原代人类鼻上皮细胞模型的采集、扩增与分化及其用于纤毛搏动频率的定量分析

我们描述了从鼻黏膜采集气道干细胞的方法。这些细胞在实验室中被扩增并分化为假复层上皮。这种体外扩增与分化过程类似于体内气道的结构，即包含如纤毛细胞等特化细胞，可用于定量分析纤毛摆动频率。

为了在不同个体之间以及在不同药物作用下对纤毛搏动频率进行一致且可重复的定量分析，我们对培养条件和图像采集进行了标准化。纤毛搏动频率的测量已被用作原发性纤毛运动障碍等疾病的临床工具。我们希望将其确立为囊性纤维化的临床标志物。

演示该操作的是来自我实验室的博士生 Katelin Allan 和 Laura Fawcett，以及我实验室的博士后研究员 Sharon Wong 博士。首先，让受试者通过口腔呼吸。然后，用优势手持取细胞刷，并将小指置于受试者的下巴上以固定手部，将细胞刷以与受试者面部呈 45 度角的方向插入其鼻腔，并通过鼻道推进。

将刷子旋转至直立，使其与受试者面部垂直，然后轻柔但稳固地将刷子向前推进，抵住下鼻甲下方的鼻腔侧壁，直至到达下鼻甲中后部。将刷子旋转360度，最多三次。然后反向撤回刷子，轻柔地逆向退出，以避免细胞从刷子上脱落。

将刷子放入盛有鼻腔细胞收集液的预装收集管中，并将收集管置于冰上。轻轻涡旋震荡以使细胞从刷子上脱落，随后将收集管放回冰上并转移至生物安全柜中。使用血清移液管将收集管中的液体转移至新的离心管中，留下细胞刷。

然后离心样品。离心后，用一毫升条件重编程细胞培养基重悬细胞沉淀。接着使用五毫升血清移液管，将细胞以环形运动方式通过置于50毫升管上方的细胞筛。

为获得单细胞悬液，从管底收集悬液，反复通过细胞筛多次。然后弃去细胞筛。将细胞充分混匀（避免产生气泡），确保细胞均匀悬浮后，接种到已准备好的通透性支持膜插入物上，以培养气道上皮细胞。

然后将150微升细胞悬液加入已准备好的可渗透支持膜插入物的顶端。为了在气液界面处分化气道上皮细胞，使用分化培养基（即ALI培养基）培养细胞两天。随后吸除培养基，并仅向基底室加入750微升ALI培养基，以形成气液界面。

为了在ECM凝胶滴中接种气道上皮细胞，用适当体积的90% ECM重悬解离的气道上皮细胞。然后将移液枪垂直持握（90度角），尽可能靠近孔底，将50微升细胞-ECM悬液滴加至孔的中央。将培养板置于37摄氏度孵育20分钟，直至ECM凝固。

在细胞外基质（ECM）凝固的同时，将气道类器官接种培养基（AOSM）升温至室温，以防止其加入后导致ECM圆顶重新液化和解体。孵育结束后，沿孔壁缓慢加入500微升预热的AOSM至每个孔中。切勿将培养基直接吹打到ECM圆顶上。

每两天更换一次培养基，持续四到七天。吸除培养基时，将培养板倾斜至45度角，从远离ECM凝胶 dome 的孔底边缘处吸取。四到七天后，通过向每孔加入500微升预热的气道类器官分化培养基（AODM）启动类器官分化，并每两天更换一次培养基，持续七天。

将含有气道上皮细胞模型的培养板放入显微镜板插件中，并关闭显微镜环境舱。让样品在预热的、37摄氏度、含5%二氧化碳的显微镜腔室内平衡30分钟。在显微镜目镜处，对细胞模型进行聚焦。

然后使用采集软件，点击 L100 以将光路切换至安装相机的端口。点击绿色播放按钮，通过软件观察显微镜的视野。检查纤毛是否处于焦点位置，必要时进行调整。

要从菜单中获取延时图像，请点击“Acquire”，然后点击“Fast TimeLapse”。在弹出窗口中，选择保存位置和文件名，并采集 1,000 帧。要预览显微镜视野中的纤毛，请先点击“Apply”，然后点击绿色的“Play”按钮。

如有需要，调整Z轴焦距。然后点击“立即运行”以捕获快速时间序列图像。在安装必要的软件和工具箱后，将相应的自定义分析脚本和支持脚本文件夹复制到计算机的本地驱动器中。

接下来，在计算软件中，单击“主页”选项卡，然后选择“设置路径”。在弹出的窗口中，单击“添加子文件夹”。在 MATLAB 搜索路径下，选择所示的文件夹。

然后单击保存并关闭。通过检查分析脚本是否显示在左侧面板中，确认其已链接到计算软件。接下来，将获取的示例原始图像文件传输到计算机的本地驱动器。

然后在计算软件中点击 BeatingCiliaBatchOMEfiles_jove.m 分析脚本文件。要运行该脚本，请点击编辑器选项卡，然后点击绿色的播放按钮。

在出现的提示窗口中，选择待分析的原始图像文件。输入每帧的采集时间（曝光时间）。然后单击“确定”运行 GetFirstAmplitude。

在包含 AveSpectrum 文件的文件夹上运行 m 脚本。等待脚本输出 FirstAmplitudeStacked.xlsx 文件，该文件包含最高振幅频率，且处于气道上皮纤毛摆动的生理范围内。

从 FirstAmplitudeStacked.xlsx 文件中复制频率值，并使用科学分析软件绘制图表。结果显示了来自三名囊性纤维化患者和三名健康对照者的气道上皮细胞ALI模型中测得的纤毛搏动频率。

在培养分化的第14天，可见纤毛出现搏动。从第14天至培养分化的第21天，各组之间的纤毛搏动频率未观察到具有统计学意义的增加。在培养分化的第21天，健康对照组参与者的平均纤毛搏动频率显著高于囊性纤维化患者的平均纤毛搏动频率。

此外，在去除黏液后，对相同细胞模型中的纤毛搏动频率进行成像，结果显示，在健康个体和囊性纤维化患者的气液界面模型中，去除黏液后纤毛搏动频率均出现具有统计学意义的升高。成像环境必须严格控制，因为纤毛功能极易受到环境因素变化的影响。该平台有望用于建立针对患者的特异性药物筛选体系，以识别能够调节CFTR功能的药物。