优化视网膜静脉遮挡小鼠模型以限制变异性

该协议提供了一个模型，以非侵入性方式研究血管损伤和随后的水肿发展的机制。这种技术的主要优点是，您可以在没有手术干预的情况下随时间跟踪损伤。这为更有效地测试治疗提供了途径。

学习如何进行适当的尾脉处理并正确将动物容纳在平台中可能具有挑战性。对于这两种技术，我建议保持耐心并慢慢来。首先，轻轻处理光纤电缆并将其连接到视网膜成像显微镜的激光控制盒和激光适配器，然后打开视网膜成像显微镜灯箱。

打开计算机并打开映像程序。将一张白纸放在显微镜目镜前，然后单击成像程序中的调整来调整白平衡。通过转动钥匙并按照激光控制盒屏幕上的说明打开激光控制盒。

要验证基线激光功率，请将激光控制盒设置为 50 毫瓦和 2， 000 毫秒。然后打开激光并将功率计放在目镜前面。踩下脚踏开关踏板激活激光器，目标是激光功率读数为 13 到 15 毫瓦。

然后，使用激光控制箱屏幕，将实验激光功率调整到100毫瓦和1， 000毫秒，并关闭激光器。将 300 毫升水倒入 500 毫升烧杯中，在微波炉中加热烧杯一分钟。然后将纱布放入温水中。

接下来将一只两个月大的雄性小鼠放在约束器中。将温热的纱布轻轻按入鼠标尾巴，寻找扩张的静脉。使用26号针头，根据动物的体重注射适量的孟加拉玫瑰，并在擦拭部位前对注射部位施加压力以防止血肿或出血。

然后将鼠标从约束器中释放出来并将其放回笼子中。在注射麻醉剂之前，让孟加拉玫瑰循环八分钟。打开加热的鼠标平台。

然后在小鼠每只眼睛中加入一滴去氧肾上腺素和托吡卡胺。确认麻醉后，每只眼睛加入一滴盐酸丙帕卡因，然后在双眼中加入眼膏。接下来，在耳朵之间皮下注射150微升卡洛芬。

然后将鼠标放在平台上并调整平台，直到视网膜眼底的视图清晰且聚焦。计数视网膜静脉并拍摄眼底图像。接下来，打开激光并瞄准距离视盘约 375 微米的视网膜静脉。

通过按下脚踏开关并将激光束稍微移动到 100 微米来照射容器。重复此步骤三次，并在每个脉冲后移动激光束，以使照射不会聚焦在一个点上。对其他主要血管重复照射，以达到两到三次闭塞。

照射血管后，关闭灯并等待 10 分钟。然后重新打开灯，计算阻塞的静脉数量，并拍摄眼底图像。图像采集和盐水注射后，在双眼中添加润滑性眼药水和凝胶软膏。

观察小鼠从麻醉中恢复，只有在完全恢复后才能将其与其他动物一起放回笼子。激光照射后立即达到的闭塞次数在给予孟加拉玫瑰后10和20分钟激光照射的动物之间没有差异。在给予孟加拉玫瑰后20分钟激光治疗的动物中，视网膜静脉闭塞后长达一天的闭塞次数显着减少，与基因型无关。

在不修改100毫瓦的实验功率的情况下，11.5毫瓦的低基线激光功率没有导致遮挡。相比之下，13.5毫瓦的基线激光输出导致成功的遮挡。激光光凝后发生四种主要类型的闭塞:完全闭塞的血管、部分闭塞的血管、部分再灌注和完全再灌注的血管。

他莫昔芬诱导的内皮细胞Casp9敲除小鼠的辐照脉管系统在部分再灌注和部分闭塞状态下花费的时间比C57 Black 6小鼠花费的时间更长，C57 Black 6小鼠在完全闭塞状态下花费的时间更长。血管闭塞状态在激光光凝后的前 10 分钟内迅速变化，并在受伤后 24 小时观察到火焰状出血。视网膜静脉阻塞后发生不同的眼科病变。

可以使用光学相干断层扫描图像量化受伤眼睛中视网膜静脉阻塞后的视网膜水肿水平。神经元层的状态也可以通过评估视网膜内层的紊乱来确定。此处显示了光学相干断层扫描图像的示例，其中每层都有相应的标签。

测量基线激光功率很重要。该读数将极大地影响遮挡的成功，并且可以进行优化。可以执行其他方法，例如OCT，ERG和Optiger。

这将有助于解决神经血管损伤对视网膜神经元完整性和视觉通路功能的影响。这项技术为询问驱动神经血管疾病的分子途径铺平了道路，并通过随着时间的推移跟踪个体动物，提供了可以更容易地转化为人类疾病的数据。