小鼠卵巢储备发育过程中全卵巢免疫荧光、透明化及多光子显微镜定量三维分析

该方法有助于回答生殖领域中的一个关键问题，即基因调控过程如何以及何时影响卵巢储备的大小，而我们知道卵巢储备会影响雌性的生殖寿命。本方案可适用于利用相同技术对不同发育阶段的完整卵巢进行大规模研究。通过高效定量生殖细胞，该方法可产生可靠的数据。将该方法应用于同一物种但遗传背景多样的动物，可深入了解直接调控生殖细胞及卵巢发育以及其他发育器官的遗传因素。

演示该操作的是来自我实验室的研究实习生Nathaniel Boechat。首先进行灌注步骤：将麻醉后的青春期雌性小鼠仰卧位固定，用大头针轻轻穿过其足垫，将四肢在放松状态下固定于解剖板上。为打开小鼠胸腔，需小心剪开肩胛骨下方胸骨两侧的肋骨，注意避免刺破肺部。用镊子夹住皮肤或肋骨瓣，并将其固定，以暴露内部器官。使用解剖剪剪开心脏右心房，使血液从循环系统中流出。随后，用镊子夹住心脏，将灌注针插入左心室，并以轻柔且恒定的压力泵入10 mL PBS。

当肝脏、肾脏和生殖道等组织由粉红色变为白色时，将 PBS 替换为新配制的 1% 多聚甲醛（PFA），并继续灌注约 10 毫升 PFA。接下来，找到位于肾脏下方的卵巢脂肪垫，小心分离整个生殖道，包括脂肪垫、卵巢和子宫角，并将其置于含有 4% PFA 的小瓶中。在室温下固定卵巢 16 至 24 小时，然后将 4% PFA 替换为 70% 乙醇。

染色当天，在进行免疫染色前先对卵巢组织进行修剪。免疫染色方案的第一天，在洁净的24孔板中，向所需数量的孔内每孔加入1毫升PBS。剪掉1000微升移液枪头的尖端以形成宽口，使用该宽口枪头将青春期卵巢组织从盛有70%乙醇的小瓶中轻柔转移至各孔中，随后用0.8毫升新鲜PBS替换孔中的原有液体。次日，吸除各孔中的PBS，并每孔加入0.8毫升通透缓冲液。

将培养板在室温下于摇床上孵育四小时后，用封闭缓冲液替换透化缓冲液。第三天，在封闭缓冲液中稀释制备一抗。为观察卵母细胞，使用卵母细胞标记物对产前及青春期前卵巢进行孵育。第八天，用新鲜洗涤缓冲液洗涤样品两小时，然后将洗涤缓冲液替换为0.5毫升用封闭缓冲液稀释的二抗混合液。

用封口膜密封培养板以防止蒸发，并将样品在室温下避光孵育三天。免疫染色洗涤后的第11天，吸去洗涤缓冲液，加入0.8毫升的Scale Cubic One溶液，在37°C避光条件下孵育三天，每天更换一次Scale Cubic One溶液。

第15天，在室温下用0.8毫升PBS轻轻振荡洗涤样品三次，每次10分钟。然后将PBS更换为0.8毫升新配制的脱气20%蔗糖PBS溶液，室温下轻轻振荡。一小时后，更换20%蔗糖溶液，并加入0.8毫升SCALE Cubic-2溶液处理样品，持续四至五天，具体操作如前所述。

为准备样品，使用剪去尖端的200微升移液枪头，将青春期卵巢连同15至20微升Scale Cubic Two透明化溶液转移至粘附孔的中央。将卵巢转移至单个孔中后，加入一滴透明化溶液，轻轻将盖玻片置于粘附孔上，并按压以形成密封结构，使样品和透明化溶液夹在两张盖玻片之间。用于成像时，将此盖玻片夹心结构放入3D打印的显微镜适配载玻片中。

根据显微成像核心设施或制造商的规格设置图像采集参数。如果条件允许，使用双向图像采集以减少扫描时间并提高效率。在软件中调整线平均、帧平均和帧累积参数。

通过确定起始和终止位置来设置Z轴步进，然后为青春期前卵巢选择2微米的Z步进大小，为青春期卵巢选择5微米的Z步进大小。接下来，启用Z轴补偿功能和激发增益。通过分别为样品底部和顶部选择激光强度，来设置底部和顶部的Z轴补偿。

对于无法在单个视野中完整成像的较大样本，请使用拼接成像模式。激活图像导航器，并使用矩形标记工具标定覆盖整个样本所需的图像块数量。设置完成后，通过导航器开始多图像块的图像采集，以获取所有图像块。

图像采集完成后，保存所有图像。如果采集了多个图块，则运行拼接合并工具，将这些图块合并为单幅图像。为确定卵母细胞的大小，打开图像并选择切片选项以打开Zs堆栈图像。

选择线条工具和测量面板，通过在卵母细胞或标记物最宽处的一侧边缘到另一侧边缘画一条线来测量距离，以确定卵母细胞的XY直径。浏览图像序列，获取同类型多个卵母细胞的直径范围。将最短长度作为卵母细胞计数的尺寸筛选标准。

接下来，在3D视图选项中，选择“spots”功能。在场景面板中，激活“添加新spots”功能以打开算法面板。然后取消选中所有算法设置，并使用先前获得的卵母细胞大小作为尺寸选择滤波器。

单击通道前进箭头以切换到源通道。然后选择带有理想标记的通道，并在估计的 X、Y 直径中输入测得的直径。完成尺寸选择后，激活模型点扩散函数（PSF）拉伸和背景扣除功能，这些参数将自动确定。

然后，选择单个向前箭头进入滤斑面板，并添加质量过滤器以确定阈值。为准确估算卵母细胞数量，请放大图像。随后，点击双箭头以完成自动计数。

使用编辑选项卡手动选择自动阈值遗漏的卵母细胞，或取消选择被自动阈值错误选中的非卵母细胞颗粒。完成后，在总览选项卡下的统计选项卡中记录数据，以供进一步分析。为估算总卵母细胞数量及受损卵巢情况，请使用MRS打开完整卵巢的图像，并选择帧特征。

在框架设置中，选择框格的刻度线并启用标签。在位置 XYZ 选项卡中，选择 200 µm，以在所有 XYZ 位置生成间距为 200 µm 的刻度线。利用 200 µm 的刻度线，选取位于每个卵巢体积 50% 范围内的卵母细胞。

单击“斑点”功能并选择编辑标签，以颜色对位于50%区域内的卵母细胞进行分类。在非灌注和灌注卵巢的代表性灰度多光子图像中，可见原始卵泡中的小型卵母细胞具有薄层的细胞质DDX4染色。此外，还观察到生长卵泡中较大的卵母细胞。

对产前和产后卵巢的多光子图像进行的三维重建进行了研究。在出生后第28天，对照组未受照射雌性个体的卵巢中含有大量存在于原始卵泡中的小型卵母细胞。相比之下，接受0.5戈瑞γ射线照射的雌性个体的卵巢中则完全缺乏存在于初级卵泡中的小型卵母细胞。

但较大的卵母细胞仍然存在。为了对卵母细胞进行定量，使用MRS软件对3D多光子图像进行处理，采用高斯滤波器，并通过“斑点”特征识别和定量大小不同的卵母细胞。随后，计算每个发育阶段卵母细胞的平均百分比，相对于最早阶段E15.5的平均数量。卵母细胞数量在E15.5至E18.5期间急剧下降。多光子图像显示，E15.5和E18.5时期的胎儿卵母细胞均表达LINE-1 ORF1P。

强度分析显示，在 E 18.5 时期，每个卵母细胞中一号谱系 orf 一号 P 的表达水平高于 E 15.5 时期。具有轻微损伤的卵巢可用于分析。总卵母细胞数量通过计算校正确定。

代表性模型显示了E 15.5卵巢中G CNA阳性的卵母细胞，完整卵巢中有五个10%区域被高亮显示。类似地，生成了一个模拟卵巢，其中最多缺失达卵巢50%的10%递增区域。将总卵母细胞数量和模拟卵巢与原始完整卵巢进行了比较。

差异以百分比偏差表示。良好的灌注可产生高质量的图像，因此在更换为PFA之前，务必用PBS彻底清除所有组织。通过切除多余组织，确保卵巢完全暴露。

该方案可实现对大量样本的高效分析，利用协作杂交或多样性群体等遗传参考群体获得的定量数据，将有助于鉴定卵母细胞发育及卵母细胞数量的遗传调控因子。