Name: 冷冻切片解剖成人室管膜下区，用于准确和深入的定量蛋白质组分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: 学习冷冻切片解剖技术，用于精确分离小鼠脑室神经发生微环境并进行深度定量蛋白质组分析。该方法可识别神经发生调控因子，适用于多种物种及健康与疾病状态的研究。

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我们诚挚感谢 Mathias Mann 允许我们在其实验室完成大部分实验，感谢 Fabian Coscia 在激光显微切割和蛋白质组分析方面的帮助，感谢 Tatiana Simon-Ebert 进行整体解剖，以及 Korbinian Mayr 和 Igor Paron 提供的技术支持。我们衷心感谢德国研究基金会对 MG 的资助（SFB870，TFR274）、欧盟（Eranet S-700982-5008-001）、欧洲研究理事会（ERC，对 MG 的 aERC &#34;NeuroCentro&#34; 项目）、瑞典医学研究学会（SSMF，对 JK 的博士后资助）以及卡罗林斯卡学院基金会和基金（2020-01351，对 JK）的支持。

本研究中的所有实验操作均遵循德国及欧盟相关指南，并经机构动物护理委员会和上巴伐利亚政府（Regierung von Oberbayern）批准。实验仅使用8至10周龄的雄性C57Bl6小鼠。
1. 小鼠脑组织的制备（每只小鼠约 15 分钟）
<ol>
	<li>通过向500 mL的1×Hank's平衡盐溶液（HBSS）中加入5 mL的1 M HEPES（终浓度为10 mM），制备解剖液。 
	注意：解剖液的保存时间（+4 °C）不应超过2周。</li>
	<li>通过颈椎脱位处死小鼠，并小心解剖出脑组织。 
	注意：在研究细胞外基质（ECM）时，应尽可能保持组织未受修饰。颈椎脱位可使解剖时间最短化，从而最大限度地减少死后酶介导的自消化。如果去除血液对研究问题至关重要，可在取出脑组织前经心脏灌注磷酸盐缓冲盐水（PBS）。</li>
	<li>通过手动解剖取出脑组织，并将其置于含有冰上预冷解剖液的培养皿中（图1B - 1）。 
	注意：在整个解剖过程中，应始终将脑组织保存在冰上的解剖液中。</li>
	<li>使用解剖刀切除嗅球（OB）（图1B - 2），在嗅球与大脑皮层前极之间进行一次直线冠状切口。</li>
	<li>使用解剖刀进行冠状切口，切除皮层前极，使侧脑室在冠状面上可见（图1B - 3）。 
	注意：确保冠状切口位于视交叉前方约5 mm处；否则，侧脑室下区/中脑室下区（SEZ/MEZ）的前部将丢失。</li>
	<li>使用剪刀从顶部打开双侧侧脑室，首先从皮层表面向脑室腔进行矢状切开，然后沿脑室弯曲方向以C形延长切口（图1B - 4）。</li>
	<li>使用剪刀通过额外的冠状切口连接左右两侧矢状切口的尾端。 
	注意：这三个切口现形成一个梯形，有助于下一步去除覆盖侧脑室的皮层和胼胝体。</li>
	<li>使用镊子去除覆盖侧脑室的皮层和胼胝体（图1B - 5）。随后，去除覆盖内侧脑室壁的皮层和胼胝体。若组织附着于内侧脑室壁，可进行额外切口，或直接用剪刀轻轻提起皮层和胼胝体以分离组织。</li>
	<li>用镊子小心撑开脑室壁（图1B - 6），并用镊子去除脉络丛。 
	注意：彻底去除脉络丛非常重要，以避免干扰后续解剖步骤，并防止SEZ/MEZ样本受到潜在污染。</li>
	<li>将脑组织置于载玻片上，并将载玻片放置于干冰上以快速冷冻脑组织，同时保持脑室壁处于打开状态。 
	注意：应确保侧脑室的外侧壁与内侧壁之间有足够的距离，以便精确且特异性地解剖SEZ和MEZ。若组织回缩至闭合状态，应在冷冻过程中使用镊子将脑室壁固定在理想位置。避免对SEZ/MEZ造成任何损伤，尽量仅在打开的脑室顶部边缘施加最小力度。</li>
</ol>
2. 准备好的脑组织切片（每只小鼠约 15 分钟）
<ol>
	<li>使用冷冻切片机将脑组织切成50-100 µm厚的冠状切片，直至侧脑室末端，并将切片贴附于玻璃载玻片上。确保脑组织通过OCT包埋剂固定在冷冻切片机的底板上时，仅后脑部分与OCT接触，前脑部分尤其是脑室区域不得接触OCT。 
	注意：OCT包埋剂会干扰质谱（MS）检测。然而，若组织将用于抗体检测，则无需避免使用OCT包埋剂。不推荐使用涂层载玻片，因为涂层施加的粘附力过强，会阻碍后续步骤中组织样本从载玻片转移到微量离心管中。</li>
</ol>
3.&#160;脑切片的徒手解剖（每只小鼠约 30 分钟）
<ol>
	<li>将带有脑切片的玻片置于解剖显微镜下的干冰上（图1C - 1）。</li>
	<li>将微量离心管预先放置在干冰上，并确保其在样本转移前至少在干冰上冷却1分钟，以达到足够低温。 
	注意：请使用高质量的微量离心管，因为某些低质量的离心管可能在后续与质谱检测相关的组织消化步骤中释放塑料颗粒。</li>
	<li>将切片从干冰上取出15–30秒，使其短暂且不完全解冻，从而使纹状体中致密的髓鞘呈现为致密的白色小点，便于观察。 
	注意：此时可清晰辨认室管膜下区（SEZ）与纹状体之间的边界（图1C - 2，参见 图2A 以了解髓鞘排除情况及与整体组织染色法的比较）。若解冻时间过长，可通过戴手套的手指轻压玻片背面来加速解冻过程，但该操作需经过练习，因过度解冻极易发生。</li>
	<li>使用预冷的手术刀将室管膜下区（SEZ）从相邻的纹状体中分离（图1C，D）。</li>
	<li>使用冷却手术刀的钝边，将SEZ整体或切成2–4部分后转移至微量离心管中。若组织将用于质谱（MS）以外的其他分析类型，则应将组织样本转移至相应的容器中（例如96孔板）。 
	注意：完全冻结状态下切割组织可能导致组织迅速碎裂并从玻片脱落；而完全解冻后切割则会导致组织崩解。请确保组织既非完全冻结，也非完全解冻。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无竞争利益

CSD 方法能够精确提取 SEZ 组织，并利用质谱技术生成具有显著深度的可靠蛋白质组。与整体解剖法相比，CSD 在显著减少 SEZ 样本中纹状体污染以及富集细胞外蛋白方面具有明显优势。由于使用 CSD 和整体解剖法在单个样本中可检测到相似数量的蛋白质（每个样本约 6,500 种蛋白质），因此 CSD 所需的额外时间是完全值得的。激光显微切割（LCM）虽可实现更精确的 SEZ 解剖，但其蛋白质组深度较低，尽管采用了与 CSD 相同的质谱方案（文库匹配和无标记定量），每个样本仅检测到约 3,500 种蛋白质。更重要的是，其样本间变异性显著更高，这可能归因于每个样本的制备时间延长了八倍。对 LCM 和 CSD 所获样本进行主成分分析（PCA）显示，两种方法之间存在明显分离，且各自具有紧密、稳健的区域特异性聚类。相比之下，LCM 样本的分布更为分散，这可能部分归因于其较长的制备时间。目前尚不清楚，若在更长时间内收集大量样本，LCM 是否能获得与 CSD 相当的蛋白质组稳健性和深度。据估算，收集与 CSD 相当的样本量，LCM 所需时间将长达 5 至 8 倍；若包括用于肽段谱图文库制备的样本，则可能长达 15 倍，且其中大部分操作需在组织解冻条件下进行。此外，考虑到 LCM 所需的额外组织处理步骤（背景染色、激光切割）对组织造成的干扰，LCM 相较于 CSD 几乎未带来任何实质性优势。因此，CSD 可被视为更适合细胞外蛋白质组研究的方法，尤其是针对 SEZ 的研究。
值得注意的是，如果目标区域小于侧脑室下区（SEZ）（例如仅研究室管膜细胞层），则徒手操作的精确性将低于激光显微切割（LCM）。例如，使用徒手解剖分离（CSD）将室管膜层与室下层分开较为困难，因为室管膜层仅有一个细胞直径的宽度，且在新鲜冷冻组织中，其与室下层之间的界限肉眼不可见。因此，当对小于50 µm尺度的精确解剖的需求高于保持组织完整性或缩短解剖时间时，激光显微切割（LCM）将是优于徒手解剖分离（CSD）的选择。然而，对于宽度达到或超过50 µm的区域，CSD在细胞外基质蛋白分析中的精确度可与LCM相媲美。
CSD 已被证明在研究细胞外基质（ECM）于神经发生微环境中的功能作用方面具有实用价值25。因此，在SEZ中持续应用CSD进行各种蛋白质和蛋白质组研究（甚至单细胞核RNA测序），可能有助于发现更多的神经发生调控因子、干细胞活化标志物，并加深对SEZ干细胞微环境生理机制的理解。考虑到衰老SEZ中神经发生的减少37，对老年与年轻小鼠SEZ的ECM变化进行精确分析，可能促进对支持神经干细胞（NSC）发育和维持的微环境机制的深入理解38,39。此外，炎症和损伤对SEZ神经发生的影响已有充分报道40,41,42,43。皮质脑损伤后，血液来源的纤维蛋白原在SEZ中富集，并影响SEZ的星形胶质细胞生成及瘢痕形成44&#160;，这凸显了创伤诱导的微环境变化对SEZ干细胞生理功能的潜在影响。因此，利用CSD结合脑损伤模型研究SEZ-ECM蛋白质组，有助于阐明损伤和炎症影响神经发生的机制。重要的是，该方法也可应用于人类健康与疾病状态下脑内神经发生微环境的研究，因为手术中常可获得新鲜冷冻组织。此外，鉴于成体神经发生在不同物种间的差异，将CSD方法应用于其他物种（例如与纹状体神经发生相关的情况）也将具有重要意义。同时，结合其他蛋白质检测方法，可利用CSD对SEZ和MEZ中局部产生的生长因子差异进行准确且&#160;高效的分析（例如ELISA法）。
最后，该解剖步骤也可进行适当修改，以精确提取其他脑区组织，适用于与神经发生无关的研究问题。例如，在CSD方法中包含一个短暂的半解冻步骤，此时致密的髓鞘呈现为白色区域，与较为透明的残余脑组织明显区分。通过对该方法进行简单改进，可利用这一特征精确分离胼胝体的致密髓鞘组织，进而用于损伤相关变化的蛋白质组学分析。若要实现胼胝体的分离，建议对实验方案进行如下修改：省略步骤1.5至1.9，不打开脑室以暴露SEZ和MEZ，而是直接制备冠状切片。随后将切片置于干冰上，短暂提起并进行半解冻处理，然后用解剖刀直接切除胼胝体。此样本制备完成后，即可用于任何需要高效分离天然胼胝体组织的分析实验。
综上所述，本研究提出了一种可用于可靠分析心室神经发生微环境蛋白质组的显微解剖方法。实验数据强调了CSD方法与基于质谱的SEZ微环境蛋白质组学分析之间的兼容性与实用性。精确性、高效性以及对组织扰动最小化等特点，使CSD成为现有方法的一项有价值的补充。

由于成年大脑中的神经发生受到限制，深入了解成年神经元替代的机制将极大促进各种中枢神经系统修复策略的发展。啮齿类动物帮助我们理解了出生后神经发生的基本机制，但需要注意的是，成年神经发生具有显著的物种依赖性。在小鼠中，存在三个成年神经干细胞（NSC）生态位。下丘脑是一个具有神经发生潜能的成年神经干细胞生态位1,2，而持续的成年神经发生主要局限于海马体3&#160;以及侧脑室侧壁的室管膜下区（SEZ）4,5,6。SEZ是最大的生发区域，其中包含神经干细胞（B型细胞），这些细胞通过过渡性增殖前体细胞（C型细胞）发育为成神经细胞（A型细胞）。SEZ中包含20-35%的B型细胞、1-15%的C型细胞、1-30%的A型细胞以及25-50%的室管膜细胞7。SEZ具有复杂的微细结构，内皮细胞、小胶质细胞和室管膜细胞存在于该区域并影响干细胞生态位8,9,10。尽管SEZ中神经元数量稀少，但来自远端区域（如纹状体、腹侧被盖区或下丘脑）的轴突可延伸至此并影响B型细胞4。这一干细胞生态位的一个独特特征是增殖部位与分化部位的空间分离。在增殖后，神经前体细胞从SEZ迁移数毫米至嗅球，在那里终末分化为神经元并整合到已有的神经回路中。对与神经发生相关的细胞内在程序的研究，已为实验性治疗中的细胞重编程和移植策略提供了重要知识15,16,17,18,19,20。然而，细胞外在信号也调控神经发生，组织微环境可决定干细胞的神经发生命运11,12,14,21,22,23。因此，研究神经发生生态位的微环境及其与干细胞的相互作用具有至关重要的意义。
细胞外基质（ECM）及其他分泌蛋白是微环境的重要组成部分。由于转录组与蛋白水平在ECM方面相关性较低，因此在准确鉴定和定量方面，蛋白质组学方法比转录组学方法更适合确定ECM的组成24,25。此外，有大量证据表明，SEZ中的微环境调控因子并非完全由占据该微环境本身的细胞产生。较远的区域（如脉络丛）可通过脑脊液向干细胞传递分泌的调节信号22,23。鉴于细胞外微环境的相当一部分由蛋白质构成，研究微环境的蛋白质组有助于识别存在于微环境中的调控因子，而不论其合成部位如何。
为了收集小鼠室管膜下区组织用于无偏倚的蛋白质组学分析，需要一种高精度的方法，以捕获约50 µm厚、含有干细胞的室旁带状结构，同时排除邻近纹状体组织的污染。此外，在解剖过程中必须尽量减少对组织的扰动，以便分析细胞外微环境，因为可溶性蛋白（包括生长因子或细胞因子）容易被冲洗掉。尽管可以对固定后的组织进行质谱分析，但所使用的固定剂（如多聚甲醛）会降低蛋白质鉴定的深度，并可能引入翻译后修饰。常规的整体室管膜下区（SEZ）解剖方法（例如用于收集细胞进行荧光激活细胞分选分析）通常使用剪刀将整个SEZ切除26。这种标准解剖方法速度快，对组织扰动较小，但无法避免纹状体组织的污染。相比之下，激光显微切割（LCM）具有极高的解剖精度优势，但可能因背景染色或激光导致的蛋白质变性而引入组织扰动。为了结合整体解剖与LCM的优点，开发了一种适用于质谱分析的新方法——冷冻切片解剖法（cryo-section-dissection, CSD）（图1A-D）。CSD可用于提取SEZ组织，并可进一步分离侧脑室内侧壁的室管膜下区（MEZ），后者是SEZ的理想对照区域，几乎不具备神经发生能力（见实验方案）。通过CSD与前沿质谱技术联合获得的干细胞微环境蛋白质组已被证明在鉴定成年神经干细胞（NSC）微环境中新的调控因子方面具有重要价值25。因此，该方法将有助于确定SEZ组织的蛋白质组成。

<table><tbody><tr><td>冷冻切片机 CM3050S</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont no. 5SF 镊子，Inox 超细尖端</td><td>Fine Science Tools</td><td>货号 11252-00</td><td></td></tr><tr><td>汉克&amp;rsquo;含 CaCl 的平衡盐溶液&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 和 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Invitrogen</td><td>货号 24020</td><td></td></tr><tr><td>HEPES缓冲液（1 M）</td><td>Invitrogen</td><td>货号 15630</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>RS France</td><td>货号 BPB018</td><td></td></tr><tr><td>安全锁扣管，PCR 级洁净，2.0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>货号 0030123344</td><td></td></tr><tr><td>弹簧剪，Vannas-Tubingen 5 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>货号 15003-08</td><td></td></tr><tr><td>一次性手术刀片</td><td>B. Braun</td><td>货号 5518083</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 组织培养皿</td><td>Greiner Bio-One</td><td>cat. no. 633180</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 二抗（488，555）（1/1,000）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>货号 A-11001</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>货号 D9542</td><td></td></tr><tr><td>豚鼠多克隆抗-DCX 1:500</td><td>Millipore</td><td>货号 AB2253，</td><td></td></tr><tr><td>小鼠单克隆抗GFAP抗体 1:500</td><td>Sigma</td><td>货号 G3893</td><td></td></tr><tr><td>小鼠单克隆抗MAG 1:400</td><td>Millipore</td><td>货号 MAB1567</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 版本 9</td><td>GraphPad Software，美国加利福尼亚州圣地亚哥</td><td></td><td>www.graphpad.com</td></tr><tr><td>Perseus 版本 1.6.10.50</td><td>德国巴伐利亚慕尼黑马克斯·普朗克生物化学研究所</td><td></td><td>https://maxquant.net/perseus/</td></tr><tr><td>ZEN成像软件</td><td>卡尔·蔡司</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

成年小鼠室管膜下区冷冻切片显微解剖用于精确深度定量蛋白质组分析

Cryo-section Dissection of the Adult Subependymal Zone for Accurate and Deep Quantitative Proteome Analysis

室管膜下神经发生微环境由侧脑室侧壁的室管膜旁带状结构组成。室管膜下区（SEZ）是一个纤细而明确的区域，直接暴露于脑室及脑脊液中。分离该微环境可用于分析神经发生性干细胞的微环境特征。然而，小量组织的提取为蛋白质组学分析带来了挑战。&#160;具有挑战性，尤其是在维持较大测量深度和实现可靠稳健性方面。为应对这些挑战，开发了一种名为冷冻切片显微解剖（cryo-section-dissection, CSD）的新方法，该方法兼具高精度和对组织扰动最小的优点。该方法可与先进的质谱（mass spectrometry, MS）技术兼容，从而能够检测丰度较低的微环境调控因子。本研究将CSD及其蛋白质组数据与激光捕获显微切割（laser-capture-microdissection, LCM）以及标准全组织解剖法所获得的方法和数据进行了比较。与LCM相比，CSD在不到一半的制备时间内实现了两倍的定量深度，同时在解剖精度上显著优于全组织解剖法。因此，CSD是用于获取侧脑室下区（SEZ）进行蛋白质组分析的更优方法。

按照上述步骤操作后，微量离心管中的组织样本即可用于且兼容质谱（MS）样本制备。样本制备完成后，每只小鼠的SEZ或MEZ样本可获得约5–7 μg的肽段。然而，最终肽段产量可能因MS制备方法的不同而有所差异。在以下蛋白质组比较中，通过将肽段质谱数据与为各组织区域建立的肽段质谱文库进行计算匹配，显著提高了蛋白质鉴定与定量的深度（每个样本可鉴定500–1,000种蛋白质）25,27。值得注意的是，本研究用于构建肽段质谱文库的无损纳米分级方法目前尚未商业化。原始质谱数据使用MaxQuant软件进行分析28，质量精度可达十亿分之一级别29。MaxQuant环境支持不同质谱运行之间的数据匹配。蛋白质丰度采用非标记定量算法进行量化30。免疫组织化学染色在新鲜冷冻组织上进行，操作方法如先前报道所述25（见材料表）。
冷冻切片显微切割 
采用冷冻切片显微切割法（CSD）获取成年小鼠（n = 4）完整的室下区（SEZ）和中缘区（MEZ）（见图1及实验方案）。使用手术剪分离体感皮层（Cx）。另取4只小鼠以相同方式解剖，但将每个区域的组织合并为一个样本，用于构建蛋白质组文库（共鉴定出10,923种蛋白质），以提高个体样本中蛋白质的鉴定与定量能力25。在4个独立样本中，SEZ平均定量到6,673 ± 317.4种蛋白质，MEZ平均定量到6,747 ± 37.7种蛋白质。所有质谱蛋白质组学数据均已提交至ProteomeXchange联盟，通过其合作存储库PRIDE31进行共享，本文所报道的蛋白质组数据登录号为ProteomeXchange: PXD016632（http://proteomecentral.proteomexchange.org）。
与整体解剖法的比较 
整体解剖法按照标准方案进行26。与CSD方法相比，整体解剖法检测到的蛋白质数量相似（SEZ约6,000种，Cx约6,000种，每组n = 4）25。采用CSD方法而非整体解剖法对SEZ进行取材的预期改进之一是减少可能的纹状体污染。若SEZ样本中混入其他脑区组织，则无法准确归因所检测到的候选蛋白，因为显著富集可能来源于目标区域或污染区域。免疫组织化学结果显示，在整体解剖样本中可观察到纹状体富含髓鞘的内囊区域呈髓鞘相关糖蛋白（MAG）阳性，但在CSD样本中极少出现（图2A）。通过比较SEZ与体感皮层（Cx）灰质（GM）样本中髓鞘相关蛋白的富集情况，可进一步证实整体解剖样本中存在纹状体污染（图2B）。需注意的是，Cx GM的大部分区域，尤其是上层皮层，是无髓鞘化的32。
当粗大的纤维束穿过纹状体时，该区域的污染导致与大脑皮层（Cx）相比，髓鞘蛋白富集。在SEZ样本中，用于标记纹状体污染的髓鞘蛋白包括髓鞘碱性蛋白（MBP）、髓鞘相关糖蛋白（MAG）、蛋白脂质蛋白1（Plp1）以及2',3'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶（Cnp）。所有这些髓鞘标记蛋白在SEZ中的富集程度均显著高于大脑皮层（Cx）。相反，在CSD数据集中对这四种髓鞘标记蛋白进行比较时，SEZ与大脑皮层（Cx）之间未显示出显著差异（图2B）。纹状体的蛋白质组学数据33支持以下假设：在整体解剖（wholemount dissection）获得的SEZ样本中，髓鞘蛋白的富集是由纹状体组织污染所致。因此，与整体解剖相比，CSD方法在很大程度上避免了富含致密髓鞘的纹状体组织的污染。
对未解离组织进行无偏倚的蛋白质组分析可以揭示有趣的细胞外蛋白。通过使用CSD改进解剖方法，与整体组织样本相比，样本中显著富集了与细胞外相关的蛋白质（图2C，注释富集检验）。CSD与整体组织解剖在基因本体（GO）术语“细胞外囊泡外泌体”和“细胞外区域组分”的富集程度上具有可比性。然而，“基质体相关”（Matrisome-associated）这一GO术语在CSD样本中的富集程度略高于整体组织解剖样本。相应地，利用CSD方法发现，与大脑皮层（Cx）相比，室下区（SEZ）中富含细胞外基质交联酶及 recently discovered 神经发生调控因子——转谷氨酰胺酶-2（Tgm2）25。相比之下，在采用整体组织解剖获得的SEZ与Cx样本之间则未观察到差异（图2D）。纹状体的蛋白质组数据33支持这一推论：整体组织解剖法对神经发生调控因子Tgm2的检测受到纹状体组织污染的阻碍。因此，总体而言，冷冻切片解剖法（cryo-section-dissection）是对标准解剖方法在特定微环境蛋白质组分析中的一项成功且必要的改进。
与激光显微切割技术的比较 
从3只成年小鼠获取了SEZ的前半部分和MEZ用于激光显微切割（LCM）（图3A）。总体而言，LCM方法存在一些缺点，特别是在组织扰动和操作效率方面。为了在解剖显微镜下观察目标区域，需要进行背景染色，这可能会洗脱感兴趣的微量或可溶性蛋白，例如生长因子、细胞因子或酶类等细胞外基质调控分子。此外，在激光切割过程中，载玻片在室温下暴露的时间长短不一。而且，激光本身也可能导致目标蛋白发生变性。
与激光显微切割（LCM）相比，手工显微解剖（CSD）在完成解剖所需的时间和工作量方面具有显著优势：本方案的第1步对CSD和LCM均需以相似方式执行；若缺少此步骤，心室壁组织将仍然附着，导致脑室下区（MEZ）与侧脑室区（SEZ）样本难以分离。由于CSD切片厚度（100 µm）是LCM切片最大厚度34（15 µm）的6-7倍，因此第2步（脑组织切片）和第3步（从每张冠状切片中分离MEZ和SEZ）在LCM中至少需要多出6-7倍的时间。此外，LCM所需的背景染色及激光显微镜的设置也将消耗额外时间。本研究中，采用LCM获取3只动物50%的SEZ和MEZ所需时间，是采用CSD获取4只动物100% SEZ和MEZ所需时间的三倍，表明CSD在操作速度上具有八倍的优势。综上所述，LCM不仅需要显著更多的操作投入，而且组织样本还需经历更长时间的操作处理和温度变化，这些因素可能影响后续分析所得数据的动态特征和可靠性。
将CSD的质谱结果与激光捕获显微切割（LCM）的结果进行比较。两个数据集均比对至通过合并CSD样本构建的蛋白质组文库。平均而言，LCM在侧脑室下区（SEZ）和内侧脑室区分别鉴定出3,441 ± 270.0和3,613 ± 238.7种独特蛋白质（图3B）。鉴于蛋白质鉴定数量存在显著差异，主成分分析（PCA）显示不同分离方法之间具有明显的分离趋势（主成分1：62.7%，未显示）。主成分2在LCM样本中对SEZ和MEZ显示出最大的分离度（8.5%，图3C）。主成分3似乎也能区分LCM与CSD样本；然而，这种差异可能源于方法学本身的差异，而非鉴定出的蛋白质数量差异（6.4%）。尽管如此，冷冻切割数据的整体区域分离效果仍极为显著，明显优于LCM。这种数据动态的差异可能源于激光切割过程中样本在室温下暴露时间的不同，或小量组织在后续蛋白质组学流程及质谱检测中对实验变异性更高的敏感性。
为了寻找细胞外基质（ECM）蛋白质组谱的差异，对室下区（SEZ）和脑膜下区（MEZ）进行了CSD与LCM方法之间的二维注释富集分析（图3D）。通过计算LCM与CSD样本之间GO术语的相对富集程度，可以在组织量不等及解剖方案存在差异的情况下，比较两种方法所获得的ECM蛋白簇的相对蛋白质组动态。分析结果表明LCM与CSD之间具有良好的相关性。两种方法和区域中，“细胞外区域组分”和“细胞外膜结合细胞器”这两个注释项的富集程度相似。因此，LCM更高的时间成本并未带来对ECM相关蛋白相对更高的检测灵敏度。相反，在比较神经发生相关及SEZ相关ECM蛋白Tgm2、血小板反应蛋白-4（Thbs4）、S100a6和腱生蛋白-C（Tnc）的样本数据时，CSD方法表现出更稳健的鉴定与定量能力（图3E）。以TnC为例，尽管在所有样本中均被定量检测到，但仅CSD方法显示出SEZ相对于MEZ的富集趋势。然而，SEZ相关的基底膜蛋白Nidogen-1（Nid1）、层粘连蛋白β-2亚基（Lamb2）以及基底膜特异性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白（Hspg2）35在LCM样本中于SEZ（相较于MEZ）的富集程度甚至比CSD样本更为显著（未展示）。因此，CSD方法能够在合理的时间范围内提供组织样本，实现对SEZ准确且深度的定量蛋白质组分析，同时无需担忧组织完整性受损或蛋白质丢失问题。
统计学分析 
统计检验、二维注释富集检验以及主成分分析（PCA）均在 Perseus 软件环境中完成。若某种蛋白质在至少一个样本中每种方法均检测到有效值，则该蛋白质被纳入分析。蛋白质丰度及数量比较通过数据分析软件进行可视化（参见材料表）。蛋白质比较采用基于置换的错误发现率（FDR）控制方法（FDR 设定为 0.05，随机化次数为 250 次）。对于二维注释富集检验36，所展示的 GO 条目为显著富集的条目（采用 Benjamini-Hochberg FDR 控制方法，FDR 设定为 0.02）。
<img alt="脑解剖过程及SEZ/MEZ识别；神经发生相关的示意图与显微镜结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63047/63047fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：冷冻切片解剖法（Cryo-Section-Dissection）。（A）感兴趣区域的概览：侧脑室，包含具有神经发生能力的SEZ和无神经发生能力的MEZ。神经前体细胞经Dcx免疫染色标记。（B）逐步移除侧脑室上方的嗅球（OB）、大脑前极、皮层、胼胝体以及脉络丛：1. 将组织置于解剖液中；2. 移除嗅球；3. 移除皮层前极；4. 对脑室顶部进行矢状切口；5. 移除脑室顶部；6. 展开脑室壁。（C）新鲜冷冻小鼠脑组织的100 µm冠状切面，（1）移除脑室壁前与（2）使用冰冻解剖刀移除脑室壁后。比例尺 = 4 mm（D）侧脑室冠状切片的染色结果（GFAP：绿色；DAPI：蓝色），显示通过CSD法分离出的SEZ与MEZ。比例尺 = 300 µm（A），200 µm（D）。缩略语：CSD = 冷冻切片解剖法；SEZ = 室管膜下区；MEZ = 内侧室管膜区；Dcx = Doublecortin；OB = 嗅球；GFAP = 胶质纤维酸性蛋白；DAPI = 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63047/63047fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="CSD 方法，髓鞘蛋白丰度图，SEZ 与全组织对照，MAG 微观图像，DAPI 染色" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63047/63047fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2: 与整体解剖相比，冷冻切片解剖具有更高的解剖精度。 (A) 通过全组织解剖获得的SEZ样本的免疫组织化学图像（左）。通过MAG染色（绿色）显示富含髓鞘的纹状体组织的存在). 使用CSD分离的SEZ染色（右)在CSD中，几乎所有纹状体髓鞘（MAG染色，绿色）均被排除在样本条带之外。细胞核使用DAPI（蓝色）进行可视化). (B) SEZ 与 Cx 组织全片（MBP：p = 0.0074；MAG：p = 0.0016；Plp1：p = 0.0011；CNP：p = 0.0029）及 CSD（MBP：p = 0.0667；MAG：p = 0.0236；Plp1：p = 0.3420；CNP：p = 0.1842）中髓鞘标记物富集程度的比较。C) 比较全组织SEZ样本与CSD-SEZ样本的二维注释富集分析。在CSD数据中，GO术语“细胞外空间”和“基质相关”（Matrisome-associated）的富集程度高于全组织数据。DNSC 调控因子 Tgm2 的蛋白丰度25 对全组织解剖样本和CSD样本进行绘图分析。在CSD样本中，Tgm2在SEZ中的富集程度显著高于Cx（CSD：p = 0.0029；全组织：p = 0.1775）。对于 B 和 D：参考Sharma等人的蛋白质组数据33 纹状体和皮层的测量结果已针对全脑样本和CSD样本中显示的相应蛋白进行绘制。比例尺 = 200 µm (A缩写：CSD = 冷冻切片显微切割；SEZ = 室管膜下区；MAG = 髓鞘相关糖蛋白；Cx = 体感皮层；MBP = 髓鞘碱性蛋白；Plp1 = 蛋白脂质蛋白1；CNP = 2',3'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶；GO = 基因本体；NSC = 神经干细胞；Tgm2 = 转谷氨酰胺酶2；DAPI = 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚；LFQ = 无标记定量 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63047/63047fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="激光显微切割与冷冻切片解剖的分离精度比较；蛋白质组分析、数据对比、MEZ与SEZ结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63047/63047fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：与激光捕获显微切割相比，冷冻切片解剖可提高细胞外蛋白质的定量效果。（A）侧脑室在激光捕获SEZ和MEZ前后（左）的焦油紫染色结果。作为对比，右侧显示冷冻切片解剖（CSD）对SEZ和MEZ的切割情况。比例尺 = 150 µm。（B）CSD与LCM方法获得的SEZ和MEZ样本中检测到的蛋白质数量比较。数据以均值 ± 标准差表示。（C）基于CSD与LCM样本的SEZ和MEZ主成分分析（主成分2：解释方差的8.5%；主成分3：解释方差的6.4%）。（D）冷冻切片解剖与激光显微切割获得的MEZ（上）和SEZ（下）的二维注释富集分析。基因本体（GO）术语“细胞外细胞器”和“细胞外区域组分”显著富集（红点）。（E）LCM样本（Tnc: p = 0.3789）和CSD样本（Tgm2: p = 0.2940；S100a6: p = 0.0218；THBS4: p = 0.3941；Tnc: p = 0.0004）中SEZ相关细胞外标志蛋白在SEZ与MEZ中的丰度。（缩写：CSD = 冷冻切片解剖；LCM = 激光捕获显微切割；SEZ = 室管膜下区；MEZ = 内侧室管膜区；GO = 基因本体；Tnc = Tenascin-C；Tgm2 = 转谷氨酰胺酶2；S100a6 = S100钙结合蛋白A6；THBS4 = 血小板反应蛋白-4；LFQ = 无标记定量）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63047/63047fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

冷冻切片显微切割技术可对小鼠大脑中最大的神经发生微环境进行新鲜冷冻制备，用于深度定量蛋白质组学分析。该方法精确、高效，且对组织扰动极小，因此非常适用于研究该微环境以及其他器官、区域和物种的分子微环境。

室管膜下神经发生微环境由侧脑室侧脑室壁的室管膜旁带状结构组成。室管膜下区……

我们的解剖方法能够精确分离脑室神经发生微环境，因此非常适合研究该微环境的分子特征。该解剖方法的主要优势在于其精确、高效，且对组织扰动极小，同时仍可兼容质谱法进行蛋白质组分析。在本方案中，我们从小鼠脑中提取脑室的神经发生微环境，但该方法也可应用于其他物种以及不同健康和疾病状态下的组织样本。该技术可能需要一定的训练，尤其是在暴露和提取心室下区神经发生 niche 时使用手术刀进行切割的操作。安乐死一只 8 至 10 周龄的 C57 black/6 雄性小鼠后，通过手动解剖取出脑组织，并将其置于含有冰上预冷的解剖液的培养皿中。使用解剖刀，在嗅球与大脑皮层内侧极之间做一个垂直于冠状面的直线切口，以切除嗅球。接着，再做一个冠状切口以切除大脑皮层的前极，确保在冠状面上可见侧脑室。然后，使用剪刀从顶部打开双侧侧脑室，先从大脑皮层表面开始沿矢状面切至脑室腔。沿脑室弯曲以C形方式延长此切口。接着，通过一条额外的冠状切口连接左右矢状切口的尾端。然后，去除覆盖在内侧脑室壁上的皮层和胼胝体。如果组织附着在侧脑室的内侧壁上，则需用剪刀进行额外的剪切，或抬起大脑皮层和胼胝体以松解该组织。然后，使用镊子去除覆盖侧脑室的大脑皮层和胼胝体。用镊子小心地撑开脑室壁，并取出脉络丛。然后，将脑组织置于载玻片上，并将载玻片放置于干冰上，使脑室壁处于开放状态时快速冷冻脑组织。切片前，需确保脑组织通过冷冻组织包埋介质固定在恒冷箱切片机的附着板上，固定位置为后脑。此外，需注意包埋介质不得接触前脑，尤其是脑室区域。然后，将脑组织切成50至100微米厚的冠状切片，直至侧脑室末端，并将切片贴附于载玻片上。将载玻片置于解剖显微镜下的干冰上。将切片从干冰上取下15至30秒，使其短暂且不完全地解冻，从而使纹状体致密的髓鞘呈现为致密的白色小点，便于观察。然后，使用预冷的解剖刀，将室管膜下区与相邻的纹状体分离，并用冷却解剖刀的钝边将其整体或切成两至四部分转移至微量离心管中。接着对内侧脑室区进行相同操作。通过免疫组织化学染色，在整体样本中可观察到纹状体中与髓鞘相关、糖蛋白阳性的内囊结构，但在冰冻切片解剖样本中则很少见。通过与体感皮层样本相比，脑室下区髓鞘蛋白富集，证实了整装样本中存在纹状体污染。相比之下，在冷冻切片显微切割样本中，这些髓鞘标志蛋白在脑室下区与体感皮层样本之间无显著差异。在比较冷冻切片显微切割与激光显微切割的质谱结果时，尽管组织采集时间大约延长了一倍，激光显微切割所获得的定量蛋白数量仅为前者的一半左右。主成分分析显示，采用激光显微切割采集的样本（以方形表示）之间的变异性大于采用冷冻切片显微切割采集的样本（以圆形表示）之间的变异性。对室管膜下区和内侧室管膜区的冷冻切片显微切割与激光显微切割进行二维注释富集分析，结果显示两种方法和两个区域在与细胞外空间相关的蛋白质方面具有相似的富集程度。冷冻切片显微切割能够更可靠地鉴定和定量室管膜下区相关细胞外基质蛋白中的神经发生相关蛋白。对于tenascin-C而言，只有冷冻切片显微切割法显示出在室管膜下区相较于内侧室管膜区的富集。确保载玻片上的脑切片不会完全解冻。总体而言，为获得稳定一致的结果，建议熟练掌握解剖步骤。该解剖方法也可与其他能够灵敏检测极低丰度蛋白质（如生长因子和细胞因子）的蛋白质分析方法联用。这种显微解剖方法使我们成功鉴定出一种新的神经发生调控因子，我们相信它也将帮助其他研究者在不同背景下发现更多参与神经发生的调控因子。

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