Name: 一种有效的黑胡椒植 酸菌 接种方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T12:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: 学习黑胡椒Phytophthora capsici接种方法，通过基部针刺接种技术提高植物病理研究稳定性。该方法为木本藤本作物接种提供可靠参考，有助于深入研究植物与土传病原菌的互作机制。

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本工作受到国家重点研发计划&amp;中国国家重点研发计划（2020YFD1001200）、中国农业研究体系（CARS-11）、海南省院士创新平台专项科研基金（YSPTZX202154）、海南省自然科学基金（321RC652）以及国家自然科学基金（No. 31601626）

1. 感染前黑胡椒插条植株的准备
<ol>
	<li>使用已消毒的修枝刀或修枝剪，从健康且生长旺盛的胡椒直立枝条上截取一段长约 40 cm、直径约 0.5 cm 的五节插条。修剪掉插条上部的三个节位处的侧生枝条，保留顶部两个节位，每个节位保留约 10 片完整叶片。</li>
	<li>准备由土壤和动物粪肥（牛粪或羊粪）按 1:1 比例混合而成的生根基质。将该基质在 121 °C 下高压灭菌 20 分钟。</li>
	<li>以约 50° 的倾斜角度将插条插入生根基质中，使第三个节位刚好接触基质表面，且该节位上的腋芽位于基质上方。 
	注意：此处使用的袋子尺寸为：高度 40–60 cm，直径 25–30 cm。</li>
	<li>向植株根部浇灌 10–20 L 水。将插条置于遮光率为 90%、温度为 25–30 °C 的温室中，以促进生根和生长。</li>
</ol>
2. 辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici，P. capsici）的培养
注意：胡椒疫霉（Phytophthora capsici）菌种保存于中国热带农业科学院香料饮料研究所植物保护实验室7。
<ol>
	<li>在流动的自来水下刷洗并清洁马铃薯块茎，然后将200 g马铃薯切成1 cm3的立方体。取部分立方体放入含有800 mL双蒸水（ddH2O）的烧杯中，煮沸20 min。</li>
	<li>通过双层纱布进行重力过滤，滤出液体。向滤液中加入20 g葡萄糖和15 g琼脂，用ddH2O定容至1 L，配制成马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）。在121 °C条件下高压灭菌20 min8。</li>
	<li>在超净工作台内，将20 mL灭菌后的液态PDA倒入直径为9 cm的圆形培养皿中。将PDA平板开盖放置于超净工作台内过夜，以防止冷凝水形成。</li>
	<li>使用接种环从试管内的Phytophthora capsici菌种中挑取菌丝，将接种物以菌丝面接触PDA的方式置于培养皿中。</li>
</ol>
3. 胡椒的感染
<ol>
	<li>孵育
	<ol>
		<li>在基质表面以上5 cm处、靠近根部的茎段上确定接种区域。</li>
		<li>使用打孔器从培养在培养皿PDA培养基上的Phytophthora capsici菌落生长边缘切取直径为0.5 cm的菌丝圆片。</li>
		<li>用注射器针头刺伤茎部，在选定的接种区域以三角形排列方式打三个孔，每个孔覆盖一个菌丝圆片。将孔的位置设置得彼此靠近，以确保受伤区域被菌丝圆片完全覆盖。</li>
		<li>用灭菌并湿润的棉垫覆盖菌丝圆片，以防止干燥。用聚乙烯条带将棉垫固定在茎上，以保持接种圆片的位置。 
		注意：接种后8小时，接种孔变为黑色，病斑随时间推移逐渐扩展。叶片变黄并脱落，接种植株在接种后7–10天死亡。对照植株未出现病斑。Phytophthora capsici接种组与对照组相比，大多数基因的表达发生差异。对感染组织的组织病理学分析表明，Phytophthora capsici定植于木质部中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采集目标植物材料，并在液氮中速冻后于-80 °C保存，用于后续研究。 
	注意：实验前需准备好液氮、塑料袋、记号笔、修枝剪及其他相关材料。</li>
	<li>在采集特定植物材料用于实验后，应对所有剩余的植物材料、残留的Phytophthora capsici培养物及培养基，以及本接种实验中使用过的所有器械和实验器皿进行高压灭菌处理。</li>
</ol>

<ol><li>Gordo, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+sequencing+of+black+pepper+root+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput sequencing of black pepper root transcriptome.</a> BMC Plant Biology. 12 (1), (2012).</li>
<li>Leonian, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+and+fruit+blight+of+Peppers+caused+by+Phytophthora+capsici+sp.+Nov%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Stem and fruit blight of Peppers caused by Phytophthora capsici sp. Nov.</a> Phytopathology. 12 (9), 401-408 (1922).</li>
<li>Ding, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Priming+maize+resistance+by+its+neighbors%3A+Activating+1%2C4-benzoxazine-3-ones+synthesis+and+defense+gene+expression+to+alleviate+leaf+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Priming maize resistance by its neighbors: Activating 1,4-benzoxazine-3-ones synthesis and defense gene expression to alleviate leaf disease.</a> Frontiers in Plant Science. 6, 830(2015).</li>
<li>Fonseca, C. E. L., Vianda, D. R., Hansen, J. L., Pell, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+among+forage+quality+traits%2C+vigor%2C+and+disease+resistance+in+alfalfa%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+Science%22%5BJournal%5D)">Associations among forage quality traits, vigor, and disease resistance in alfalfa.</a> Crop Science. 39 (5), 1271-1276 (1999).</li>
<li>Altier, N. A., Thies, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+resistance+to+Pythium+seedling+disease+in+Alfalfa+using+a+culture+plate+method%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease%22%5BJournal%5D)">Identification of resistance to Pythium seedling disease in Alfalfa using a culture plate method.</a> Plant Disease. 79 (4), 341-345 (1995).</li>
<li>Pratt, R. G., Rowe, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+simplified+leaf+inoculation+procedures+for+identification+of+quantitative+resistance+to+Sclerotinia+trifoliorum+in+Alfalfa+seedling%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease%22%5BJournal%5D)">Evaluation of simplified leaf inoculation procedures for identification of quantitative resistance to Sclerotinia trifoliorum in Alfalfa seedling.</a> Plant Disease. 82 (10), 1161-1164 (1998).</li>
<li>Hao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+transcriptome+sequencing+of+black+pepper+%28Piper+nigrum+L.%29+and+an+analysis+of+genes+involved+in+phenylpropanoid+metabolism+in+response+to+Phytophthora+capsici%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">De novo transcriptome sequencing of black pepper (Piper nigrum L.) and an analysis of genes involved in phenylpropanoid metabolism in response to Phytophthora capsici.</a> BMC Genomics. 17 (1), 1-14 (2016).</li>
<li>Dong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field+inoculation+and+classification+of+maize+ear+rot+caused+by+Fusarium+verticillioides%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Field inoculation and classification of maize ear rot caused by Fusarium verticillioides.</a> Bio-protocol. 8 (23), 3099(2018).</li>
<li>English, J. T., Laday, M., Bakonyi, J., Schoelz, J. E., Érsek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+molecular+characterization+of+species+hybrids+derived+from+induced+fusion+of+zoospores+of+Phytophthora+capsica+and+Phytophthora+nicotianae%5BTitle%5D)+AND+%22Mycological+Research%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and molecular characterization of species hybrids derived from induced fusion of zoospores of Phytophthora capsica and Phytophthora nicotianae.</a> Mycological Research. 103 (8), 1003-1008 (1999).</li>
<li>Chatterjee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidant+activity+of+some+phenolic+constituents+from+green+pepper+%28Piper+nigrum+L.%29+and+fresh+nutmeg+mace+%28Myristica+fragrans%29%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Antioxidant activity of some phenolic constituents from green pepper (Piper nigrum L.) and fresh nutmeg mace (Myristica fragrans).</a> Food Chemistry. 101 (2), 515-523 (2007).</li>
<li>Pfender, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+sporangia+and+release+of+zoospores+by+Phytophthora+megasperma+in+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Production of sporangia and release of zoospores by Phytophthora megasperma in soil.</a> Phytopathology. 67 (5), 657-663 (1977).</li>
<li>Nagila, A., Schutte, B. J., Sanogo, S., Idowu, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chile+pepper+sensitivity+to+mustard+seed+meal+applied+after+crop+emergence%5BTitle%5D)+AND+%22HortScience%22%5BJournal%5D)">Chile pepper sensitivity to mustard seed meal applied after crop emergence.</a> HortScience. 56 (2), 1-7 (2021).</li>
<li>Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oomycete+broad-host-range+pathogen+Phytophthora+capsica%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsica.</a> Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).</li>
<li>Hardham, A., Gubler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+of+attachment+of+zoospores+of+a+root+pathogen+and+pre-alignment+of+the+emerging+germ+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International+Reports%22%5BJournal%5D)">Polarity of attachment of zoospores of a root pathogen and pre-alignment of the emerging germ tube.</a> Cell Biology International Reports. 14 (11), 947-956 (1990).</li>
</ol>

在本研究中，通过针刺胡椒植株的基部茎段造成损伤，以建立有效的接种体系。随后将菌丝团覆盖于三个刺孔处，以保持湿度并促进病原菌对植株的有效侵染。接种后，植株叶片变黄脱落，最终导致植株死亡。对照植株未出现任何病斑。大多数基因在接种后表现出差异表达 Phytophthora capsici 与对照组相比。真菌病害导致大量作物出现结构和生理紊乱，造成生产力下降以及生产者经济损失。利用组织学技术对真菌侵入和定殖植物组织方式的结构研究，可详细揭示病原体与植物组织之间的相互作用。这些研究揭示了有助于理解病害单循环的重要方面。对感病组织的组织病理学分析表明 Phytophthora capsici 在木质部定殖。该方法为解决传统接种方法（如土壤浇灌或根部浸泡）所引起的不稳定性问题提供了更优的手段。一种有效的接种与精确取样系统 Phytophthora capsici 对胡椒植株上的植物-病原体互作研究至关重要，同时也为农业精准育种中植物与其他土传植物病原体之间作用机制的研究提供了有前景的方法。
同时，该方案为木本藤本植物的培养提供了更高效的参考。...

胡椒（Piper nigrum L.）是一种木质攀援植物，也是最重要的香料作物之一。它被称为“香料之王”1，在亚洲、非洲和拉丁美洲的40多个国家和地区均有种植。由卵菌Phytophthora capsici引起的疫霉根腐病是胡椒最严重的病害。该病原体还可侵染葫芦科植物、茄子、辣椒和番茄2,3。在胡椒种植中，这种病害有时会导致整片作物毁灭。由于缺乏抗病品种，胡椒种植区域的扩展受到限制，这严重阻碍了中国胡椒产业的发展。为了研究胡椒与Phytophthora capsici之间的互作关系，建立有效的接种方法和精确的取样体系至关重要。
种质资源中抗性的鉴定与筛选是研究病原菌致病性以及抗性品种选育和利用的基本前提。目前广泛应用的方法是根据植物种类和病原菌类群采用多种鉴定手段。近年来发展出的鉴定方法包括群体鉴定、个体鉴定、器官鉴定、组织鉴定、细胞鉴定、生化鉴定和分子鉴定等4,5。这些领域已取得一定成果，但也存在诸多问题。无论选择何种方法，植物抗性鉴定的基本要求始终一致，即目标明确、结果可靠，且方法应简便、快速、易于标准化。胡椒抗性鉴定也必须遵循这一原则。
在自然田间条件下，抗病性的鉴定可能受到多种环境因素的影响。因此，建议在实验室中利用离体叶片和灌溉根系来鉴定抗病性。取健康植株的幼嫩叶片进行接种 体外 在实验室中，通过接种病原菌以测定病害叶片面积，从而鉴定植物的抗病性6。然而， 体外 叶片接种仅可用于一般抗性鉴定，不能用于分子互作研究。尽管如此，抗病状态常在灌溉式根部接种中表现，导致后续抗病分子育种研究存在不确定性。因此，快速简便的室内检测方法至关重要。本研究旨在提供一种实验室抗性鉴定方法。

<table><tbody><tr><td>琼脂粉</td><td>Solarbio</td><td>A8190</td><td></td></tr><tr><td>超净工作台</td><td>Haier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Xilong Scientific</td><td>15700501</td><td></td></tr><tr><td>高温灭菌烘箱</td><td>Zaelway</td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Biosharp</td><td>BS-90-D</td><td></td></tr></tbody></table>

一种有效的接种方法 phytophthora capsici 在黑胡椒植株上

An Effective Inoculation Method for Phytophthora capsici on Black Pepper Plants

Piper nigrum L.（黑胡椒）是一种典型的木质藤本植物，是全球重要的经济香料作物。由Phytophthora capsici（辣椒疫霉）引起的根腐病严重影响了黑胡椒的生产，已成为制约产业发展的“瓶颈”问题。然而，黑胡椒抗性分子遗传机制尚不明确，导致新品种培育进展缓慢。建立一种针对黑胡椒植株上Phytophthora capsici的有效接种与精确取样体系，对于研究该植物与病原菌互作至关重要。本研究的主要目的是展示一种详细的方法，即对黑胡椒植株基部茎头进行接种Phytophthora capsici，同时为木质藤本植物的接种提供参考。在接种过程中，先用针刺法损伤黑胡椒植株的基部茎头，随后将菌丝团覆盖于三个刺孔之上，并保持湿润，以利于病原菌充分侵染植株。该方法有效解决了传统接种方法（如灌根法或根部浸泡法）所导致的不稳定性问题，也为研究植物与其它土传植物病原菌之间的互作机制以及农业精准育种提供了有前景的技术手段。

图1显示了胡椒叶片接种P. capsici后的症状。图2显示了胡椒茎部接种P. capsici后的症状。病原菌从茎基部侵染胡椒植株，症状逐渐表现为叶片黄化、萎蔫、木质部褐变以及导管变黑。图3显示，与对照组相比，接种Phytophthora capsici后大多数基因的表达发生差异。图4通过感病组织的组织病理学分析，证实了Phytophthora capsici在木质部中的定殖。
<img alt="CK组与接种组植物叶片的比较；健康状况、抗病性分析、照片展示。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63002/63002fig01.jpg" data...

用针刺穿胡椒植株基部茎头是一种简便且省时的损伤方法。本文提供了通过视频详细展示感染胡椒植株的具体操作步骤。

一种有效的接种方法 Phytophthora capsici 在黑胡椒植株上

胡椒（Piper nigrum L.）是一种典型的木质藤本植物，是全球重要的经济香料作物。黑胡椒的生产是……

以下实验介绍了一种针对胡椒疫霉（Phytophthora capsici）在胡椒植株上的有效接种与精确取样方法。胡椒是一种典型的木质藤本植物，也是一种具有重要经济价值的香料作物。胡椒生产主要受到由胡椒疫霉引起的根腐病影响，严重制约了产业的发展。建立高效的接种方法和精确的取样系统，对研究辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）与胡椒植株之间的植物-病原物互作具有重要意义。本研究的主要目标是展示一种详细的实验方法，即对胡椒植株基部茎头接种辣椒疫霉菌，并为木本藤本植物的接种提供参考依据。该方法能够更好地解决传统接种方法（如土壤浇灌或根部浸泡）所带来的不稳定性问题。实验步骤。将黑胡椒插条种植于受控环境中培养两个月。继代培养辣椒疫霉菌，并在25摄氏度下孵育五天。在接种当天，用针将三个孔固定在琼脂块上，并最终鉴定病害症状。准备用于接种的胡椒插条植株。用无菌刀具和修枝剪将各向异性枝条截成40厘米长、直径0.5厘米的段，去除下部节位的偏生枝条。截取的枝条应保留顶端两个节位和五片叶片，以减少水分流失。将上端修剪为平切口，下端修剪为斜切口。黑胡椒插条的生根基质由土壤和动物粪肥（如牛粪、羊粪等）按1:1的比例混合配制而成。土壤需在约121摄氏度下高压灭菌20分钟。使用直径30厘米、高50厘米的育苗袋盛装生根基质。准备一个50度的斜面以填充基质。将插条以50度角插入，使三个以上的节位于基质以下。用生根介质覆盖插条，其辅助部分应紧贴介质。最后，插条已完全浸透。采用直插法插入插条。辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）培养物的制备。选择无病害的马铃薯。将马铃薯清洗干净并切成小方块。取200克马铃薯放入800毫升的双蒸水中，煮沸20分钟。然后过滤该混合物。加入20克葡萄糖。用双蒸水将混合物体积补至1升。在滤液中加入15克琼脂粉。将培养基分装至烧瓶中，并用Parafilm封口。在121摄氏度下高压灭菌20分钟。将配制好的马铃薯琼脂培养基倒入培养皿中，在无菌台中冷却凝固。接种针经酒精灯火焰灭菌，待其冷却数秒。用无菌接种针取少量真菌样品，置于PDA培养基上。菌丝覆盖了约四分之三的培养皿。培养物已准备好进行后续实验。胡椒的感染。距离基质表面五厘米的位置被视为培养点。培养位置不应离根部过远，以避免延长感染时间。针刺操作的具体步骤如下。使用打孔器采集辣椒疫霉（Phytophthora capsici）的菌丝球。值得注意的是，优先选择培养皿边缘新形成的菌丝球，因其具有较高的侵染活性。用75%乙醇对植株茎部进行表面消毒，并在消毒位置用接种针刺出三个三角形小孔。使用接种针在接种位置戳出三个三角形小孔，并将菌丝团覆盖于这三个小孔上。八小时后，小孔区域整体变为黑色。随着培养时间的延长，小孔的扩张范围逐渐增大。7到10天后，叶片变黄并脱落，直至胡椒植株死亡。代表性结果如下：接种感染后，胡椒植株出现症状，包括叶片黄化、萎蔫、木质部褐变和导管变黑。与对照组相比，接种辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）后，大多数基因的表达发生了差异。对感病组织的组织病理学分析表明，辣椒疫霉菌定殖于木质部。结论：本研究采用针刺茎基部的方法造成损伤，以实现有效的接种，并在黑胡椒中建立了加倍体系。同时，该方案也为孵育过程提供了更高效的参考方法——我们的方法可以节省更多时间，操作也更为简便。本方案能够获得更好的结果，使植物与土传病原菌之间产生较强的互作，便于直观地检测植物与病原菌之间的动态互作过程。在本方法中，我们首先用针刺破胡椒植株基部的茎头，使其受到损伤。随后，将辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）直接覆盖于受损部位，并保持湿润环境，以使病原菌能够侵染植株。我们还为农业精准育种中植物与其他土传植物病原体之间作用机制的研究提供了一种有前景的方法。

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科研

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遗传学

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来源：Rufián, J. S., 等. 植物组织内 Pseudomonas syringae 基因表达的单细胞分析. J. Vis. Exp.

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