Name: 微图案透射电子显微镜网格，用于在全细胞冷冻电子断层扫描工作流程中指导细胞定位 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 了解微图案透射电子显微镜网格技术，用于在全细胞冷冻电子断层扫描工作流程中精确指导细胞定位与生长。该方法可显著提高冷冻电镜成像效率，适用于HeLa细胞等多种细胞类型的高分辨率结构研究。

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我们感谢威斯康星大学麦迪逊分校生物化学系的Jill Wildonger博士、Sihui Z. Yang博士和Josephine W. Mitchell女士慷慨提供elav-Gal4、UAS-CD8::GFP果蝇品系（布卢明顿果蝇中心，#5146）。我们还要感谢Alvéole公司的Aurélien Duboin博士、Laurent Siquier先生和Marie-Charlotte Manus女士，以及Nanoscale Labs的Serge Kaddoura先生在本项目期间提供的大力支持。本研究部分由威斯康星大学麦迪逊分校、该校生物化学系以及美国国立卫生研究院（NIH）向E.R.W.资助的公共卫生服务基金R01 GM114561、R01 GM104540、R01 GM104540-03W1和U24 GM139168，以及向P.W.S.资助的R01 AI150475支持。本研究的部分工作由NIH基金U24 GM129547资助，并在俄勒冈健康与科学大学（OHSU）的PNCC进行，通过EMSL（grid.436923.9）完成，EMSL是美国能源部科学办公室下属的用户设施，由生物与环境研究办公室资助。我们还感谢威斯康星大学麦迪逊分校生物化学系冷冻电镜研究中心提供的设施与仪器支持。

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作者无任何利益冲突需要披露。

现代先进的电子显微镜和软件包现已支持高效的自动化冷冻电镜（cryo-EM）和冷冻电子断层扫描（cryo-ET）数据采集，可在数天内对数百至数千个位点进行靶向成像32,33,34,35。全细胞 cryo-ET 工作流程的一个主要限制因素是每张载网可采集的目标数量不足。近期，多个研究团队已开发出用于 cryo-EM 的载网微图案化技术方案，其中一项优势是提高了数据采集效率16,17,18。本文介绍了一种利用商业化微图案化系统对用于原代 Drosophila 神经元及培养的人源细胞系（未感染或呼吸道合胞病毒 RSV 感染）cryo-ET 研究的透射电镜（TEM）载网进行微图案化的方案。该微图案化系统具有高度灵活性，许多步骤可根据特定实验目标进行优化和调整。具备透射电镜和荧光显微镜操作经验的用户可快速掌握载网制备与微图案化技术。通过仔细练习，经过数次尝试后即可获得理想结果。下文将讨论用于 cryo-EM 的微图案化技术所具备的若干可选方案、用户需考虑的因素、潜在优势以及未来应用前景。
全细胞冷冻电子断层扫描（cryo-ET）的一个重要考虑因素是电镜载网的选择。电镜载网由两部分组成：网架（或称结构支撑）和膜层（或称薄膜），后者是细胞生长的连续或带孔薄膜表面。铜网载网通常用于蛋白质及分离复合物的冷冻电镜分析，但由于铜具有细胞毒性，因此不适用于全细胞 cryo-ET。取而代之的是，细胞断层成像中通常使用金网载网。其他可选材料包括镍或钛，这些材料相比金可能具有更高的刚性16。电镜载网提供多种网孔尺寸，以适应不同应用需求。较大的网孔尺寸可在网格条之间为细胞生长提供更大空间，并增加适合倾转系列采集的区域，但代价是整体样品的机械强度降低。最常用的膜层是穿孔型或带孔的非晶碳膜，例如 Quantifoil 或 C-flat 载网。生物样品既可通过碳膜上的孔洞成像，也可通过电子可穿透的碳膜区域成像。像 R 2/1 或 R 2/2 这类载网，其孔径分别为 2 µm，孔间距分别为 1 和 2 µm，可提供大量孔洞，从而为数据采集提供较多潜在区域。然而，某些细胞可能在更均匀的表面上生长和扩展得更好，例如 R 1.2/20 载网或连续碳膜。对于后续采用聚焦离子束铣削（cryo-FIB）处理的样品，膜层将通过铣削去除，因此无需担忧底层薄膜的持续存在。与网架类似，其他材料制成的膜层也可获得，本文所述的图案化方案同样适用于 SiO2 载网。常用于全细胞 cryo-ET 的载网包括金质 Quantifoil 载网、连续碳膜载网以及 SiO2 膜 200 目载网（网格条间距约为 90 µm）。
在设计图案时需要考虑多个因素。其中大多数决策由细胞类型和实验目的决定。一个良好的起点是选择一种接近培养细胞形状和尺寸的图案。许多研究已证明，图案形状对细胞生长和细胞骨架排列具有显著影响13,36,37。如果图案设计可能改变研究目标，则需特别谨慎。针对每种细胞类型测试了多种图案，以确定哪些图案能够促进细胞黏附和生长。微图案系统的灵活性允许在同一个网格上测试多种图案，并在单个实验中为不同网格更换图案。较大的图案（约50–90 µm），例如本文所用的图案，可提高多个细胞黏附至图案单一区域的可能性，并允许细胞在黏附后充分展开和伸展。而在某些实验中，若细胞隔离比细胞扩展更为重要（例如聚焦离子束切割（cryo-FIB）实验），则更受限制的小型图案（20–30 µm）可能更为合适。对于断层成像应用，还需考虑倾转轴的影响。如果图案设计导致所有细胞沿单一方向平行生长，则当样品加载到显微镜载物台上时，所有细胞可能恰好垂直于倾转轴，从而导致数据质量下降。
在无图案的载网上，细胞通常优先黏附于载网条上，而这些区域无法通过透射电子显微镜（TEM）成像。即使在具有图案的载网上，也常观察到细胞位于载网方格的角落，部分覆盖在图案化碳膜上，部分覆盖在载网条上。最近，已有研究利用微图案技术有意将细胞的一部分定位在载网条上方18。对于无需整个细胞周边都位于碳膜上的实验，这种方法可以被考虑采用。对于某些可生长至超过单个载网方格大小的细胞（例如培养多天的原代神经元），这一点尤为重要。
有许多工具可用于设计图案。此处将图案限制在任一维度均小于800像素，以确保该图案可旋转至任意角度后，仍能完全位于该微图案系统单次投影所能覆盖的最大面积范围内。这使得用户能够将图案旋转至与载物台网格正确对齐的方向，而无需考虑显微镜下网格的实际朝向。本示例中，网格被划分为六个独立的图案区域。主要目的是在网格的不同区域之间进行焦距调整。特别是金质网格，其材质较软，可能无法完全平整地贴合在玻璃表面。精确的焦距对于获得清晰、精细的图案至关重要。通过使用分段式图案，即使在图案化过程中网格发生轻微位移，也仅需对图案位置进行微小调整即可；不过，在使用PLPP凝胶与PDMS掩模时，此类位移通常不会发生。最后，网格中央的四个方格保持未图案化状态。这有助于用户清晰识别网格中心位置，在进行关联成像实验时尤为有用。
该微图形化系统的图形设计软件 Leonardo 还具备更高级的功能，例如拼接以及导入 PDF 格式图形，但这些功能超出了本实验方案的范围。该软件还包括微结构检测和自动图形定位功能，可用于透射电子显微镜（TEM）载网。当载网非常平整，且无需在不同区域之间调整焦距即可进行图形化时，此功能最为适用。
选择一种细胞外基质（ECM）蛋白可能对细胞黏附和扩增产生显著影响。已知某些细胞在特定基质上培养时会发生生理变化38。对于任何新的细胞类型，应根据文献中已报道的前期研究，测试多种ECM蛋白及其浓度。层粘连蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白和胶原蛋白在细胞培养中被广泛使用，若缺乏其他数据，可将其作为起始选择。然而，若常用ECM蛋白无法为细胞提供适当的黏附特性，则还必须考虑其他ECM蛋白。这一点对于原代果蝇（Drosophila）神经元尤为明显，因其需要高浓度的植物凝集素刀豆蛋白A才能实现良好的细胞黏附。可通过在玻璃培养皿或载玻片上进行图案化处理，来检测细胞黏附与生长对ECM的兼容性，然后再过渡到透射电镜（TEM）载网。如果需要检测大量组合，这种预筛选方法在时间和成本上均具有优势。加入荧光标记的ECM蛋白有助于评估图案化是否成功及其质量。
细胞接种是全细胞冷冻电子断层扫描（cryo-ET）中最为关键的步骤之一，无论是否采用微图案化技术6,16,39. 用于初级 黑腹果蝇 或其它神经元，这些细胞脆弱、在悬浮状态下不稳定，且数量可能有限，因此相较于受监控的连续细胞接种，更倾向于采用单次接种方法。按照本方案所述，在优化的细胞密度下进行单次接种步骤， 果蝇 神经元，对于大多数细胞类型而言是一种可行的选择。然而，也可以在较低的初始浓度下将细胞接种至基质，并按照本文及其他文献所述的方法，以受控方式逐步添加更多细胞18这种顺序接种在某些情况下可提供更一致的结果。与常规细胞培养类似，在分离过程中应始终注意维持细胞活力，并尽量减少细胞聚团。
初次进行微图形化实验时，存在一些可能严重影响最终结果的潜在问题。成功的最关键因素包括：小心操作载网、采用无菌技术、确保PLPP凝胶均匀分布、图案化过程中使用适当的剂量和正确的聚焦，以及在接种前维持细胞活力。以下列出了一些潜在问题及其解决方案： 表1.
微图案化网格可用于帮助定位细胞，以在网格上建立一致的细胞密度，并将感兴趣区域置于适合倾转系列图像采集的位置16,18。细胞的排列和定位可作为冷冻光电关联显微镜（cryo-CLEM）实验中的标志点，从而减少对易损的定位网格和荧光标志点的依赖。然而，需要注意的是，此类标志点在亚微米精度的关联定位中可能仍然具有重要作用29,40。此外，孤立细胞的均匀分布对于聚焦离子束切割（cryo-FIB）实验也极为有利，可最大化可切取薄片（lamella）的细胞数量16。
将微图案技术引入冷冻电镜工作流程将显著提高数据通量，并可能实现新的实验。随着该技术的进一步推广和发展，微图案技术将拓展出更高级的应用，包括细胞外基质梯度、多种细胞外基质沉积以及微结构组装，从而进一步增强冷冻电子断层扫描技术在完整细胞环境中研究生物靶标和生物过程的能力。

随着冷冻电子显微镜（cryo-EM）技术的发展、拓展和多样化，研究人员能够在接近天然的状态下，以从大分子尺度（约1 nm）到高分辨率（约2 Å）的范围，观察多种生物样品。单颗粒冷冻电镜技术与电子衍射技术分别最适合用于溶液中或晶体状态下的纯化大分子1,2。而冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET）则特别适用于对细菌、多形性病毒和真核细胞等大型异质性结构进行接近天然状态的结构与超微结构研究3。在冷冻电子断层扫描中，通过在显微镜载物台上物理倾斜样品，并从不同角度获取穿过样品的一系列图像，从而获得三维（3D）信息。这些图像，即倾转系列图像，通常以每步1至3度的增量，覆盖+60/-60度的范围。随后，可通过计算方法将倾转系列图像重构为一个三维体数据，也称为断层图（tomogram）4。
所有冷冻电镜技术都需要将样品包埋在一层薄的非晶态、非结晶性的玻璃态冰中。最常用的冷冻固定技术之一是浸入式冷冻，即将样品施加到电镜载网上，吸去多余液体后迅速浸入液态乙烷或液态乙烷与丙烷的混合物中。该技术足以实现厚度从&#60;100 nm至约10 µm的样品的玻璃化，包括培养的人源细胞（如HeLa细胞）5,6。厚度达200 µm的较厚样品，例如微型类器官或组织活检样本，可通过高压冷冻实现玻璃化7。然而，由于较厚样品会增加电子散射，因此在300 kV透射电子显微镜中，冷冻电子断层扫描（cryo-ET）所允许的样品和冰层厚度被限制在约0.5 - 1 µm范围内。因此，若无额外的样品制备步骤（如冷冻切片8或聚焦离子束铣削9,10,11），多数真核细胞的全细胞冷冻电子断层扫描仅限于细胞周边区域或细胞突起部分。
许多全细胞冷冻电子断层扫描成像实验的一个局限性是数据采集通量较低12。与单颗粒冷冻电镜技术不同，在后者中，通常可以从单个透射电镜（TEM）网格方格内采集数千个独立颗粒的图像，而细胞体积较大、分布分散，且必须以足够低的密度生长，以便将细胞包埋在一层薄的玻璃态冰中得以保存。通常，感兴趣区域仅限于细胞的特定结构或亚区域。此外，细胞倾向于在不适合TEM成像的区域生长，例如在TEM网格条上或其附近，这进一步限制了通量。由于在TEM网格上进行细胞培养存在诸多不可预测的因素，因此需要技术上的改进，以提高样品的可及性和数据采集的通量。
利用黏附性细胞外基质（ECM）蛋白进行基底微图形化是一种成熟的活细胞光学显微技术，可引导细胞在刚性、耐用且光学透明的表面（如玻璃及其他组织培养基底）上定向生长13,14。微图形化技术也已应用于柔软和/或三维（3D）表面。此类技术不仅实现了细胞的精确定位，还促进了多细胞网络的构建，例如具有特定图案的神经细胞回路15。将微图形化技术引入冷冻电子断层扫描（cryo-ET），不仅能提高通量，还有望开启对复杂且动态的细胞微环境进行全新研究的大门。
近期，多个研究团队已开始通过多种方法在透射电子显微镜（TEM）载网上应用微图形化技术16,17。本文描述了一种使用Alvéole PRIMO微图形化系统对TEM载网进行无掩模光图形化的方法，该系统具有高分辨率和非接触式图形化的特点。利用该微图形化系统，首先在基底表面涂覆一层抗污染层，随后施加光催化剂，并通过紫外激光在用户自定义的图案区域中去除抗污染层。之后可将细胞外基质（ECM）蛋白添加至这些图案区域，以进行相应的细胞培养。该方法已被多个研究团队用于视网膜色素上皮细胞-1（RPE1）、Madin-Darby犬肾细胞-II（MDCKII）、人包皮成纤维细胞（HFF）以及内皮细胞系的冷冻电子断层扫描（cryo-ET）研究16,17,18。该微图形化系统兼容多种抗污染层基底，以及液态或凝胶态的光催化剂试剂。用户可根据特定细胞系的需求，灵活选择并适配多种ECM蛋白，从而具备良好的实验灵活性。
微图案化技术已成功应用于实验室内的多个研究项目19。本文介绍了一种微图案化实验方案，包括针对培养的HeLa细胞、呼吸道合胞病毒（RSV）感染的BEAS-2B细胞以及原代幼虫期Drosophila melanogaster神经元研究的具体优化步骤20。

<table><tbody><tr><td>0.1% (w/v) 聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma</td><td>P8920-100ML</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m 注射器滤器，PVDF 膜</td><td>Genesee</td><td>25-240</td><td></td></tr><tr><td>22x60-1 玻璃盖玻片</td><td>Fisher</td><td>12545F</td><td></td></tr><tr><td>5/15 镊子</td><td>EMS (Dumont)</td><td>0203-5/15-PO</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌素（100X）</td><td>ThermoFisher (Gibco)</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>BEAS-2B 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-9609</td><td></td></tr><tr><td>牛胶原蛋白 I 型</td><td>ThermoFisher (Gibco)</td><td>A1064401</td><td></td></tr><tr><td>刀豆蛋白 A，Alexa Fluor 350 标记物</td><td>ThermoFisher (Invitrogen)</td><td>C11254</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher (Lonza)</td><td>BW12-604F</td><td></td></tr><tr><td>EtOH</td><td>Fisher (Decon Labs)</td><td>22-032-600</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>人血浆纤维蛋白原，Alexa Fluor 647 标记物</td><td>ThermoFisher (Invitrogen)</td><td>F35200</td><td></td></tr><tr><td>牛血浆纤连蛋白蛋白</td><td>ThermoFisher (Gibco)</td><td>33010018</td><td></td></tr><tr><td>玻璃底培养皿</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>VWR</td><td>0643-1KG</td><td></td></tr><tr><td>载网制备夹具</td><td>EMS</td><td>71175-01</td><td></td></tr><tr><td>HeLa 细胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Fisher (SKC, Inc.)</td><td>22600100</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher (ACROS Organics)</td><td>AC172572500</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFisher (Invitrogen)</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Fisher (Sigma Aldrich)</td><td>NC0520015</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>MP Bio</td><td>194844</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher (ACROS Organics)</td><td>AC212595000</td><td></td></tr><tr><td>Leica-DMi8</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>可根据需要配备相机、载物台和物镜附件</td></tr><tr><td>Leonardo</td><td>Alv&amp;eacute;ole</td><td></td><td>https://www.alveolelab.com/our-products/leonardo-photopatterning-software/</td></tr><tr><td>Liberase 研究级酶</td><td>Fisher (Supply Solutions)</td><td>50-100-3280</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 细胞活力/细胞毒性检测试剂盒</td><td>ThermoFisher (Invitrogen)</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>显微镜相机</td><td>Hammamatsu</td><td>C13440-20CU</td><td></td></tr><tr><td>电动载物台</td><td>M&amp;auml;rzh&amp;auml;user Wetzlar</td><td>00-24-599-0000</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher (Fisher BioReagents)</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher (ACROS Organics)</td><td>AC207802500</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher (Alfa Aesar)</td><td>AAA1603736</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>PDMS 模板</td><td>nanoscaleLABS</td><td>PDMS_STENCILS_EM</td><td>https://www.alveolelab.com/our-products/pdms-stencil-multiwell-plate/</td></tr><tr><td>PEG-SVA</td><td>nanoscaleLABS</td><td>PEG-SVA-1GR</td><td>mPEG-琥珀酰亚胺戊酸酯，分子量 5,000</td></tr><tr><td>青霉素</td><td>Fisher (Research Products International Corp)</td><td>50-213-641</td><td></td></tr><tr><td>pH 试纸</td><td>Fisher (Millipore Sigma)</td><td>M1095350001</td><td>也可使用 pH 探针</td></tr><tr><td>PLPP 凝胶</td><td>nanoscaleLABS</td><td>PLPP-GEL-300UL</td><td>https://www.alveolelab.com/our-products/plpp-photoactivatable-reagent/</td></tr><tr><td>PRIMO</td><td>Alv&amp;eacute;ole</td><td></td><td>https://www.alveolelab.com/our-products/primo-micropatterning/</td></tr><tr><td>pSynkRSV-I19F（含 RSV A2-mK+ 抗基因组 cDNA 的 BAC）</td><td>BEI Resources</td><td>NR-36460</td><td>https://www.beiresources.org/Catalog/BEIPlasmidVectors/NR-36460.aspx</td></tr><tr><td>Quantifoil 载网</td><td>EMS (Quantifoil)</td><td>Q2100AR1</td><td>2 &amp;micro;m 孔，间距 1 &amp;micro;m，其他尺寸也可提供</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Fisher (Lonza)</td><td>BW12-702F</td><td></td></tr><tr><td>RSV A2-mK+</td><td>参见 pSynkRSV-19F 条目</td><td>-</td><td>见 Hotard 等人 [22]。可由 pSynkRSV-ll9F 构建获得</td></tr><tr><td>Schneider 培养基</td><td>ThermoFisher (Gibco)</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>SerialEM</td><td>SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ )</td><td></td><td>https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td></tr><tr><td>直头镊子</td><td>EMS (Dumont)</td><td>72812-D</td><td></td></tr><tr><td>链霉素</td><td>Fisher (Fisher BioReagents)</td><td>BP910-50</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Avantor</td><td>4097-04</td><td></td></tr><tr><td>四环素</td><td>Sigma</td><td>T8032-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Titan Krios 电子显微镜</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>300 kV，配备直接电子探测器相机和能量过滤器</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>ThermoFisher (Gibco)</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>试管旋转仪/混匀仪</td><td>Fisher (Thermo Scientific)</td><td>11676341</td><td></td></tr><tr><td>UAS:mcD8:GFP 果蝇品系</td><td>Bloomington 果蝇品系中心</td><td>5146</td><td>http://flybase.org/reports/FBtp0002652.html</td></tr></tbody></table>

微图案化透射电子显微镜载网以在全细胞冷冻电子断层成像工作流程中引导细胞定位

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

全细胞冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET）是一种强大的技术，可用于在细胞环境中以纳米级分辨率解析大分子的结构，并将其保持在接近天然的冷冻水合状态。然而，在将细胞培养或贴附到透射电镜（TEM）载网上时，如何在适合断层扫描成像的同时维持细胞的生理状态，仍存在诸多挑战。本文提供了一种利用微图形化技术引导并促进真核细胞在TEM载网上生长的详细分步操作方案。在微图形化过程中，通过在TEM载网的支撑膜上特定位置和图案区域沉积细胞外基质（ECM）蛋白，从而引导细胞生长，而其他区域则保留抗污染涂层。由于表面涂层和图案设计具有高度灵活性，微图形化技术可广泛适用于多种细胞类型。该技术不仅适用于单个细胞内结构的研究，也适用于更复杂的实验体系，如宿主-病原体相互作用或分化的多细胞群落。此外，微图形化还可整合到多种下游全细胞cryo-ET工作流程中，包括冷冻关联光镜与电镜（cryo-CLEM）以及聚焦离子束切削（cryo-FIB）。

本实验方案的目的是引导细胞在冷冻电子显微镜用载网上特定区域进行黏附和生长。该目标通过以下步骤实现：首先涂覆抗污染层，然后按照用户指定的图案进行消融，接着在图案化区域沉积细胞外基质蛋白，最后接种细胞。

全细胞冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET）是一种强大的技术，可用于获得大分子复合物的纳米级分辨率结构……

我们的研究团队致力于开发冷冻电子显微镜和冷冻电子断层扫描技术及相关实验方案。我们已建立了用于微图案化透射电镜载网的技术方案，以引导细胞在冷冻电子断层扫描实验中的生长与定位。全细胞冷冻电子断层扫描可用于获得处于天然冷冻水合状态下的细胞内大分子复合物的纳米级分辨率结构。微图案化技术可提高全细胞冷冻电子断层扫描、冷冻相关光镜-电镜以及冷冻聚焦离子束切割实验的通量。细胞在电镜载网上数量和分布情况对于全细胞冷冻电子断层扫描研究至关重要。本方案提供了一种快速、可重复且广泛适用的微图案化方法，用于引导细胞在电镜载网上定向生长。研究人员应熟练使用移液器、镊子、基本的细胞培养技术以及荧光和透射电子显微镜。首次进行图案化操作时，建议使用已知的细胞类型与细胞外基质（ECM）组合，并在盖玻片或MatTek培养皿上进行测试。参与本实验方案开发的研究团队成员包括：Dr.Brian Sibert、Mr. Joseph Kim 和 Dr. Jae Yang。首先，将载网转移至载网预处理 holder 中，并对载网进行辉光放电处理，碳膜面朝上。接着，将载网碳膜面朝上转移至洁净的玻璃载片或盖玻片上，载网之间应保持至少一厘米的间距。用移液器将10微升0.05的聚-L-赖氨酸滴加到每个载网上，在湿润环境中孵育至少30分钟。孵育后，用15微升pH 8.5的0.1摩尔HEPES缓冲液洗涤每个载网三次，每次孵育30秒，然后用移液器吸除大部分液体，注意避免载网干燥。最后一次洗涤后，将每张载网置于15微升0.1摩尔的HEPES溶液中。接着，配制PEG-SVA溶液，并立即用10微升该溶液替换载网上的HEPES溶液，然后将载网置于湿盒中孵育至少一小时。孵育结束后，用15微升无菌水对每张载网洗涤三次，每次洗涤孵育30秒。最后一次洗涤后，将每张载网置于15微升水中。在新的洁净盖玻片中央放置一微升水滴，然后小心地将载网从15微升水滴转移至新盖玻片上的水滴中，确保碳膜面朝上。接着，小心地将PDMS模板放置在载网上方，保持载网居中，并尽量减少模板与载网碳膜的接触。然后在网格上加入1 µL PLPP凝胶，用移液器轻轻吹打混匀。将带有网格的盖玻片移至避光处干燥。凝胶将在15至30分钟内干燥。进行微图案化时，打开显微镜的明场实时成像软件。若要为初次运行设计新模板，请选择“添加感兴趣区域”（Add ROI），并选择一个直径为 3,000 微米的圆形。以屏幕上的明场图像为参考，将圆形感兴趣区域置于网格上方，然后按“锁定”（Lock）以固定该区域。锁定 ROI 后，选择“添加图案”并选择合适的图案。利用复制选项，生成初始图案的副本，创建一个 8×8 的网格区域。根据需要调整间距和角度，使图案与网格对齐。将图案放置在网格的一个角落。接着，复制该图案，并将副本分别置于网格的四个角落，必要时移动显微镜载物台以定位每个区域。使用复制选项，将一个八乘八的网格区域修改为二乘八的网格区域，并将其放置在中心两侧。保持中央四个网格方格无图案。对于每种图案，如有必要可调整总剂量。30 毫焦耳/平方毫米是一个合适的起始点。在专家选项下，反复调整图案的角度、位置、间距和比例，以优化图案与网格方格的对齐。移动显微镜载物台，以改变明场显示中的网格区域。当模板和图案定位完成后，在软件操作面板中取消选中除一个区域外的所有区域。使用显微镜载物台移动至该区域，并对准碳膜进行聚焦。在操作面板中点击眼睛图标，关闭图案叠加显示。当网格清晰对焦后，关闭明场快门，然后点击软件右下角的播放图标，以开始图案化过程，该过程可实时监测。重复此步骤，直至所有区域均完成图案化。最后，将带有网格的盖玻片从显微镜上取下，并立即向网格上加入10微升无菌PBS。10分钟后，用镊子移除模板，随后用15微升PBS清洗网格三次，每次清洗后将网格置于PBS中，并存放在避光处。为每个载网准备15微升细胞外基质，然后用15微升细胞外基质替换每个载网中的PBS，并将载网置于湿盒中孵育至少1小时。孵育结束后，用15微升无菌PBS对每个载网洗涤5次，操作如前所述。最后一次洗涤后，将每个载网保留在PBS中。使用荧光显微镜检测细胞外基质中的荧光染料，以确认图案化效果以及碳膜保持完整。通过钙黄绿素AM和碘化乙啶同源二聚体-1染色的细胞活性检测法进行荧光染色，可在透射电镜载网上观察到接种的HeLa细胞，无论其是否经过微图案化处理。使用混合胶原蛋白和纤维蛋白原的细胞外基质时，HeLa细胞能够迅速黏附于载网上的图案区域。沿图案扩展的细胞整体形态与在无图案网格上生长的细胞相似。接种后18小时，RSV感染的BEAS-2B细胞的明场图像显示细胞沿图案中央区域黏附并生长。大多数感染的细胞位于梯度图案中密度较高的中央区域。在微图案化网格上培养的感染BEAS-2B细胞中，RSV变异体位于细胞边缘附近。在断层扫描图像中可识别出多种RSV结构蛋白，包括核衣壳和病毒融合蛋白。在微图案化网格上，由于荧光标记以及位置位于微图案内，表达泛神经元GFP的果蝇神经元可通过光学显微镜轻松追踪。在无图案的网格上，神经元也可以通过荧光显微镜观察GFP信号进行追踪。然而，由于细胞碎片以及培养基中的污染物干扰，通过冷冻电子显微镜定位神经元变得困难。鉴于神经元胞体及延伸的神经突具有特定的尺寸，通常需在细胞较薄区域以更高放大倍数采集冷冻电子断层成像的倾斜系列图像。在高倍率图像拼接图以及三维断层成像的切片中，神经元细胞膜、线粒体、微管、肌动蛋白丝、囊泡结构以及核糖体等大分子物质均能清晰分辨。在无图案化神经元的三维断层成像中也可观察到类似的亚细胞结构。将模板应用于载网并添加PLPP凝胶是影响图案化结果的最关键步骤，需谨慎操作。冷冻-correlative light and electron microscopy（冷冻-CLEM）可用于在细胞内定位目标区域，以进行冷冻电子断层扫描（cryo-ET）数据采集。冷冻聚焦离子束扫描电子显微镜（cryo-FIB-SEM）可用于对原本过厚而无法采集数据的区域进行细胞减薄处理。

micropatterning-transmission-electron-microscopy-grids-to-direct-cell

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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厚组织冷冻电子断层成像工作流程在小鼠海马体中的应用

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