E15.5–E18.5），其发生与逆转录转座子 LINE-1 序列的重新激活和表达导致卵母细胞死亡有关20,21。第二波卵母细胞淘汰通过减数分裂检查点实现，清除具有减数分裂缺陷的卵母细胞，例如未修复的 DNA 双链断裂（DSBs）22,23。随后的第三波卵母细胞淘汰发生在卵泡细胞簇解体过程中，并在原始卵泡形成时达到高峰，每个原始卵泡包含一个卵母细胞10,11,24,25。
在小鼠中，原始卵泡储备主要在青春期前建立，此后随着原始卵泡在正常的生殖周期中被激活并开始生长而逐渐减少。不同女性个体以及不同遗传品系的小鼠之间，卵巢储备（OR）的大小存在差异；然而，OR大小的遗传调控机制尚未被充分阐明26,27,28,29。由于缺乏标准化的研究方案来分析产前和产后发育过程中卵母细胞消除的波动规律，OR调控的遗传学研究受到限制。目前已在小鼠中建立了多种卵母细胞定量方法，其中最常见且应用最广泛的是对组织切片进行组织形态计量学评估30,31。该技术通过连续切片并使用组织学染色（如苏木精和伊红（H&amp;#38;E）、过碘酸-雪夫染色（PAS））或荧光标记物来识别卵母细胞。如果所有实验条件保持一致，包括切片厚度、卵巢全组织切片的完整回收以及各实验室采用的计数方案，则该方法具有较高的可靠性。然而，不同实验室报告的数据常存在显著差异，因而难以进行直接比较。
此外，由于遗传差异，使用不同的小鼠品系也可能影响卵母细胞计数。目前已开发出其他计算方法用于组织形态计量学评估，包括采用分样法自动检测卵母细胞、利用计算算法进行自动计数，以及对组织学图像进行三维重建以避免对同一卵母细胞重复计数31,32,33,34,35,36。尽管这些改进已被引入组织形态计量学评估，但该技术仍相对耗时费力，尤其在大规模和高通量研究中更为明显。由于计数方案、计算算法及所用软件的不同，不同研究之间收集的数据可能缺乏可重复性和可比性。
近年来，随着中等分辨率多光子显微镜、光片显微镜以及光学组织透明化技术的发展，对完整卵巢进行三维建模与分析的技术正逐渐成为高效定量卵母细胞数量、研究蛋白质定位与动态变化的首选方法37,38。与传统的组织学方法相比，这些三维分析方法通常具有优势，因为组织和器官在处理过程中能得到更好的保存并维持其完整性。此外，三维分析与建模能够提供有关器官内细胞微环境或亚结构之间及内部功能与相互作用的额外信息，而这些信息在二维分析中可能被遗漏。
对完整器官进行三维分析需要针对特定器官（如卵巢）优化固定、免疫染色和光学透明化方案，同时避免组织变形或损伤。为实现高分辨率显微成像，还需进一步优化样本的装载方式，且该优化可能取决于可用的成像平台。最后，对完整卵巢进行成像将产生大量数据，需进行后续的计算分析。因此，有必要开发标准化的三维方法，用于卵母细胞计数，以支持不同研究间的比较以及跨发育阶段的分析。
本方案采用标准免疫染色和既往报道的组织透明化方法，重点在于一种简单、用户友好且高通量的操作流程38,39,40,41。该方案经过优化，可用于分析大量产前及出生后至出生后第28天（P28）的卵巢，并适用于来自不同小鼠遗传背景、大小各异的卵巢。所有发育阶段的免疫染色步骤基本相似；然而，由于青春期卵巢体积较大，其透明化处理方案有所不同：小卵巢采用ScaleS4(0)，大卵巢则使用CUBIC40,41。此外，在对P28小鼠进行固定前，需先实施全身体灌注，以避免血细胞自发荧光的干扰。本研究选用基于Leica DIVE/4Tune平台构建的多光子显微镜作为光片显微镜的替代方案进行成像，并采用配备多种分析工具的IMARIS三维可视化与分析软件进行图像处理。本方案操作简便，所需人工干预较少，因而节省时间。此外，卵母细胞定量分析相对快速，具体耗时取决于卵巢大小及卵母细胞的排列情况。

<table><tbody><tr><td>台式培养箱</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H2200-H</td><td>37 &amp;deg;C 培养箱</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>VWR</td><td>97061-416</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>杰克逊实验室（The Jackson Laboratory）</td><td>000664</td><td>近交系小鼠品系</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1435</td><td>危险物质</td></tr><tr><td>D-山梨醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6021</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>FastWells 试剂屏障</td><td>GraceBio</td><td>664113</td><td>具有粘性且柔韧的硅胶垫圈（粘附式微孔）</td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>FST</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP381-500</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔 IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21246</td><td>稀释比例 1:1000</td></tr><tr><td>山羊抗大鼠 IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A-21434</td><td>稀释比例 1:1000</td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>IMARIS 软件</td><td>Oxford Instruments</td><td>版本 9.7.0</td><td>图像可视化与分析软件</td></tr><tr><td>Insight X3</td><td>Spectra-Physics</td><td>InSight&amp;nbsp;X3 可调超快激光器</td><td>多光子成像用激光器</td></tr><tr><td>LASX 软件</td><td>Leica</td><td>版本 3.5.6</td><td>图像采集软件</td></tr><tr><td>Leica DIVE/4TUNE/FALCON</td><td>Leica</td><td>Leica Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406</td><td>多光子显微镜</td></tr><tr><td>MaiTai HP</td><td>Spectra-Physics</td><td>Mai Tai DeepSee 一体式超快激光器</td><td>多光子成像用激光器</td></tr><tr><td>Masterflex 泵控制器</td><td>SPW Industrial</td><td>型号：7553-50</td><td>灌注用蠕动泵</td></tr><tr><td>梅奥剪刀</td><td>FST</td><td>14010-17</td><td>5&amp;rdquo; &amp;ndash;7&amp;rdquo; 钝头/钝头剪刀，用于断头术</td></tr><tr><td>方形显微盖玻片，No. 1.5，25×25 mm</td><td>VWR</td><td>48366-249</td><td></td></tr><tr><td>Mini BioMixer</td><td>Benchmark Scientific</td><td>B3D1020</td><td>适用于 37 &amp;deg;C 培养箱的摇床/振荡器</td></tr><tr><td>Nikon 人体工学立体显微镜 SMZ1270</td><td>Leica</td><td>&amp;nbsp;SMZ1270</td><td>体视显微镜</td></tr><tr><td>16% 多聚甲醛（甲醛水溶液）</td><td>电子显微技术科学公司（Electron Microscopy Sciences）</td><td>15710</td><td>危险物质</td></tr><tr><td>PBS 片剂，磷酸盐缓冲液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP2944100</td><td>溶于 Milli-Q 水</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素，200 倍浓度，双抗溶液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ICN1670249</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯醇（PVA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>Quadrol（N,N,N&amp;prime;,N&amp;prime;-四(2-羟丙基)乙二胺）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>122262</td><td></td></tr><tr><td>兔抗 DDX4/MVH 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab27591</td><td>稀释比例 1:500</td></tr><tr><td>兔抗 LINE-1 ORF1p 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab216324</td><td>稀释比例 1:500</td></tr><tr><td>大鼠抗 TRA98/GCNA 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab82527</td><td>稀释比例 1:500</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>危险物质</td></tr><tr><td>硼氢化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>452882</td><td>危险物质</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Tekmar 轨道摇床</td><td>Bimedis</td><td>VXR-S10</td><td>室温用摇床</td></tr><tr><td>三乙醇胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90279</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>UNOLOK 灌注套装</td><td>MYCO Medical</td><td>7001-23</td><td>灌注用针头</td></tr><tr><td>尿素</td><td>Amresco</td><td>97061-920</td><td></td></tr><tr><td>X-Cite 120LED</td><td>Excelitas</td><td>序列号 XT640-W-0147</td><td>低功率 LED 荧光灯</td></tr></tbody></table>

小鼠卵巢储备发育过程中全卵巢免疫荧光、透明化及多光子显微镜定量三维分析

Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

女性生育力和生殖寿命取决于卵巢卵母细胞储备的质量和数量。据估计，在胎儿期卵母细胞减少（FOA）过程以及出生后第一周内，约有80%进入减数分裂前期I的女性生殖细胞被清除。在发育过程中，有三种主要机制调控存活卵母细胞的数量，并最终建立青春期女性的卵巢储备。第一波卵母细胞丢失发生在早期FOA阶段，此时30%至50%的卵母细胞因长散布核元件-1（LINE-1）高表达而被清除。第二波丢失是通过减数分裂质量监控点清除具有减数分裂缺陷的卵母细胞。第三波丢失发生于围产期原始卵泡形成阶段，部分卵母细胞因未能成功形成卵泡而被淘汰。目前尚不清楚这三波卵母细胞丢失各自受何种机制调控，以及它们如何在小鼠和人类中共同塑造卵巢储备。
免疫荧光与三维可视化技术为在完整卵巢的背景下而非信息量较少的二维切片中成像和分析卵母细胞发育开辟了新途径。本文提供了一套完整的全卵巢免疫染色与光学透明化操作方案，所得样品可用于多光子显微镜成像以及利用商业软件进行三维建模。该方法可用于展示C57BL/6J小鼠卵巢发育过程中卵母细胞损耗的动态变化，并量化卵母细胞在三个消除波次中的丢失情况。本方案适用于产前及出生后早期卵巢的卵母细胞可视化与定量分析，也可用于其他定量研究。尤为重要的是，该方案经过战略性设计，可实现高通量、可靠且可重复的处理，满足生殖毒理学、临床诊断以及卵巢功能基因组学检测的需求。

通过全卵巢的免疫染色与成像，可利用相同的技术和标记物对不同发育阶段的卵母细胞或卵巢中的蛋白表达进行可视化与定量分析（图3）。本方案最初为一项大规模研究项目开发，该项目需要对多种发育阶段及多个小鼠品系的卵巢进行分析。本文展示了针对C57BL6/J品系所获得的数据，该品系是遗传学分析中的标准品系。本研究所介绍的技术操作简便，可在14–19天内获得结果（图2D），并适用于产前、青春期前及青春期雌性个体的卵巢分析（图1 和 图2A、B）。
该方法被用于研究在卵巢卵母细胞储备自然形成过程中发生的卵母细胞丢失的动态变化。在包括小鼠在内的许多生物中，卵母细胞数量被认为在胚胎期进入减数分裂时（约E13.5）达到峰值。随后，由于尚不完全明确的胎儿期卵母细胞减少过程（fetal oocyte attrition, FOA）（约E15...

本文介绍了一种优化的完整卵巢成像方案，可用于通过整体免疫染色、多光子显微镜以及三维可视化与分析进行定性和定量研究。该方案适用于高通量、可靠且可重复的操作，可用于卵巢功能的毒理学、临床诊断及基因组学检测。

女性生育力和生殖寿命取决于卵巢卵母细胞储备的质量和数量。据估计，女性生殖细胞的约80%……

该方法有助于回答生殖领域中的一个关键问题，即基因调控过程如何以及何时影响卵巢储备的大小，而我们知道卵巢储备会影响雌性的生殖寿命。本方案可适用于利用相同技术对不同发育阶段的完整卵巢进行大规模研究。通过高效定量生殖细胞，该方法可产生可靠的数据。将该方法应用于同一物种但遗传背景多样的动物，可深入了解直接调控生殖细胞及卵巢发育以及其他发育器官的遗传因素。演示该操作的是来自我实验室的研究实习生Nathaniel Boechat。首先进行灌注步骤：将麻醉后的青春期雌性小鼠仰卧位固定，用大头针轻轻穿过其足垫，将四肢在放松状态下固定于解剖板上。为打开小鼠胸腔，需小心剪开肩胛骨下方胸骨两侧的肋骨，注意避免刺破肺部。用镊子夹住皮肤或肋骨瓣，并将其固定，以暴露内部器官。使用解剖剪剪开心脏右心房，使血液从循环系统中流出。随后，用镊子夹住心脏，将灌注针插入左心室，并以轻柔且恒定的压力泵入10 mL PBS。当肝脏、肾脏和生殖道等组织由粉红色变为白色时，将 PBS 替换为新配制的 1% 多聚甲醛（PFA），并继续灌注约 10 毫升 PFA。接下来，找到位于肾脏下方的卵巢脂肪垫，小心分离整个生殖道，包括脂肪垫、卵巢和子宫角，并将其置于含有 4% PFA 的小瓶中。在室温下固定卵巢 16 至 24 小时，然后将 4% PFA 替换为 70% 乙醇。染色当天，在进行免疫染色前先对卵巢组织进行修剪。免疫染色方案的第一天，在洁净的24孔板中，向所需数量的孔内每孔加入1毫升PBS。剪掉1000微升移液枪头的尖端以形成宽口，使用该宽口枪头将青春期卵巢组织从盛有70%乙醇的小瓶中轻柔转移至各孔中，随后用0.8毫升新鲜PBS替换孔中的原有液体。次日，吸除各孔中的PBS，并每孔加入0.8毫升通透缓冲液。将培养板在室温下于摇床上孵育四小时后，用封闭缓冲液替换透化缓冲液。第三天，在封闭缓冲液中稀释制备一抗。为观察卵母细胞，使用卵母细胞标记物对产前及青春期前卵巢进行孵育。第八天，用新鲜洗涤缓冲液洗涤样品两小时，然后将洗涤缓冲液替换为0.5毫升用封闭缓冲液稀释的二抗混合液。用封口膜密封培养板以防止蒸发，并将样品在室温下避光孵育三天。免疫染色洗涤后的第11天，吸去洗涤缓冲液，加入0.8毫升的Scale Cubic One溶液，在37°C避光条件下孵育三天，每天更换一次Scale Cubic One溶液。第15天，在室温下用0.8毫升PBS轻轻振荡洗涤样品三次，每次10分钟。然后将PBS更换为0.8毫升新配制的脱气20%蔗糖PBS溶液，室温下轻轻振荡。一小时后，更换20%蔗糖溶液，并加入0.8毫升SCALE Cubic-2溶液处理样品，持续四至五天，具体操作如前所述。为准备样品，使用剪去尖端的200微升移液枪头，将青春期卵巢连同15至20微升Scale Cubic Two透明化溶液转移至粘附孔的中央。将卵巢转移至单个孔中后，加入一滴透明化溶液，轻轻将盖玻片置于粘附孔上，并按压以形成密封结构，使样品和透明化溶液夹在两张盖玻片之间。用于成像时，将此盖玻片夹心结构放入3D打印的显微镜适配载玻片中。根据显微成像核心设施或制造商的规格设置图像采集参数。如果条件允许，使用双向图像采集以减少扫描时间并提高效率。在软件中调整线平均、帧平均和帧累积参数。通过确定起始和终止位置来设置Z轴步进，然后为青春期前卵巢选择2微米的Z步进大小，为青春期卵巢选择5微米的Z步进大小。接下来，启用Z轴补偿功能和激发增益。通过分别为样品底部和顶部选择激光强度，来设置底部和顶部的Z轴补偿。对于无法在单个视野中完整成像的较大样本，请使用拼接成像模式。激活图像导航器，并使用矩形标记工具标定覆盖整个样本所需的图像块数量。设置完成后，通过导航器开始多图像块的图像采集，以获取所有图像块。图像采集完成后，保存所有图像。如果采集了多个图块，则运行拼接合并工具，将这些图块合并为单幅图像。为确定卵母细胞的大小，打开图像并选择切片选项以打开Zs堆栈图像。选择线条工具和测量面板，通过在卵母细胞或标记物最宽处的一侧边缘到另一侧边缘画一条线来测量距离，以确定卵母细胞的XY直径。浏览图像序列，获取同类型多个卵母细胞的直径范围。将最短长度作为卵母细胞计数的尺寸筛选标准。接下来，在3D视图选项中，选择“spots”功能。在场景面板中，激活“添加新spots”功能以打开算法面板。然后取消选中所有算法设置，并使用先前获得的卵母细胞大小作为尺寸选择滤波器。单击通道前进箭头以切换到源通道。然后选择带有理想标记的通道，并在估计的 X、Y 直径中输入测得的直径。完成尺寸选择后，激活模型点扩散函数（PSF）拉伸和背景扣除功能，这些参数将自动确定。然后，选择单个向前箭头进入滤斑面板，并添加质量过滤器以确定阈值。为准确估算卵母细胞数量，请放大图像。随后，点击双箭头以完成自动计数。使用编辑选项卡手动选择自动阈值遗漏的卵母细胞，或取消选择被自动阈值错误选中的非卵母细胞颗粒。完成后，在总览选项卡下的统计选项卡中记录数据，以供进一步分析。为估算总卵母细胞数量及受损卵巢情况，请使用MRS打开完整卵巢的图像，并选择帧特征。在框架设置中，选择框格的刻度线并启用标签。在位置 XYZ 选项卡中，选择 200 µm，以在所有 XYZ 位置生成间距为 200 µm 的刻度线。利用 200 µm 的刻度线，选取位于每个卵巢体积 50% 范围内的卵母细胞。单击“斑点”功能并选择编辑标签，以颜色对位于50%区域内的卵母细胞进行分类。在非灌注和灌注卵巢的代表性灰度多光子图像中，可见原始卵泡中的小型卵母细胞具有薄层的细胞质DDX4染色。此外，还观察到生长卵泡中较大的卵母细胞。对产前和产后卵巢的多光子图像进行的三维重建进行了研究。在出生后第28天，对照组未受照射雌性个体的卵巢中含有大量存在于原始卵泡中的小型卵母细胞。相比之下，接受0.5戈瑞γ射线照射的雌性个体的卵巢中则完全缺乏存在于初级卵泡中的小型卵母细胞。但较大的卵母细胞仍然存在。为了对卵母细胞进行定量，使用MRS软件对3D多光子图像进行处理，采用高斯滤波器，并通过“斑点”特征识别和定量大小不同的卵母细胞。随后，计算每个发育阶段卵母细胞的平均百分比，相对于最早阶段E15.5的平均数量。卵母细胞数量在E15.5至E18.5期间急剧下降。多光子图像显示，E15.5和E18.5时期的胎儿卵母细胞均表达LINE-1 ORF1P。强度分析显示，在 E 18.5 时期，每个卵母细胞中一号谱系 orf 一号 P 的表达水平高于 E 15.5 时期。具有轻微损伤的卵巢可用于分析。总卵母细胞数量通过计算校正确定。代表性模型显示了E 15.5卵巢中G CNA阳性的卵母细胞，完整卵巢中有五个10%区域被高亮显示。类似地，生成了一个模拟卵巢，其中最多缺失达卵巢50%的10%递增区域。将总卵母细胞数量和模拟卵巢与原始完整卵巢进行了比较。差异以百分比偏差表示。良好的灌注可产生高质量的图像，因此在更换为PFA之前，务必用PBS彻底清除所有组织。通过切除多余组织，确保卵巢完全暴露。该方案可实现对大量样本的高效分析，利用协作杂交或多样性群体等遗传参考群体获得的定量数据，将有助于鉴定卵母细胞发育及卵母细胞数量的遗传调控因子。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

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