Name: 产生来自多能干细胞的自组装人心脏类器官 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 了解利用人多能干细胞通过三步分化法构建自组装心脏类器官的技术。该方法可生成含所有心脏细胞类型及血管网络的复杂三维结构，用于模拟先天性心脏病等多种心血管疾病并进行高通量药物筛选。

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本研究由美国国立卫生研究院下属的国家心、肺和血液研究所资助，资助编号为 K01HL135464 和 R01HL151505，以及由美国心脏协会资助，资助编号为 19IPLOI34660342。我们感谢密歇根州立大学先进显微镜中心以及密歇根州立大学药理学与毒理学系的 William Jackson 博士提供共聚焦显微镜的使用机会，感谢 IQ 显微镜中心以及密歇根州立大学基因组学中心提供的测序服务。同时，我们感谢 Aguirre 实验室所有成员所提出的宝贵意见和建议。

1. 人多能干细胞的培养与维持
注意：人诱导性多能干细胞（hiPSCs）或人胚胎干细胞（hESCs）在解冻后需连续培养至少两个传代，方可用于生成拟胚体（EBs）以进行分化或进一步冻存。hPSCs 应在已包被基底膜细胞外基质（BM-ECM）的6孔培养板中，使用PSC培养基（见材料表）进行培养。在对6孔板中的hPSCs进行换液时，应将培养基直接加至孔的内侧壁，而非直接滴加在细胞层上，以避免引起非预期的细胞脱落或应激。使用者需注意，某些PSC培养基不可在37 °C预热；本实验方案中所使用的全部PSC培养基均为热稳定型。
<ol>
	<li>为将BM-ECM包被于培养板中，将一份BM-ECM（根据生产商说明保存于-20 °C）置于冰上解冻，取0.5 mg BM-ECM与12 mL冷的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）/F12培养基（保存于4 °C）混合。将2 mL DMEM/F12-BM-ECM混合液加入6孔板的每孔中，于37 °C孵育至少2 h。</li>
	<li>解冻细胞时，先将hPSC冻存管在37 °C金属浴或水浴中解冻1-2 min，直至仅剩少量冰晶可见。将解冻后的细胞转移至离心管中，缓慢加入8-9 mL含2 µM ROCK抑制剂thiazovivin（Thiaz）的PSC培养基，于300 × g离心5 min。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于含2 µM Thiaz的PSC培养基中。根据冻存管中细胞浓度，将细胞接种至1-2个孔中，于37 °C、5% CO2条件下培养24 h后再更换PSC培养基。</li>
	<li>每48 h更换一次细胞培养基。分别使用DMEM/F12（1 mL/孔）和PSC培养基（2 mL/孔）进行洗涤和换液。 
	注意：洗涤有助于去除细胞代谢废物和碎片，而更换新鲜培养基可为细胞提供新的营养来源。</li>
	<li>当细胞达到亚汇合状态（60-80%汇合度）时进行传代：吸除培养基，然后用1 mL 1× Dulbecco磷酸盐缓冲液（无钙、无镁；DPBS）洗涤每孔。吸除DPBS后，加入1 mL hPSC消化试剂（见材料表），作用10 s后吸除大部分试剂，仅保留一层薄层。</li>
	<li>用该薄层hPSC消化试剂继续孵育2-5 min，直至细胞间出现间隙。 
	注意：终止消化的时间因细胞系而异。</li>
	<li>向孔中加入1 mL含2 µM Thiaz的PSC培养基（PSC培养基+Thiaz），轻轻敲击培养板以促进细胞脱落。用移液器将悬浮于培养基中的细胞轻柔吹打1-2次以分散大块克隆，并按1:6的孔比例将细胞重悬于PSC培养基+Thiaz中（即1孔细胞重悬于12 mL培养基中）。将细胞重新接种至BM-ECM包被的培养孔中。</li>
</ol>
2. 三维自组装人源心脏类器官的生成
<ol>
	<li>拟胚体（EB）形成： 
	注意：在拟胚体形成之前，必须尽量减少可观察到的分化细胞。使用6孔板中的2至3个孔（细胞融合度为60–80%）可获得足够用于一个96孔板类器官培养的细胞量。所有培养基在换液前均应分装并置于37 °C珠浴或水浴中预热，以尽量减少温度变化对拟胚体或类器官造成的冲击（细胞解离试剂除外）。参见 图1A，B.
	<ol>
		<li>第 -2 天
		<ol>
			<li>为了生成拟胚体，在第 -2 天，用 DPBS 冲洗亚融合状态的 hPSCs（60–80% 融合度）至少 10 秒，以去除细胞碎片，随后吸除 DPBS。</li>
			<li>为了使细胞脱离并解离为单细胞状态，加入1 mL室温的细胞解离试剂（参见 材料表向每孔加入适量溶液，孵育 3–6 分钟。每隔约 1 分钟轻轻敲击培养板约 5 次，以促进细胞脱落，并在显微镜下观察脱落情况。加入 1 mL PSC 培养基+Thiaz 以终止反应。</li>
			<li>为收集细胞并分散残留的细胞团块，用移液器将培养基在孔内上下吹打2-3次，以形成单细胞悬液。将单细胞悬液转移至离心管中，在300 × g下离心5分钟 g.</li>
			<li>弃去上清液，将细胞重悬于1 mL PSC培养基+Thiaz中。使用细胞计数器或血细胞计数板对细胞进行计数，并用PSC培养基+Thiaz将细胞稀释至浓度为100,000个细胞/mL。</li>
			<li>为了进行拟胚体形成，使用多通道移液器将100 µL（含10,000个细胞）分配至圆底超低吸附96孔板的每个孔中。以100 × g 3 分钟，于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 24 小时2.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>第 -1 天
		<ol>
			<li>从每个孔中小心移除 50 µL 培养基，加入 200 µL 预热至 37 °C 的新鲜 PSC 培养基，使每孔终体积为 250 µL。将细胞在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 24 h2. 
			注意：更换培养基时，应小心地从孔的侧边吸出和加入培养基，以避免扰动孔底的拟胚体（EBs）。由于EBs结构脆弱且为悬浮培养，换液时需在每个孔中保留少量液体，以防止EBs受到扰动。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>人类心脏类器官（hHO）分化 
	注意：所有培养基在更换前均需在37 °C珠浴或水浴中预热。更换培养基时，应小心地沿孔壁移除和添加液体，避免扰动孔底正在发育的类器官。为尽量减少扰动，并实现抑制剂和生长因子的逐步去除，培养基更换之间无需进行洗涤步骤。含2% B-27补充剂的RPMI材料表在分化方案的整个过程中均使用B-27添加剂（除非特别说明，B-27含有胰岛素；第0–5天使用无胰岛素版本）。参见 图1C.
	<ol>
		<li>第0天
		<ol>
			<li>为启动向中胚层谱系的分化，从每个孔中移除166 µL培养基（约2/3）rd 总体积）中加入166 µL含有无胰岛素B-27添加剂、6 µM CHIR99021、1.875 ng/mL骨形态发生蛋白4（BMP4）和1.5 ng/mL Activin A的RPMI 1640培养基，使孔内终浓度为4 µM CHIR99021、1.25 ng/mL BMP4和1 ng/mL Activin A。于37 °C、5% CO₂条件下孵育24小时2.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>第1天
		<ol>
			<li>从每个孔中移除 166 µL 培养基，并加入 166 µL 含无胰岛素 B-27 补充剂的新鲜 RPMI 1640 培养基。在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 24 小时。2.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>第2天
		<ol>
			<li>为诱导心肌中胚层特化，从每个孔中移除166 µL培养基，并加入166 µL含无胰岛素B-27补充剂和3 µM Wnt-C59的RPMI 1640培养基，使孔内Wnt-C59终浓度为2 µM。于37 °C、5% CO₂条件下孵育48 h。2.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>第4天
		<ol>
			<li>从每个孔中移除 166 µL 培养基，并加入 166 µL 含无胰岛素 B-27 补充剂的新鲜 RPMI 1640 培养基。在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 48 小时。2.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>第6天
		<ol>
			<li>从每个孔中移除 166 µL 培养基，并加入 166 µL 含 B-27 添加剂的 RPMI 1640 培养基。在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 24 小时2.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>第7天
		<ol>
			<li>为诱导前心外膜分化，从每个孔中移除166 µL培养基，并加入166 µL含有B-27补充剂和3 µM CHIR99021的新鲜RPMI 1640培养基，使孔内CHIR99021的终浓度为2 µM。在37 °C、5% CO₂条件下孵育1小时。2.</li>
			<li>从每个孔中移除 166 µL 培养基，并加入含 B-27 添加剂的新鲜 RPMI 1640 培养基 166 µL。在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养 48 h。2. 
			注意：在第7天进行第二次换液时需格外小心，因为类器官因培养基更换更易发生移动。</li>
			<li>从第7天开始直至收集或转移用于分析或实验，每48小时更换一次培养基，即从每个孔中移除166 µL培养基，并加入含B-27添加剂的新鲜RPMI 1640培养基166 µL。 
			&#8203;注意：类器官在第15天即可用于分析和实验，除非需研究更早期的发育阶段。类器官可在第15天后继续培养，用于长期培养或成熟实验。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 类器官分析
<ol>
	<li>转移完整类器官（活体或固定后） 
	注意：进行活体类器官转移时，确保所使用的移液器吸头为无菌状态。
	<ol>
		<li>从P200移液器吸头尖端开口处向上5-10 mm处剪去尖端，形成直径约2-3 mm的宽开口。</li>
		<li>将吸头垂直插入含有类器官的圆底孔中，确保移液器完全垂直（与板面垂直）。在将吸头插入培养基之前，应先将移液器的按钮完全压下。</li>
		<li>缓慢释放移液器活塞，吸取足够的培养基（100–200 µL）以收集类器官。</li>
		<li>将类器官连同培养基转移至目标位置（例如用于固定、活体成像、电生理记录或新培养板中的培养）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>类器官固定 
	注意：类器官的固定和染色可在96孔培养板或微量离心管中进行。多聚甲醛（PFA）仅可在通风橱中操作。
	<ol>
		<li>对于在微量离心管中进行固定，将活体类器官转移至不同的管中，每管含1-8个类器官。 
		注意：每管不得超过8个类器官。</li>
		<li>小心移除并弃去离心管中尽可能多的培养基，注意不要触碰类器官。</li>
		<li>向每管或每孔加入4% PFA（微型离心管每管300-400 µL，96孔板每孔100-200 µL）。室温孵育30-45分钟。 
		注意：孵育时间超过1小时可能需要抗原修复步骤，不建议如此操作。</li>
		<li>安全弃去PFA，避免扰动类器官。使用与4% PFA相同体积的含1.5 g/L甘氨酸的DPBS（DPBS/Gly）进行3次洗涤，每次洗涤间隔5分钟。移除DPBS/Gly后，可直接进行免疫染色或其他分析，或加入DPBS并于4 °C保存，以备后续使用，保存时间最长可达2周。 
		注意：固定类器官的储存时间超过2周可能导致组织降解和污染，不建议如此操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>整体免疫荧光染色
	<ol>
		<li>向每个含有固定类器官的孔或管中加入100 µL封闭/透化溶液（含10%正常驴血清 + 0.5%牛血清白蛋白（BSA）+ 0.5% Triton X-100的1x DPBS溶液）。在摇床上室温孵育过夜。 
		注意：每管不得超过8个类器官。</li>
		<li>小心移除并弃去尽可能多的封闭液，避免接触类器官。用DPBS清洗3次，每次间隔5分钟。</li>
		<li>用推荐浓度的相应一抗，配制一抗溶液（1% 正常驴血清 + 0.5% BSA + 0.5% Triton X-100 溶于 1× DPBS 中），在 4 °C 摇床上孵育 24 小时。</li>
		<li>小心移除并弃去尽可能多的抗体溶液，避免接触类器官。用DPBS清洗3次，每次间隔5分钟。</li>
		<li>配制二抗溶液（1% 正常驴血清 + 0.5% BSA + 0.5% Triton X-100 溶于 1× DPBS 中），加入推荐浓度的相应二抗。若抗体为荧光标记，于 4 °C 避光（例如用铝箔包裹）在摇床上孵育 24 小时。</li>
		<li>小心移除并弃去尽可能多的抗体溶液，避免接触类器官。用DPBS清洗3次，每次间隔5分钟。</li>
		<li>准备载玻片，将直径为90-300 µm的微珠用封片剂封固（参见 材料表) 靠近载玻片边缘处，即放置带有类器官的盖玻片的位置。 
		注意：建议在继续操作前让珠子周围的封片剂干燥；这可以防止珠子移动。参见 图2.</li>
		<li>使用剪裁过的移液器吸头将染色后的类器官转移至载玻片上的珠粒之间，注意保持适当间距，以避免类器官在载玻片上相互接触。用卷起的实验室擦拭纸的角落小心吸除类器官周围的多余液体。</li>
		<li>用封片透明介质覆盖类器官（果糖-甘油透明溶液含60%（体积/体积）甘油和2.5 M果糖）37 每张载玻片使用 120–150 µL 封片透明介质。 
		注意：由于封片-透明介质黏度较高，建议使用剪口的移液器吸头。</li>
		<li>将盖玻片悬于载玻片上方，载玻片上类器官已覆盖封片透明溶液，缓慢按压盖玻片使其覆盖载玻片，确保类器官位于固定微珠之间。</li>
		<li>用指甲油封固盖玻片边缘。室温避光干燥1小时。长期保存时，置于4 °C避光存放。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>活体心脏类器官中的钙瞬变成像 
	注意：根据制造商说明书，Fluo4-AM 用二甲基亚砜（DMSO）重悬，配制成终浓度为 0.5 mM 的储存液。将 Fluo4-AM 直接加入 96 孔板中的类器官孔内。
	<ol>
		<li>使用 RPMI 1640 培养基对类器官进行 2 次洗涤。
		<ol>
			<li>从孔中移除 166 µL 的用过的培养基。</li>
			<li>加入166 µL预热的RPMI 1640培养基，移除166 µL旧培养基，再加入166 µL新鲜RPMI 1640培养基。 
			注意：洗涤的目的是去除废物和细胞碎片。洗涤过程中需移除孔中三分之二的培养基，以避免在功能检测前扰动位于孔底部的类器官。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>向类器官中加入 Fluo4-AM 培养基。
		<ol>
			<li>将用DMSO重悬的Fluo4-AM加入含B-27补充剂的RPMI 1640培养基中，配制成1.5 µM的溶液。</li>
			<li>从孔中移除 166 µL 培养基。</li>
			<li>加入166 µL浓度为1.5 µM的Fluo4-AM溶液，溶剂为含B-27添加剂的RPMI 1640培养基，使孔中终浓度为1 µM。于37 °C、5% CO₂条件下孵育2 30分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>按照步骤3.4.1进行两次洗涤。</li>
		<li>向孔中加入含有B-27添加剂的166 µL RPMI 1640培养基。</li>
		<li>使用P200移液枪的切口吸头，将类器官转移至含100–200 µL培养基的玻璃底培养皿（例如，8孔腔室盖玻片，#1.5高性能盖玻片）中。 
		注意：参见第3.1节关于整体类器官转移的内容。</li>
		<li>在显微镜下对类器官进行活体成像，显微镜环境需控制温度和CO₂浓度2-37 °C、5% CO₂ 控制环境培养箱2.</li>
		<li>在类器官的不同位置录制多个10-20秒的视频，以显示钙离子进入和离开细胞时荧光强度水平的升高与降低。 
		注意：对于高分辨率记录，建议以每秒10帧或更快的速度进行录制；推荐速率为每秒50帧。</li>
		<li>使用图像分析软件（例如 ImageJ），通过选择感兴趣区域并随时间测量强度水平来分析视频。</li>
		<li>使用 ΔF/F 对强度记录进行归一化处理0&#160;与时间（毫秒）的关系并绘图。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无任何利益冲突。

近年来，源自人类干细胞的心肌细胞及其他心脏来源的细胞已被用于模拟人类心脏发育22,24,25 和疾病26,27,28，并作为筛选治疗药物29,30 和毒性物质31,32 的工具。本文报道了一种易于实施且高度可重复的方案，用于生成类胚体（EBs）并将其分化为高度复杂的人类心脏类器官（hHOs）。该方案已在多种细胞系中成功应用，包括hPSCs和hESCs23，均表现出稳定的心肌搏动频率和细胞类...

先天性心脏病（CHDs）是人类最常见的先天性缺陷，影响约1%的活产婴儿1,2,3。在大多数情况下，CHDs 的病因仍不明确。能够在实验室中构建出与发育中的人类心脏高度相似的人类心脏模型，是直接研究人类 CHDs 根本病因的重要进展，而非依赖替代性动物模型。
实验室培养的组织模型的典范是类器官，即在细胞组成和生理功能上均类似于特定器官的三维细胞结构。类器官通常来源于干细胞或祖细胞，已被成功用于构建多种器官的模型，例如大脑4,5，肾脏6,7，肠道8,9，肺10,11肝脏12,13和胰腺14,15，仅举几例而已。最近的研究表明，构建自组装心脏类器官以研究心脏发育具有可行性 体外这些模型包括利用小鼠胚胎干细胞（mESCs）模拟早期心脏发育16,17 直至房室特化18 以及人类多能干细胞（hPSCs）以生成多胚层心内胚层类器官19 和有腔室的心形体20 细胞组成高度复杂。
本文介绍了一种新颖的三步WNT调控方案，可高效且经济地生成高度复杂的人类心脏类器官（hHOs）。类器官在96孔板中生成，形成可扩展、高通量的系统，易于实现自动化。该方法依赖于构建人多能干细胞（hPSC）聚集体，并触发心脏发生的各个发育阶段，包括中胚层和心脏中胚层的形成、第一和第二心区的特化、前心外膜器官的形成以及房室特化。经过15天的分化后，hHOs包含心脏中存在的所有主要细胞谱系，具有清晰定义的内部腔室、心房和心室腔室，以及贯穿整个类器官的血管网络。这一高度复杂且可重复的心脏类器官系统适用于心脏发育机制、疾病研究以及药理学筛选中的结构、功能、分子和转录组学分析。

<table><tbody><tr><td>抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 驴抗小鼠</td><td>Invitrogen</td><td>A-21202</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 驴抗兔</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 驴抗小鼠</td><td>Invitrogen</td><td>A-21203</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 驴抗兔</td><td>Invitrogen</td><td>A-21207</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 驴抗山羊</td><td>Invitrogen</td><td>A32849</td><td>1:200</td></tr><tr><td>HAND1</td><td>Abcam</td><td>ab196622</td><td>兔；1:200</td></tr><tr><td>HAND2</td><td>Abcam</td><td>ab200040</td><td>兔；1:200</td></tr><tr><td>NFAT2</td><td>Abcam</td><td>ab25916</td><td>兔；1:100</td></tr><tr><td>PECAM1</td><td>DSHB</td><td>P2B1</td><td>兔；1:50</td></tr><tr><td>TNNT2</td><td>Abcam</td><td>ab8295</td><td>小鼠；1:200</td></tr><tr><td>THY1</td><td>Abcam</td><td>ab133350</td><td>兔；1:200</td></tr><tr><td>TJP1</td><td>Invitrogen</td><td>PA5-19090</td><td>山羊；1:250</td></tr><tr><td>VIM</td><td>Abcam</td><td>ab11256</td><td>山羊；1:250</td></tr><tr><td>WT1</td><td>Abcam</td><td>ab89901</td><td>兔；1:200</td></tr><tr><td>培养基与试剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>NC9464543</td><td>细胞解离试剂</td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R&amp;D Systems</td><td>338AC010</td><td></td></tr><tr><td>B-27 补充剂（不含胰岛素）</td><td>Gibco</td><td>A1895601</td><td>无胰岛素细胞培养补充剂</td></tr><tr><td>B-27 补充剂</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>细胞培养补充剂</td></tr><tr><td>BMP-4</td><td>Gibco</td><td>PHC9534</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Bioworld</td><td>50253966</td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Selleck</td><td>442310</td><td></td></tr><tr><td>D-(-)-果糖</td><td>Millipore Sigma</td><td>F0127</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Scientific</td><td>62248</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Millipore Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Flex 培养基试剂盒</td><td>Gibco</td><td>A2858501</td><td>含1%青霉素-链霉素的多能干细胞（PSC）培养基</td></tr><tr><td>Fluo4-AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Millipore Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Millipore Sigma</td><td>410225</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel GFR</td><td>Corning</td><td>CB40230</td><td>基底膜细胞外基质（BM-ECM）</td></tr><tr><td>正常驴血清</td><td>Millipore Sigma</td><td>S30-100mL</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>MP Biomedicals</td><td>IC15014601</td><td>粉末溶于PBS缓冲液 &amp;ndash; 使用浓度为4%</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（10倍浓缩）</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Polybead 微球</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>73155</td><td>90 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>NC0729236</td><td>人多能干细胞（hPSCs）解离试剂</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Thiazovivin</td><td>Millipore Sigma</td><td>SML1045</td><td></td></tr><tr><td>吐温X-100</td><td>Millipore Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>Gibco</td><td>1525006</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Vibrance 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>H170010</td><td></td></tr><tr><td>WNT-C59</td><td>Selleck</td><td>NC0710557</td><td></td></tr><tr><td>其他</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>02682002</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon 管</td><td>Fisher Scientific</td><td>1495970C</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 冻存管</td><td>Corning</td><td>13-700-500</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 试剂储液槽</td><td>Fisherbrand</td><td>13681502</td><td></td></tr><tr><td>6孔平底细胞培养板</td><td>Corning</td><td>0720083</td><td></td></tr><tr><td>8孔腔室盖玻片，#1.5 高性能盖玻片</td><td>Cellvis</td><td>C8-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>96孔透明超低吸附微孔板</td><td>Costar</td><td>07201680</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>图像处理软件</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>06-666</td><td>实验室擦拭纸</td></tr><tr><td>显微盖玻片</td><td>VWR</td><td>48393-241</td><td>24 x 50 mm，No. 1.5</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Fisherbrand</td><td>1255015</td><td></td></tr><tr><td>Moxi 细胞计数仪</td><td>Orflo Technologies</td><td>&amp;nbsp;MXZ001</td><td></td></tr><tr><td>Moxi Z 细胞计数卡盒 &amp;ndash; M型</td><td>Orflo&amp;nbsp;Technologies</td><td>MXC001</td><td></td></tr><tr><td>多通道移液器</td><td>Fisherbrand</td><td>FBE1200300</td><td>30-300 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Olympus cellVivo</td><td>Olympus</td><td></td><td>用于钙成像，ImageJ 分析</td></tr><tr><td>Sorvall Legend X1 离心机</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75004261</td><td></td></tr><tr><td>恒温混匀仪</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-687-717</td><td></td></tr><tr><td>Top Coat 指甲油</td><td>Seche Vite</td><td></td><td>可在任意超市购买</td></tr></tbody></table>

生成源自多能干细胞的自组装人类心脏类器官

Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells

研究人类心脏在健康与疾病状态下发育的能力，受到体外模拟人类心脏复杂性的严重限制。in vitro 建立能够模拟复杂 in vivo 表型的更高效类器官平台（如类器官和器官芯片）将有助于提升对人类心脏发育及疾病的研究能力。本文介绍了一种利用人类多能干细胞通过自组织并结合小分子抑制剂逐步激活发育通路来生成高度复杂的人类心脏类器官（hHOs）的实验方案。胚胎体（EBs）在96孔圆底超低吸附培养板中生成，以利于单个结构的悬浮培养。
类器官通过三步Wnt信号通路调控策略分化为人心外膜类器官（hHOs），该策略包括：首先激活Wnt通路以诱导心源性中胚层命运；其次抑制Wnt通路以生成定型的心脏谱系；最后再次激活Wnt通路以诱导生心外膜器官组织。这些步骤在96孔板体系中进行，效率高、可重复性强，且每次实验可产生大量类器官。通过免疫荧光成像对分化第3天至第11天的样本进行分析，发现到第15天时，hHOs内部已呈现出第一和第二心场的特征，并形成高度复杂的组织结构，包括心肌组织，其中包含心房和心室样心肌细胞区域，以及由内皮细胞组织衬里的内部腔室。类器官还表现出贯穿整体结构的复杂血管网络和外层的心外膜组织。在功能层面，hHOs表现出强烈的搏动活性，并通过Fluo-4活细胞成像检测显示正常的钙离子活动。总体而言，该方案构建了一个可靠的平台 体外 类人心脏组织研究。

为实现自组织的人类类脑器官（hHO） 体外我们改进并整合了先前报道的用于心肌细胞二维单层分化的方法21 和心外膜细胞22 使用Wnt信号通路调节剂构建三维前心器官样体16 使用生长因子 BMP4 和 Activin A。采用本研究所述并展示的 96 孔板 EB 及 hHO 分化方案 图1，通过优化Wnt信号通路激活剂CHIR99021的浓度和处理时间，可获得由人多能干细胞（hPSCs）衍生的高度可重复且结构复杂的类人脑类器官（hHOs）。处于60–80%融合度、以类集落形态生长、且无明显分化迹象的人多能干细胞（hPSCs）或人胚胎干细胞（hESCs），在PSC培养基中培养至适宜状态，是生成拟胚体（EB）的理想起始材料。图1B).
将拟胚体（EBs）培养48小时，并在24小时后更换培养基，随后于第0天开始诱...

本文介绍了一种利用人类多能干细胞通过自组织方式高效生成具有发育相关性的人类心脏类器官（hHOs）的实验方案。该方案依赖于发育信号的顺序性激活，可产生高度复杂且功能相关的人类心脏组织。

研究人类心脏在健康与疾病状态下发育的能力，因难以模拟人类心脏的复杂性而受到极大限制……

该方案使我们能够以一种简单、经济且可重复的方式，在不同细胞系中构建出高度模拟人类心脏发育过程的复杂三维结构。该方法包含一个分为三个分化阶段的单一方案，可生成心脏的所有细胞类型，包括心腔和血管网络。该技术使我们能够模拟多种人类心血管疾病，并筛选有效的药物治疗方法。由于其设计具有高通量的特性，该方法可用于研究人类心脏的发育过程以及与其常见的心脏疾病，其中之一便是先天性心脏缺陷。本方案需要具备基本的细胞培养技能。我们建议操作移液时应仔细轻柔，并小心处理类器官。在开始分化前两天，先制备胚状体（EBs）。用 DPBS 清洗亚融合的 HPSCs，至少 10 秒。然后吸除 DPBS。加入 1 毫升室温的 ACUTA，每分钟轻轻敲击培养板约 5 次，持续 3 至 5 分钟以诱导细胞脱落，同时在显微镜下观察。然后加入1 mL PSC培养基和Thias Avin或Thias以终止反应。用移液器将孔中的培养基上下吹打2至3次，形成单细胞悬液并收集细胞。随后将单细胞悬液转移至离心管中，在300 × g下离心5分钟。吸除上清液，并将细胞重悬于1 mL PSC培养基和Thias中。用DPBS稀释细胞。使用细胞计数器或血细胞计数板对细胞进行计数，并将细胞用含Thias的PSC培养基稀释至浓度为每毫升100,000个细胞。向96孔圆底超低吸附培养板的每个孔中加入100微升稀释后的细胞悬液。将培养板在100 × g 条件下离心3分钟，随后在37°C和5%二氧化碳条件下孵育24小时。24小时后，小心从每个孔中移除50 µL培养基，并加入200 µL预热至37°C的新鲜PSC培养基，使每孔终体积为250 µL。将细胞在37°C和5%二氧化碳条件下继续孵育24小时。从每个孔的一侧移除 166 微升或三分之二的培养基，并加入含有无胰岛素 B27 添加剂、6 微摩尔 CHIR 99021、0.875 纳克/毫升骨形态发生蛋白 4 和 1.5 纳克/毫升 Activin A 的 RPMI 1640 培养基 166 微升。在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下培养 24 小时。24 小时后，从每个孔的一侧移除 166 微升培养基，并加入含无胰岛素 B27 添加剂的新鲜 RPMI 1640 培养基 166 微升。在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下继续培养 24 小时。在第二天诱导心肌中胚层特化时，从每个孔中移除 166 微升培养基，并加入 166 微升含无胰岛素 B27 添加剂和 3 微摩尔 Wnt-C59 的 RPMI 1640 培养基，继续培养 48 小时。第四天，从每个孔中移除 166 微升培养基，并加入 166 微升新鲜的含无胰岛素 B27 添加剂的 RPMI 1640 培养基，再继续培养 48 小时。第六天，从每个孔中移除 166 微升培养基，并加入 166 微升含 B27 添加剂的 RPMI 1640 培养基。此后所有换液操作均使用含胰岛素的 B27 添加剂，继续培养 24 小时。第 7 天时，细胞培养物已准备好进行前心外膜分化。从每个孔中移除 166 微升培养基，并加入含 B27 添加剂和 3 微摩尔 CHIR 99021 的新鲜 RPMI 1640 培养基 166 微升。然后在培养箱中孵育一小时，一小时后将培养板从培养箱中取出，从每个孔的一侧移除166微升培养基，并加入166微升含有B27添加剂的新鲜RPMI 1640培养基，继续孵育48小时。此后每48小时重复此操作，直至收集。类器官在第15天即可用于分析和实验。如需转移完整的类器官，可用剪刀将P200移液枪头尖端剪去5至10毫米，使其开口直径约为2至3毫米。按下移液器的按钮，将吸头垂直插入含有类器官的圆底孔中。吸取约100至200微升培养基，足以收集类器官，并将其转移至目标容器。在分化前，EBS表现为黑色球状团块；分化过程从第0天开始，通过激活Wnt信号通路并添加生长因子，持续恰好24小时。在第二天加入Wnt C59后，类器官体积进一步增大，直径从约200微米增至最大1毫米。人类心脏类器官最早在第6天开始搏动，到第10天时所有类器官均表现出可见的搏动。第7天类器官的高倍镜图像显示，大多数hand1阳性细胞起源于心肌细胞，而hand2阳性细胞则来自第二心区的非心肌细胞祖细胞。RNA测序数据显示，从第3天开始，手一和手二的RNA转录本均有表达。前心场标记物在第3天至第11天期间高表达，而侧心场标记物在第13天之后表达水平更高。免疫荧光染色揭示了构成人类心脏的各种心肌细胞谱系的存在。例如心肌组织和心外膜组织、心内膜细胞、内皮细胞以及心脏成纤维细胞。上述细胞谱系的标志物也在RNA SAC基因表达谱中被观察到。通过对整个类器官中的单个细胞进行活体钙成像，以评估类器官的电生理功能。由于钙离子进出细胞，Fluo-4 荧光强度随时间变化，显示出规律的动作电位。热图显示类器官高倍放大区域的钙离子强度变化，可见钙瞬变及单个细胞导致的荧光强度增加。在尝试本方案时需注意，胚胎体（EBs）及后续形成的类器官并未贴附于培养板底部，在更换培养基时会随液体移动，因此需要格外小心地进行培养基更换操作。类器官可进行更长时间的培养，采用成熟化技术处理，甚至暴露于机械或电刺激等外部刺激，以及毒素等应激因素。该技术使研究人员能够获取在常规研究中难以触及的人类胎儿心脏发育阶段，为深入理解心脏发育过程及疾病病因开辟了新途径。

generating-self-assembling-human-heart-organoids-derived-from

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

产生来自多能干细胞的自组装人心脏类器官

本视频概述了利用人诱导性多能干细胞（iPSCs）生成前脑类器官的过程，展示了从干细胞聚集体发育为模拟大脑皮层的复杂结构，并进一步分化为多种神经元类型的全过程。...

利用人诱导性多能干细胞生成前脑型脑类器官

本文介绍一种可扩展的方法，通过简单组合使用Activin...

从人多能干细胞生成第一心场样心脏前体细胞及心室样心肌细胞

本方案旨在以简化且低成本的方式生成脑类器官，无需外源性生长因子或基底膜基质，同时仍能维持脑细胞类型的多样性及细胞组织的多种特征。...

一种静态自诱导法由人胚胎干细胞生成脑类器官

本文介绍了一种从人多能干细胞（hPSCs）生成肾类器官的实验方案。该方案可在两周内生成肾类器官。所获得的肾类器官可在大规模旋转烧瓶或多孔磁力搅拌板中进行培养，适用于并行药物筛选研究。...

一种从人多能干细胞生成肾类器官的简化方法

本实验方案旨在介绍并演示一种高度定向的人类心肌组织三维（3D）微流控模型的构建方法。该模型由干细胞来源的心肌细胞与心脏成纤维细胞（CFs）在仿生性胶原基水凝胶中共培养形成，可用于心肌组织工程、药物筛选及疾病建模等应用。...

在微流控平台上构建三维有序的人类心脏组织

本文介绍了一组从人诱导性多能干细胞衍生的心肌细胞在高通量、多维度培养条件下生成心脏类球体（CSs）并进行冷冻保存的实验方案。该三维模型可作为疾病建模和高通量筛选的可靠平台，并在冷冻保存后仍能维持其功能特性。...

人诱导多能干细胞来源心脏类球体的生成、高通量筛选与生物样本库保存

本方案描述了从人类多能干细胞和诱导性多能干细胞生成自组织血管的方法。这些血管网络表现出广泛且相互连接的内皮细胞网络，周围分布着周细胞、平滑肌肌动蛋白以及连续的基底膜。...

从多能干细胞生成人血管类器官

本方案介绍了一种利用人多能干细胞生成血管类器官的方法。...

由人诱导性多能干细胞生成血管类器官

自组装人源心脏类器官（hCOs）是一种新兴的人类心脏发育和疾病建模系统。本文提供了一种生成人源心脏类器官并利用缺氧-复氧方法对其进行损伤的实验方法，以及损伤后预期的组织学和功能学结果的详细描述。...

一种自组装人源心脏类器官的缺氧-复氧损伤模型

本文描述了在低温条件下通过固态研磨破碎哺乳动物细胞，从所得细胞粉末制备细胞提取物，并利用抗体偶联的微米级顺磁性珠进行亲和捕获以分离目标蛋白复合物的实验方案。...

从冷冻研磨的哺乳动物细胞中进行蛋白质复合物亲和捕获

了解利用人多能干细胞通过三步分化法构建自组装心脏类器官的技术。该方法可生成含所有心脏细胞类型及血管网络的复杂三维结构，用于模拟先天性心脏病等多种心血管疾病并进行高通量药物筛选。

生成源自多能干细胞的自组装人类心脏类器官

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