生成源自多能干细胞的自组装人类心脏类器官

该方案使我们能够以一种简单、经济且可重复的方式，在不同细胞系中构建出高度模拟人类心脏发育过程的复杂三维结构。该方法包含一个分为三个分化阶段的单一方案，可生成心脏的所有细胞类型，包括心腔和血管网络。该技术使我们能够模拟多种人类心血管疾病，并筛选有效的药物治疗方法。

由于其设计具有高通量的特性，该方法可用于研究人类心脏的发育过程以及与其常见的心脏疾病，其中之一便是先天性心脏缺陷。

本方案需要具备基本的细胞培养技能。我们建议操作移液时应仔细轻柔，并小心处理类器官。在开始分化前两天，先制备胚状体（EBs）。

用 DPBS 清洗亚融合的 HPSCs，至少 10 秒。然后吸除 DPBS。加入 1 毫升室温的 ACUTA，每分钟轻轻敲击培养板约 5 次，持续 3 至 5 分钟以诱导细胞脱落，同时在显微镜下观察。

然后加入1 mL PSC培养基和Thias Avin或Thias以终止反应。用移液器将孔中的培养基上下吹打2至3次，形成单细胞悬液并收集细胞。随后将单细胞悬液转移至离心管中，在300 × g下离心5分钟。吸除上清液，并将细胞重悬于1 mL PSC培养基和Thias中。

用DPBS稀释细胞。使用细胞计数器或血细胞计数板对细胞进行计数，并将细胞用含Thias的PSC培养基稀释至浓度为每毫升100,000个细胞。向96孔圆底超低吸附培养板的每个孔中加入100微升稀释后的细胞悬液。

将培养板在100 × g 条件下离心3分钟，随后在37°C和5%二氧化碳条件下孵育24小时。24小时后，小心从每个孔中移除50 µL培养基，并加入200 µL预热至37°C的新鲜PSC培养基，使每孔终体积为250 µL。将细胞在37°C和5%二氧化碳条件下继续孵育24小时。

从每个孔的一侧移除 166 微升或三分之二的培养基，并加入含有无胰岛素 B27 添加剂、6 微摩尔 CHIR 99021、0.875 纳克/毫升骨形态发生蛋白 4 和 1.5 纳克/毫升 Activin A 的 RPMI 1640 培养基 166 微升。在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下培养 24 小时。24 小时后，从每个孔的一侧移除 166 微升培养基，并加入含无胰岛素 B27 添加剂的新鲜 RPMI 1640 培养基 166 微升。在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下继续培养 24 小时。

在第二天诱导心肌中胚层特化时，从每个孔中移除 166 微升培养基，并加入 166 微升含无胰岛素 B27 添加剂和 3 微摩尔 Wnt-C59 的 RPMI 1640 培养基，继续培养 48 小时。第四天，从每个孔中移除 166 微升培养基，并加入 166 微升新鲜的含无胰岛素 B27 添加剂的 RPMI 1640 培养基，再继续培养 48 小时。第六天，从每个孔中移除 166 微升培养基，并加入 166 微升含 B27 添加剂的 RPMI 1640 培养基。

此后所有换液操作均使用含胰岛素的 B27 添加剂，继续培养 24 小时。第 7 天时，细胞培养物已准备好进行前心外膜分化。从每个孔中移除 166 微升培养基，并加入含 B27 添加剂和 3 微摩尔 CHIR 99021 的新鲜 RPMI 1640 培养基 166 微升。

然后在培养箱中孵育一小时，一小时后将培养板从培养箱中取出，从每个孔的一侧移除166微升培养基，并加入166微升含有B27添加剂的新鲜RPMI 1640培养基，继续孵育48小时。此后每48小时重复此操作，直至收集。类器官在第15天即可用于分析和实验。如需转移完整的类器官，可用剪刀将P200移液枪头尖端剪去5至10毫米，使其开口直径约为2至3毫米。

按下移液器的按钮，将吸头垂直插入含有类器官的圆底孔中。吸取约100至200微升培养基，足以收集类器官，并将其转移至目标容器。在分化前，EBS表现为黑色球状团块；分化过程从第0天开始，通过激活Wnt信号通路并添加生长因子，持续恰好24小时。

在第二天加入Wnt C59后，类器官体积进一步增大，直径从约200微米增至最大1毫米。人类心脏类器官最早在第6天开始搏动，到第10天时所有类器官均表现出可见的搏动。第7天类器官的高倍镜图像显示，大多数hand1阳性细胞起源于心肌细胞，而hand2阳性细胞则来自第二心区的非心肌细胞祖细胞。

RNA测序数据显示，从第3天开始，手一和手二的RNA转录本均有表达。前心场标记物在第3天至第11天期间高表达，而侧心场标记物在第13天之后表达水平更高。免疫荧光染色揭示了构成人类心脏的各种心肌细胞谱系的存在。

例如心肌组织和心外膜组织、心内膜细胞、内皮细胞以及心脏成纤维细胞。上述细胞谱系的标志物也在RNA SAC基因表达谱中被观察到。通过对整个类器官中的单个细胞进行活体钙成像，以评估类器官的电生理功能。

由于钙离子进出细胞，Fluo-4 荧光强度随时间变化，显示出规律的动作电位。热图显示类器官高倍放大区域的钙离子强度变化，可见钙瞬变及单个细胞导致的荧光强度增加。在尝试本方案时需注意，胚胎体（EBs）及后续形成的类器官并未贴附于培养板底部，在更换培养基时会随液体移动，因此需要格外小心地进行培养基更换操作。

类器官可进行更长时间的培养，采用成熟化技术处理，甚至暴露于机械或电刺激等外部刺激，以及毒素等应激因素。该技术使研究人员能够获取在常规研究中难以触及的人类胎儿心脏发育阶段，为深入理解心脏发育过程及疾病病因开辟了新途径。