微图案化透射电子显微镜载网以在全细胞冷冻电子断层成像工作流程中引导细胞定位

我们的研究团队致力于开发冷冻电子显微镜和冷冻电子断层扫描技术及相关实验方案。我们已建立了用于微图案化透射电镜载网的技术方案，以引导细胞在冷冻电子断层扫描实验中的生长与定位。全细胞冷冻电子断层扫描可用于获得处于天然冷冻水合状态下的细胞内大分子复合物的纳米级分辨率结构。

微图案化技术可提高全细胞冷冻电子断层扫描、冷冻相关光镜-电镜以及冷冻聚焦离子束切割实验的通量。细胞在电镜载网上数量和分布情况对于全细胞冷冻电子断层扫描研究至关重要。本方案提供了一种快速、可重复且广泛适用的微图案化方法，用于引导细胞在电镜载网上定向生长。

研究人员应熟练使用移液器、镊子、基本的细胞培养技术以及荧光和透射电子显微镜。首次进行图案化操作时，建议使用已知的细胞类型与细胞外基质（ECM）组合，并在盖玻片或MatTek培养皿上进行测试。参与本实验方案开发的研究团队成员包括：Dr.

Brian Sibert、Mr. Joseph Kim 和 Dr. Jae Yang。首先，将载网转移至载网预处理 holder 中，并对载网进行辉光放电处理，碳膜面朝上。接着，将载网碳膜面朝上转移至洁净的玻璃载片或盖玻片上，载网之间应保持至少一厘米的间距。

用移液器将10微升0.05的聚-L-赖氨酸滴加到每个载网上，在湿润环境中孵育至少30分钟。孵育后，用15微升pH 8.5的0.1摩尔HEPES缓冲液洗涤每个载网三次，每次孵育30秒，然后用移液器吸除大部分液体，注意避免载网干燥。

最后一次洗涤后，将每张载网置于15微升0.1摩尔的HEPES溶液中。接着，配制PEG-SVA溶液，并立即用10微升该溶液替换载网上的HEPES溶液，然后将载网置于湿盒中孵育至少一小时。孵育结束后，用15微升无菌水对每张载网洗涤三次，每次洗涤孵育30秒。

最后一次洗涤后，将每张载网置于15微升水中。在新的洁净盖玻片中央放置一微升水滴，然后小心地将载网从15微升水滴转移至新盖玻片上的水滴中，确保碳膜面朝上。接着，小心地将PDMS模板放置在载网上方，保持载网居中，并尽量减少模板与载网碳膜的接触。

然后在网格上加入1 µL PLPP凝胶，用移液器轻轻吹打混匀。将带有网格的盖玻片移至避光处干燥。凝胶将在15至30分钟内干燥。

进行微图案化时，打开显微镜的明场实时成像软件。若要为初次运行设计新模板，请选择“添加感兴趣区域”（Add ROI），并选择一个直径为 3,000 微米的圆形。以屏幕上的明场图像为参考，将圆形感兴趣区域置于网格上方，然后按“锁定”（Lock）以固定该区域。

锁定 ROI 后，选择“添加图案”并选择合适的图案。利用复制选项，生成初始图案的副本，创建一个 8×8 的网格区域。根据需要调整间距和角度，使图案与网格对齐。

将图案放置在网格的一个角落。接着，复制该图案，并将副本分别置于网格的四个角落，必要时移动显微镜载物台以定位每个区域。使用复制选项，将一个八乘八的网格区域修改为二乘八的网格区域，并将其放置在中心两侧。

保持中央四个网格方格无图案。对于每种图案，如有必要可调整总剂量。30 毫焦耳/平方毫米是一个合适的起始点。

在专家选项下，反复调整图案的角度、位置、间距和比例，以优化图案与网格方格的对齐。移动显微镜载物台，以改变明场显示中的网格区域。当模板和图案定位完成后，在软件操作面板中取消选中除一个区域外的所有区域。

使用显微镜载物台移动至该区域，并对准碳膜进行聚焦。在操作面板中点击眼睛图标，关闭图案叠加显示。当网格清晰对焦后，关闭明场快门，然后点击软件右下角的播放图标，以开始图案化过程，该过程可实时监测。

重复此步骤，直至所有区域均完成图案化。最后，将带有网格的盖玻片从显微镜上取下，并立即向网格上加入10微升无菌PBS。10分钟后，用镊子移除模板，随后用15微升PBS清洗网格三次，每次清洗后将网格置于PBS中，并存放在避光处。

为每个载网准备15微升细胞外基质，然后用15微升细胞外基质替换每个载网中的PBS，并将载网置于湿盒中孵育至少1小时。孵育结束后，用15微升无菌PBS对每个载网洗涤5次，操作如前所述。最后一次洗涤后，将每个载网保留在PBS中。

使用荧光显微镜检测细胞外基质中的荧光染料，以确认图案化效果以及碳膜保持完整。通过钙黄绿素AM和碘化乙啶同源二聚体-1染色的细胞活性检测法进行荧光染色，可在透射电镜载网上观察到接种的HeLa细胞，无论其是否经过微图案化处理。使用混合胶原蛋白和纤维蛋白原的细胞外基质时，HeLa细胞能够迅速黏附于载网上的图案区域。

沿图案扩展的细胞整体形态与在无图案网格上生长的细胞相似。接种后18小时，RSV感染的BEAS-2B细胞的明场图像显示细胞沿图案中央区域黏附并生长。大多数感染的细胞位于梯度图案中密度较高的中央区域。

在微图案化网格上培养的感染BEAS-2B细胞中，RSV变异体位于细胞边缘附近。在断层扫描图像中可识别出多种RSV结构蛋白，包括核衣壳和病毒融合蛋白。在微图案化网格上，由于荧光标记以及位置位于微图案内，表达泛神经元GFP的果蝇神经元可通过光学显微镜轻松追踪。

在无图案的网格上，神经元也可以通过荧光显微镜观察GFP信号进行追踪。然而，由于细胞碎片以及培养基中的污染物干扰，通过冷冻电子显微镜定位神经元变得困难。鉴于神经元胞体及延伸的神经突具有特定的尺寸，通常需在细胞较薄区域以更高放大倍数采集冷冻电子断层成像的倾斜系列图像。

在高倍率图像拼接图以及三维断层成像的切片中，神经元细胞膜、线粒体、微管、肌动蛋白丝、囊泡结构以及核糖体等大分子物质均能清晰分辨。在无图案化神经元的三维断层成像中也可观察到类似的亚细胞结构。将模板应用于载网并添加PLPP凝胶是影响图案化结果的最关键步骤，需谨慎操作。

冷冻-correlative light and electron microscopy（冷冻-CLEM）可用于在细胞内定位目标区域，以进行冷冻电子断层扫描（cryo-ET）数据采集。冷冻聚焦离子束扫描电子显微镜（cryo-FIB-SEM）可用于对原本过厚而无法采集数据的区域进行细胞减薄处理。