Name: 用于合成生物学和天然产物应用的高产 链霉菌 转录翻译工具包 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 了解利用Streptomyces venezuelae无细胞转录翻译系统高效合成重组蛋白的方法。该技术适用于高GC含量基因的异源表达，为合成生物学和天然产物研究提供新工具。

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作者谨此致谢以下研究资助：英国工程与物理科学研究理事会（EPSRC）[EP/K038648/1] 为SJM在PSF处担任博士后研究员提供的资助；威康信托基金会（Wellcome Trust）资助的帝国理工学院ISSF博士后奖学金，由SJM在PSF处获得；英国皇家学会研究基金 [RGS\R1\191186]；威康信托基金会种子奖 [217528/Z/19/Z]，由SJM在肯特大学获得；以及全球挑战研究基金（GCRF）为KC在肯特大学攻读博士学位提供的奖学金。

注意：G YM 培养基和平板琼脂，以及 S30A 和 S30B 洗涤缓冲液的配方见表 1和表 2。
1. 溶液的配制与一般指导
<ol>
	<li>除特别说明外，所有溶液、细胞（培养后）和细胞提取物在制备后均需置于冰上。</li>
	<li>1 M Mg-谷氨酸盐、4 M K-谷氨酸盐、40% (w/v) PEG 6000、1&#160;g/mL 聚乙烯磺酸在室温下保存，其余试剂均保存于 -80 °C。尽量减少冻融次数，以避免化学降解。</li>
	<li>配制能量溶液储备液（见表3），如3-磷酸甘油酸（需调节pH），请参照大肠杆菌（E. coli）TX-TL 实验方案41中的指导进行。 
	注意：所有组分均可完全溶于ddH2O中，并分装后储存于-80 °C冰箱中。</li>
	<li>将单个储备液或能量溶液（后文描述）在冰上解冻。将氨基酸储备液在42 °C下涡旋加热约15–30分钟，以充分溶解所有氨基酸。</li>
	<li>由于部分氨基酸（L-Cys、L-Tyr、L-Leu）在冰上易析出沉淀，因此在尽量减少静置时间的前提下，将该溶液置于室温，并使用涡旋振荡器助溶。</li>
	<li>按照计算好的体积（表3）加入储备液和水，使用涡旋振荡器充分混匀。</li>
	<li>将能量溶液分装为每管20–100 µL（或按需分装），在冰上操作，分装后储存于-80 °C，待后续使用。</li>
</ol>
2. S. venezuelae ATCC 10712 细胞的制备
<ol>
	<li>第1天——培养基/缓冲液制备及过夜预培养
	<ol>
		<li>按照表1所述，在2 L带挡板的锥形瓶中制备1 L无菌GYM液体培养基。设备/化学品/试剂来源见材料表。</li>
		<li>按照表1所述，在250 mL锥形瓶中制备50 mL无菌GYM液体培养基。</li>
		<li>配制100 mL 1 M HEPES-KOH（pH 7.5）、100 mL 1 M MgCl2 和500 mL 4 M NH4Cl 溶液，用于制备1 L S30A和1 L S30B洗涤缓冲液。配方见表2。</li>
		<li>准备过夜预培养。将装有50 mL无菌GYM液体培养基的250 mL锥形瓶于28 °C预热30分钟。</li>
		<li>从GYM琼脂平板上挑取一单菌落的S. venezuelae ATCC 10712（或相关菌株），接种至预热的50 mL GYM液体培养基中，于28 °C、200 rpm条件下培养16小时（过夜预培养）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第2天——制备日间预培养及主培养。
	<ol>
		<li>将250 mL锥形瓶中的50 mL无菌GYM液体培养基于28 °C预热30分钟。</li>
		<li>取1 mL过夜预培养液转移至预热的50 mL GYM液体培养基中，于28 °C、200 rpm条件下培养8小时（日间预培养）。</li>
		<li>此阶段培养结束后，使用1 mL（光程1 cm）塑料比色皿，在分光光度计中以无菌GYM培养基1:10稀释样品测定OD600。 
		注：OD600应至少达到3–4。若生长不良，建议重复步骤2.2.1–2.2.2。</li>
		<li>取0.25 mL日间预培养液接种至2 L带挡板锥形瓶中的1 L液体GYM培养基中。</li>
		<li>于28 °C、200 rpm条件下振荡培养过夜，持续14小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第3天——收集细胞
	<ol>
		<li>前一培养阶段（14小时）结束后，记录主培养液的OD600。用新鲜GYM培养基将过夜培养物稀释1:10后测定OD600。 
		注：此时OD600应达到3.0–4.0。</li>
		<li>若OD600&#60;3.0，将摇床转速提高至250–300 rpm，继续培养至OD600达到3.0，额外培养时间不超过2小时（总计16小时）。</li>
		<li>若OD600&#62;3.0，将培养物转移至离心容器中，并在湿冰上快速冷却30分钟。</li>
		<li>在等待细胞培养物于冰上冷却期间，按表1所述配制4 mL新鲜的1 M二硫苏糖醇（DTT）、S30A和S30B缓冲液，并置于冰上保存。化学试剂来源见材料表。</li>
		<li>预先称重一个空的50 mL离心管，并预冷至-20 °C。</li>
		<li>在冰上向1 L S30A缓冲液中加入2 mL 1 M DTT，并充分混匀。 
		注：DTT仅在使用前加入S30A和S30B洗涤缓冲液中。</li>
		<li>于6,000 × g、4 °C条件下离心10分钟，小心地一次性快速弃去上清液。 
		注：若沉淀被扰动，可保留少量GYM培养基以最大限度保留细胞，并继续后续操作。</li>
		<li>加入500 mL S30A缓冲液，通过剧烈振荡离心瓶使细胞重悬，直至细胞团块均匀分散。</li>
		<li>于6,000 × g、4 °C条件下离心6分钟，小心弃去上清液。 
		注：尽管此时细胞沉淀更紧密，但仍会有一些细胞保留在悬液中（见图1）。按步骤2.3.7所述处理，并尽可能保留更多细胞。</li>
		<li>重复步骤2.3.8–2.3.9。</li>
		<li>在冰上向1 L S30B缓冲液中加入2 mL 1 M DTT，充分混匀。向细胞中加入500 mL S30B缓冲液，重复步骤2.3.9。</li>
		<li>用10 mL S30B缓冲液重悬细胞沉淀，并转移至已称重并预冷的50 mL离心管中。如有需要，可用额外5–10 mL S30B缓冲液转移残留细胞，并用S30B缓冲液定容至50 mL。</li>
		<li>于6,000 × g、4 °C条件下离心10分钟，小心弃去上清液。</li>
		<li>重复步骤2.3.13。</li>
		<li>用100–200 µL移液器小心吸除残留的S30B上清液。</li>
		<li>称量湿细胞沉淀的重量。 
		注：1 L过夜GYM培养液（OD600 = 3.0）的典型湿细胞沉淀重量约为4.5 g。</li>
		<li>每1 g湿细胞加入0.9 mL S30B缓冲液。使用巴斯德移液管或涡旋振荡器重悬细胞。</li>
		<li>短暂离心（约10秒），离心力不超过500 × g，使细胞沉淀。 
		注：本方案可在此处暂停，细胞可用液氮或干冰速冻后于-80°C保存。安全提示：操作液氮时请穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括面罩和手套。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 通过超声处理裂解细胞以获得粗细胞提取物
注意：在此阶段，用户可以选择将细胞悬浮液分装为1 mL的等分试样（方案1），或在50 mL离心管中以较大体积（5 mL）的细胞悬浮液进行超声破碎（方案2）。由于在前期收获和洗涤步骤中可能损失细胞，导致细胞悬浮液的最终体积发生变化，因此以下详细说明了两种方案，以确保实验可重复性。新用户应首先尝试方案2.1，以建立实验流程。
<ol>
	<li>通过分次超声处理1 mL样品进行细胞裂解
	<ol>
		<li>使用1 mL移液枪头（将枪头末端剪掉以增大孔径），将1 mL细胞悬液转移至2 mL微量离心管中。 
		注意：若细胞为冷冻状态，应在细胞裂解前将装有沉淀的50 mL离心管迅速置于温水中解冻。一旦沉淀开始融化，立即将离心管转移至冰水混合物中，并冷却10分钟。</li>
		<li>将每根微量离心管放入盛有冰水的烧杯中，使用塑料试管架固定试管以进行超声处理。 
		注意：由于细胞提取物对过热敏感，必须确保试管温度不升高，以防止蛋白质沉淀和酶活性降低。</li>
		<li>使用直径为3 mm的超声探头，并用70%（v/v）乙醇和双蒸水（ddH2O）清洗探头。将超声探头插入细胞悬液中，使其位于液面下约1 cm处。</li>
		<li>在超声仪中设置以下参数：20 kHz频率，65%振幅，脉冲开启时间10秒，脉冲关闭时间10秒，总超声时间1分钟。</li>
		<li>运行超声程序。在前两个间歇周期中上下及横向移动试管，确保细胞均匀裂解。记录能量输入。 
		注意：出于安全考虑，超声过程中应佩戴适当的听力保护装置。随着细胞破裂，悬液黏度会降低，原本呈浅乳白色的湿细胞沉淀应转变为均一的棕褐色液体。推荐每毫升湿细胞的能量输入为240 J。若细胞仅部分裂解，悬液仍呈乳白色，并可见黏稠的细胞团块，尤其在试管壁上更为明显。</li>
		<li>将试管倒置2–3次，并额外重复一次或两次10秒的超声循环，频繁混匀，直至细胞完全破裂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过超声处理5 mL细胞悬液进行细胞裂解
	<ol>
		<li>若细胞为冷冻状态，在细胞裂解前将装有沉淀的50 mL离心管在温水中边摇动边快速解冻。一旦沉淀开始融化，立即将离心管转移至冰水混合物中，并冷却10分钟。</li>
		<li>以500 × g短暂离心以沉淀细胞。</li>
		<li>将50 mL离心管放入盛有冰水的烧杯中进行超声处理。 
		注意：由于细胞提取物对过热敏感，必须确保试管温度不升高，以防止蛋白质沉淀和酶活性降低。</li>
		<li>使用直径为6 mm的超声探头，并用70%（v/v）乙醇和ddH2O清洗探头（参见图1中6 mm探头的示意图）。将超声探头插入约5 mL的细胞悬液中，使其位于液面下约1 cm处。</li>
		<li>在超声仪中设置以下参数：20 kHz频率，65%振幅，脉冲开启时间10秒，脉冲关闭时间10秒，每毫升湿细胞总超声时间为1分钟（总计5分钟）。</li>
		<li>运行超声程序。在前两个间歇周期中上下及横向移动试管，确保细胞均匀裂解。 
		注意：出于安全考虑，超声过程中应佩戴适当的听力保护装置。随着细胞破裂，悬液黏度会降低，原本呈浅乳白色的湿细胞沉淀应转变为均一的棕褐色液体。记录能量输入。建议每毫升湿细胞输入240 J的最优能量（5分钟超声总计约1200 J）。</li>
		<li>若仍有部分细胞未裂解，请参照步骤3.1.5的指导进行操作。</li>
		<li>将细胞提取物转移至2 mL微量离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 细胞提取物澄清及释放反应
<ol>
	<li>将裂解的细胞在 4 °C 条件下以 16,000 × g 离心 10 分钟，以去除细胞碎片。将上清液转移至 1.5 mL 微量离心管中，每管分装 1 mL。</li>
	<li>对细胞提取物进行释放反应。将含有细胞提取物的 1.5 mL 离心管置于 30 °C 的加热块或培养箱中孵育 60 分钟，期间不振荡。</li>
	<li>将细胞提取物在 4 °C 条件下以 16,000 × g 离心 10 分钟。将上清液收集至一个 15 mL 离心管中。通过轻轻倒置管子 5 次使上清液混合均匀，随后置于冰上。轻柔倒置以避免产生气泡。</li>
	<li>用 S30B 缓冲液将 10 µL 细胞提取物稀释 100 倍，并使用 Bradford 法测定总蛋白浓度，技术重复三次（Bradford 法操作指南参见补充材料 S2）。</li>
	<li>若蛋白浓度为 20–25 mg/mL，则将细胞提取物以每管 100 µL 分装至新的 1.5 mL 离心管中，液氮速冻后于 -80 °C 保存。 
	注意：出于安全考虑，操作液氮时应穿戴适当的个人防护装备，包括面罩和手套。</li>
	<li>若蛋白浓度&#60;20 mg/mL，则需重复粗提物制备步骤，以确保获得高质量的细胞提取物，且转录-翻译（TX-TL）产量与先前发表的研究结果相当5。</li>
</ol>
5. 质粒DNA模板的制备
<ol>
	<li>使用适当的质粒DNA纯化试剂盒，按照制造商说明书，从在50 mL LB培养基（含100 mg/mL羧苄青霉素）中新鲜转化并培养的E. coli质粒菌株（DH10β、JM109）中纯化pTU1-A-SP44-mScarlet-I质粒（pUC19复制起点）。</li>
	<li>用2 × 300 µL无核酸酶水洗脱质粒，并合并洗脱液。</li>
	<li>加入0.1倍体积（66 μL）的3 M乙酸钠溶液（pH 5.2）。</li>
	<li>加入0.7倍体积（462 μL）异丙醇。</li>
	<li>将DNA在-20 °C下孵育30分钟。</li>
	<li>在4 °C下以16,000 × g离心30分钟，弃去上清液。</li>
	<li>向DNA沉淀中加入2 mL 70%（v/v）乙醇。</li>
	<li>倒置离心管3–4次，以重悬质粒DNA沉淀。</li>
	<li>在4 °C下以16,000 × g离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>重复步骤5.7–5.9，彻底去除所有可见液体。</li>
	<li>将DNA沉淀在空气中干燥10–30分钟，或使用真空离心浓缩仪干燥5分钟。</li>
	<li>用600 µL无核酸酶的ddH2O重悬干燥的沉淀。</li>
	<li>使用分光光度计测定DNA浓度和纯度。</li>
	<li>分装成50–100 µL的等份，于-20 °C保存。 
	&#8203;注意：由于无细胞反应体系对体积限制较严格，建议使用高浓度DNA（500–1000 ng/µL）。将质粒DNA原液稀释至80 nM；168 ng/µL的pTU1-A-SP44-mScarlet-I 质粒相当于80 nM。</li>
</ol>
6. 准备 链霉菌属 主混合液（SMM）溶液
<ol>
	<li>氨基酸溶液
	<ol>
		<li>使用氨基酸样品试剂盒，以避免人为操作误差并缩短制备时间，请遵循在线提供的制造商说明进行操作。</li>
		<li>用ddH2O将20倍浓度的氨基酸储备液稀释至终浓度为6 mM（5 mM L-Leu）。</li>
		<li>在2.4x SMM溶液中进一步稀释至2.4 mM（2 mM L-Leu）（见表3）。 
		&#8203;注意：在TX-TL反应中的最终浓度为19种氨基酸各1 mM，L-Leu为0.83 mM。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>能量溶液及添加剂
	<ol>
		<li>根据表3中所述配方，配制2.4x SMM溶液中的其他组分。</li>
		<li>或者，根据表3中所述配方配制2.4x 最小能量溶液（MES）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 建立标准的 S. venezuelae TX-TL 反应体系
<ol>
	<li>将细胞提取物、SMM （或 MES）溶液和质粒 DNA 置于冰上解冻。将 384 孔板预先冷却至 -20 °C。</li>
	<li>配制 TX-TL 反应体系，其中质粒 DNA 占总体积的 25%，细胞提取物占 33.33%，SMM 溶液占 41.67%；反应体系需保持在冰上，以避免起始时间偏差。 
	注：已提供标准 TX-TL 反应模板（表 4），可根据反应数量计算所需试剂体积。33 µL 反应体系的标准体积如下：11 µL 细胞提取物、13.75 µL SMM 溶液和 8.25 µL 质粒 DNA。</li>
	<li>以低速轻轻涡旋混合物约 5 秒，确保溶液均匀。避免产生泡沫或气泡。</li>
	<li>将 10 µL 反应液分装至 384 孔板的三个孔中，设置技术重复三次，避免引入气泡。用透明封板膜密封后，在 400 × g 条件下离心 5 秒。</li>
	<li>将反应体系在 28 °C 下孵育，可选择在恒温培养箱（用于终点读数）或酶标仪中进行，无需振荡。 
	注：反应通常需要 3–4 小时完成。有关酶标仪使用及 mScarlet-I 标准测量的指导，请参见补充材料 S2。</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文描述了一种高产的 S. venezuelae TX-TL 协议，其操作步骤详细且简便，无论是有经验的还是初次使用 TX-TL 系统的研究人员均可轻松实施。为了建立一种最简化但高产的 S. venezuelae TX-TL 协议5,26，本研究移除了现有 Streptomyces45 和 E. coli TX-TL41 协议中的多个步骤。推荐的工作流程是确保 S. venezuelae 在选定的丰富培养基中快速生长，以便能够在傍晚接种最终培养物。这样可在次日早晨收获处于生长高峰期的细胞，并允许&#160;研究人员在同一天内完成细胞收获和活性细胞提取物的制备。通过遵循这一简化的操作流程，预计单个研究人员可在三天内方便地完成整个实验。此外，还提供了一套配套的质粒工具包，用于支持 S. venezuelae TX-TL 系统...

无细胞转录-翻译（TX-TL）系统为合成生物学提供了一个理想的原型构建平台，可用于实现快速的设计-构建-测试-学习循环，这是合成生物学的概念性工程框架1。此外，人们日益关注在开放反应环境中利用TX-TL系统进行高价值重组蛋白的生产2，例如在抗体-药物偶联物中引入非标准氨基酸3。具体而言，TX-TL需要细胞提取物、质粒或线性DNA以及能量溶液，以在批处理或半连续反应中催化蛋白质合成。尽管大肠杆菌（Escherichia coli）TX-TL是目前占主导地位的无细胞系统，但多种新兴的非模式TX-TL系统也因其在不同应用中的潜力而受到关注4,5,6,7,8。TX-TL的关键优势包括灵活的可扩展性（纳升级至升量级）9,10、高度可重复性以及自动化工作流程8,11,12。特别是，TX-TL的自动化可加速对遗传元件和调控元件的表征8,12,13。
在反应体系设置方面，TX-TL 需要主要和次要能源，以及氨基酸、辅因子、添加剂和模板 DNA 序列。核苷三磷酸（NTPs）提供主要能源，用于驱动初始的 mRNA（ATP、GTP、CTP 和 UTP）和蛋白质合成（仅需 ATP 和 GTP）。为了提高 TX-TL 的产量，NTPs 通过次级能源的分解代谢进行再生，例如麦芽糖14、麦芽糊精15、葡萄糖14、3-磷酸甘油酸（3-PGA）16、磷酸烯醇式丙酮酸17 和 L-谷氨酸18。这种内在的代谢活性具有惊人的多功能性，但在新兴的 TX-TL 系统中却研究甚少。每种能源在 ATP 产率、化学稳定性和成本方面都具有不同的特性和优势，这对于放大的 TX-TL 反应是一个重要的考量因素。迄今为止，针对 E. coli TX-TL 的现有方案已达到模型绿色荧光蛋白（GFP）产量高达 4.0 mg/mL（约 157 µM），所用次级能源为 3-PGA（30 mM）、麦芽糊精（60 mM）和 D-核糖（30 mM）的混合物19。
近年来，人们对在TX-TL系统中研究次级代谢产物生物合成途径的兴趣日益增加20,21,22具体而言，放线菌是次级代谢产物的重要来源，包括抗生素和农用化学品23,24其基因组富含所谓的生物合成基因簇（BGCs），这些基因簇编码次级代谢物生物合成的酶促途径。为了研究放线菌的遗传元件和生物合成途径，已开发出一系列 链霉菌属基于 TX-TL 的系统 recently been developed5,6,25,26. 这些特化的 链霉菌属 TX-TL系统可能具有以下优势：[1] 为来源于天然环境的酶提供天然的蛋白质折叠环境 链霉菌属 种（spp.）26；[2] 拥有适用于高G+C含量（%）基因表达的优化tRNA库；[3] 活跃的初级代谢，可能被利用以提供生物合成前体；以及[4] 来自天然细胞提取物中次级代谢所产生的酶、前体或辅因子。&#160;因此，高产率 S. venezuelae TX-TL 工具包 recently been established to harness these unique capabilities5.
Streptomyces venezuelae 是一种在工业生物技术领域具有悠久历史的新兴合成生物学宿主5,27,28,29，同时也是研究放线菌（Actinobacteria）细胞分裂和基因调控的模式系统30,31,32。&#160;该菌的主要模式菌株 S. venezuelae ATCC 10712 拥有相对较大的基因组（8.22 Mb），G+C 含量为 72.5%（登录号：CP029197），编码 7377 个编码序列、21 个 rRNA、67 个 tRNA 以及 30 个生物合成基因簇27。在合成生物学中，S. venezuelae ATCC 10712 是异源表达生物合成途径的理想底盘菌株。与其他大多数 Streptomyces 菌株不同，它具备多项关键优势，包括快速的倍增时间（约 40 分钟）、丰富的遗传与实验工具5,28、无菌丝结团现象，以及可在液体培养基中产孢28,33。已有多个研究证明，S. venezuelae 可用于异源生产多种多样的次级代谢产物，包括聚酮类化合物、核糖体合成肽类和非核糖体肽类34,35,36,37,38。这些综合特性使该菌株成为合成生物学与代谢工程应用中极具吸引力的微生物宿主。尽管 S. venezuelae 目前尚非异源基因表达的主导 Streptomyces 模式菌株，但随着进一步发展，其在天然产物&#160;发现领域具备广泛应用前景。
本文提供了一种高产率 S. venezuelae TX-TL 系统的详细实验方案（图1），该方案是在先前已发表的原始方案26基础上进行更新和优化的。本研究中，通过优化能量溶液和反应条件，在标准质粒 pTU1-A-SP44-mScarlet-I 的基础上，使用4小时、10 μL的小批量反应体系，可使报告蛋白 mScarlet-I 的蛋白产量达到最高260 μg/mL。该质粒经过专门设计，可用于多种蛋白表达检测方法。本方案还进一步简化了操作流程，同时优化了能量系统，在不降低蛋白产量的前提下，降低了无细胞反应体系构建的复杂性和成本。结合优化后的 TX-TL 系统，还开发了一套遗传元件文库，可用于精细调控基因表达，并作为荧光工具实时监测 TX-TL 反应过程，从而为链霉菌属（Streptomyces spp.）及相关放线菌的基因表达原型构建和天然产物生物合成途径研究提供了一个多功能平台。
本研究推荐使用标准质粒（pTU1-A-SP44-mScarlet-I），可用于在新实验室中建立S. venezuelae的TX-TL工作流程，该质粒可在AddGene获取（见补充表S1）。pTU1-A-SP44-mScarlet-I为用户提供了研究其他开放阅读框（ORF）的灵活性。mScarlet-I ORF经过密码子优化，适用于S. venezuelae中的基因表达。SP44启动子是一个强组成型启动子，在E. coli和Streptomyces spp.中均具有高活性39。该质粒含有两个独特的限制性内切酶位点（NdeI、BamHI），可用于将新的ORF与C端FLAG标签及荧光砷发夹（FlAsH）结合标签系统进行同框亚克隆。或者，在亚克隆新基因后加入终止密码子，可同时去除这两个标签。利用该基础载体，已成功实现了多种蛋白的高效表达，包括土霉素生物合成途径中的蛋白以及来自Streptomyces rimosus的一种功能未表征的非核糖体肽合成酶（NRPS）（图2）。在mRNA检测方面，pTU1-A-SP44-mScarlet-I标准质粒在3'非翻译区包含一个dBroccoli适配体，可用于与3,5-二氟-4-羟基亚苄基咪唑啉酮（DFHBI）探针进行检测。为进一步提高灵活性，一组与EcoFlex40兼容的MoClo元件也已在AddGene上提供，包括一个与EcoFlex兼容的Streptomyces穿梭载体（pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP）以及一系列表达超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）、mScarlet-I、mVenus-I和β-葡萄糖醛酸酶（GUS）的pTU1-A-SP44变体质粒。其中，pSF1C-A质粒源自pAV-gapdh28，并已消除BsaI/BsmBI位点，适用于MoClo组装。pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP与EcoFlex40中的pTU1-A-RFP/pTU2-A-RFP等效，但额外具备通过phiC31整合酶系统在Streptomyces spp.中实现接合转移和染色体整合的功能28。
本方案的第一阶段包括培养 S. venezuelae ATCC 10712 菌株或与其密切相关的菌株，在对数生长中期收获细胞，进行细胞洗涤，并在 S30A 和 S30B 缓冲液中平衡。该阶段需要三天时间，细胞培养期间可同时准备后续所需的其他组分，具体步骤如下所述。收获的细胞随后通过超声处理裂解，澄清后进行跑脱反应（run-off reaction）。在提取物制备的最后阶段，可将细胞提取物分装并储存在 -80 °C，以长期保存并最大限度减少活性损失。在使用本方案组装 TX-TL 反应时，推荐采用链霉菌主混合液（Streptomyces Master Mix, SMM），也可选择最小能量溶液体系（Minimal Energy Solution, MES），后者可获得相当的产量。此外，建议从 -80 °C 甘油保藏菌种中将新鲜的 S. venezuelae ATCC 10712 菌株划线接种至 GYM 琼脂平板，于 28 °C 培养至少 48–72 小时，直至可见单菌落。后续所有步骤均应使用新鲜培养的菌种。

<table><tbody><tr><td>2.5 L 超高产量摇瓶</td><td>Thomson</td><td>931136-B</td><td></td></tr><tr><td>3-磷酸甘油酸（3-PGA）（&gt;93%）</td><td>Sigma</td><td>P8877</td><td></td></tr><tr><td>384 孔黑底透明底板</td><td>ThermoFisher</td><td>10692202</td><td></td></tr><tr><td>氯化铵（98%）</td><td>Fluorochem</td><td>44722</td><td></td></tr><tr><td>ATP、CTP、UTP、GTP（100 mM 溶液，&gt;99%）</td><td>ThermoFisher</td><td>R0481</td><td></td></tr><tr><td>羧苄青霉素（联系供应商确认纯度）</td><td>Melford</td><td>C46000-25.0</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖（联系供应商确认纯度）</td><td>Melford</td><td>G32040</td><td></td></tr><tr><td>DFHBI（&amp;ge;98%，HPLC）</td><td>Sigma</td><td>SML1627</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）（联系供应商确认纯度）</td><td>Melford</td><td>MB1015</td><td></td></tr><tr><td>FlAsH-EDT&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;（联系供应商确认纯度）</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-363644</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖-6-磷酸（&gt;98%）</td><td>Sigma</td><td>G7879</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 游离酸（联系供应商确认纯度）</td><td>Melford</td><td>B2001</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酸半镁盐四水合物（&gt;98%）</td><td>Sigma</td><td>49605</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁（98%）</td><td>Fluorochem</td><td>494356</td><td></td></tr><tr><td>麦芽提取物</td><td>Sigma</td><td>70167-500G</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇-6000（PEG-6000）</td><td>Sigma</td><td>807491</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 96 孔微透析板，10K 分子量截留（MWCO）</td><td>ThermoFisher</td><td>88260</td><td></td></tr><tr><td>聚（乙烯硫酸）钾盐</td><td>Sigma</td><td>271969</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酸钾（&gt;99%）</td><td>Sigma</td><td>G1149</td><td></td></tr><tr><td>RTS 氨基酸混合物试剂盒</td><td>5 Prime</td><td>2401530</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（99%）</td><td>Fluorochem</td><td>94554</td><td></td></tr><tr><td>Supelclean LC-18 SPE C-18 固相萃取柱（1 g）</td><td>Sigma</td><td>505471</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Melford</td><td>Y1333</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>BMG</td><td>Omega</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于合成生物学与天然产物研究的高效 streptomyces 转录-翻译工具包

A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications

Streptomyces 属是临床抗生素和工业化学品的重要来源。Streptomyces venezuelae ATCC 10712 是一种生长迅速的菌株，天然可产生氯霉素、嘉德霉素和匹克罗霉素，因此是下一代合成生物学底盘的理想候选&#160;菌株。因此，开发能够加速 S. venezuelae ATCC 10712 以及其他 Streptomyces 属模式菌株发展的遗传工具，对于天然产物的工程化改造与发现具有重要意义。为此，本方案提供了一种专用于 S. venezuelae ATCC 10712 的无细胞系统，以实现高 G+C (%) 基因的高效异源表达。该方案适用于在96孔或384孔板中进行小规模（10–100 μL）的批处理反应，且反应体系具有可放大的潜力。该无细胞系统性能稳定，在最简配置下即可实现多种重组蛋白的高产量表达（约 5–10 μM）。本研究还整合了一套广泛的质粒工具集，可用于实时监测 mRNA 和蛋白质的合成，以及对带标签蛋白进行凝胶内荧光染色。该方案还可与高通量&#160;基因表达表征工作流程相结合，或用于研究放线菌基因组中高 G+C (%) 基因编码的酶促通路。

本详细方案仅供参考，旨在帮助用户建立一种 链霉菌属 基于TX-TL系统的 S. venezuelae ATCC 10712 模式菌株（图1）。用户可能希望研究其他 链霉菌属s菌株；然而，对于其他具有较长倍增时间或不同生长偏好的菌株，其生长/收获阶段需要进行个性化优化，以获得最佳结果。在代表性结果中，来自pTU1-A-SP44-mScarlet-I 标准质粒（图2 和 图3) 已优化以在其中实现高效表达 S. venezuelae 采用多种检测方法（SDS-PAGE、荧光）的TX-TL系统。此外，该标准质粒经过改造，用于展示一系列次级代谢酶的合成 S. rimosus (图2)5最后，展示了一个放大规模的天然产物生物...

本方案详细介绍了从委内瑞拉链霉菌（Streptomyces venezuelae）无细胞转录-翻译（TX-TL）系统中高效合成大量重组蛋白的改进方法。

一种用于合成生物学与天然产物研究的高效 Streptomyces 转录-翻译工具包

链霉菌属（Streptomyces spp.）是临床抗生素和工业化学品的重要来源。委内瑞拉链霉菌（Streptomyces venezuelae）ATCC 10712 是一种生长迅速的菌株，且是一种……

本方案为委内瑞拉链霉菌无细胞转录-翻译提供了一种简化的操作流程。该系统利用了这种非模式生物的代谢酶和代谢通路。其主要优势包括：可实现高GC含量基因的异源表达，提供有利于蛋白质正确折叠的环境，以及具备可对生物合成通路进行精细调控的开放性系统。我们的方法将为研究链霉菌及相关高GC细菌开辟新的机遇。该方法可用于研究这些细菌中的酶和基因表达。该技术已针对新用户的使用便捷性进行了优化开发。唯一需要前期经验或熟悉操作的步骤是超声处理，以制备高活性的粗提物。从第三天开始收获预培养的细胞，将过夜培养物用新鲜GYN培养基按1:10的比例稀释，用于在600纳米处测定光密度（OD）。如果培养物在600纳米处的OD值低于0.3，则将摇床转速提高至每分钟250至300转，并继续培养至OD值达到0.3。继续培养的时间不得超过两小时。如果 OD 超过 0.3，则将培养物转移至离心容器中，并在湿冰上快速冷却 30 分钟。在等待细胞培养物冷却的同时，准备 4 毫升新鲜的 1 摩尔二硫苏糖醇、S30A 和 S30B 缓冲液，并将其置于冰上保存。称量一个空的50毫升离心管后，将其在-20摄氏度预冷。将2毫升1摩尔的二硫苏糖醇加入1升冰上预冷的S30A缓冲液中，并充分混匀。在4摄氏度下，以6,000 ×g离心细胞10分钟。快速弃去上清液后，加入250毫升S30A缓冲液，通过剧烈振荡离心管使细胞团块均匀分散。随后再次离心6分钟。离心后，弃去上清液，重复加入S30A缓冲液，再进行离心，操作如前所述。接下来，将两毫升一摩尔的 DTT 加入到冰上的一升 S30B 缓冲液中，并充分混匀。向细胞中加入 250 毫升 S30B 缓冲液，并重复离心。用 10 毫升 S30B 缓冲液重悬细胞沉淀，然后将细胞悬液转移至已预冷并预先称重的 50 毫升离心管中。如有需要，用额外的 5 至 10 毫升 S30B 缓冲液转移残留细胞，并用 S30B 缓冲液将管内体积补足至 50 毫升。离心 10 分钟。弃去上清液，并按照之前的设置重复离心操作，如图所示。弃去上清液后，用100至200微升移液器吸除残留的S30B上清液，并称量湿细胞沉淀的质量。每1克湿细胞加入0.9毫升S30B缓冲液。使用巴斯德移液管或涡旋振荡器重悬细胞。短暂离心约10秒，最高500 G，以沉淀细胞。将超声波破碎仪探头插入细胞悬液中，直至探头位于液面下约1厘米处。在超声波破碎仪设置中输入不同的参数。将频率设置为 20 kilohertz，振幅设置为 65%，脉冲开启和关闭时间均为 10 秒，总超声处理时间为 1 分钟。开始超声处理，并在前两个间歇周期中上下及水平移动离心管，以确保细胞均匀接受超声处理。若细胞未完全裂解，将离心管颠倒 2 至 3 次，并重复进行额外 1 至 2 个 10 秒的超声周期，期间频繁混匀，直至细胞完全破碎。离心裂解后的细胞以去除细胞碎片，然后将上清液转移至1.5毫升微量离心管中，每份体积为1毫升。对于细胞提取物的反应体系，将含有细胞提取物的反应管置于30°C的金属浴或培养箱中孵育60分钟，不进行振荡。对于转录-翻译反应，将细胞提取物SMM或MES溶液以及质粒DNA置于冰上解冻。将384孔板预先冷却至零下20摄氏度。在冰上配制转录-翻译反应体系，其中质粒DNA占体积的25%，细胞提取物占33.33%，SMM溶液占41.67%。轻轻涡旋混合物约5秒，使用低速设置，以确保溶液均匀，同时避免产生泡沫或气泡。将三份10微升的样品等分转移至384孔板中的三个孔中，作为技术重复，注意避免引入气泡。使用透明封板膜密封后，以400 × g离心5秒，并将反应在28 °C下于培养箱或酶标仪中孵育，不进行振荡。链霉菌（Streptomyces venezuelae）无细胞转录-翻译系统已优化，可用于从pTU1-A-SP44标准质粒高效表达荧光蛋白，以及通过凝胶电泳检测生物合成酶。采用多种方法检测了pTU1-A-SP44-mScarlet-I标准质粒的表达水平。通过dBroccoli RNA适体对mRNA进行实时荧光检测，利用FlAsH标记系统对未成熟mScarlet-I蛋白进行检测，并对成熟mScarlet-I蛋白进行了检测。此外，还使用FlAsH标记对mScarlet-I进行凝胶内荧光染色，同时对无细胞总蛋白进行考马斯亮蓝染色。采用该方法后，可对使用常规手段难以研究的酶和代谢通路进行活性测定。该方法还可拓展应用于放大规模的生物合成及高通量基因表达研究。我们正在开发这一技术，以用于研究高GC含量细菌中的代谢酶。我们已展示了该系统在无细胞反应中研究放大生物合成的潜力。

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Bioengineering

生物工程

用于合成生物学和天然产物应用的高产 链霉菌 转录翻译工具包

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