一种用于测量细胞手性的微图形化检测方法
2022年3月11日
我们提出了一种用于确定多细胞手性的实验方案 体外，使用微图形化技术。该检测方法可自动量化多种类型细胞的左右偏向性，适用于筛选实验。
微图案化肥大细胞手性检测是一种研究发育和疾病过程中多细胞手性形态发生的有力工具，对细胞研究也具有重要意义。该大图案系统易于制备和使用，能够产生高度可靠且可重复的结果，同时兼容自动化高通量处理，适用于大样本量分析。
首先将镀有钛金的载玻片切割成约12毫米×12毫米的小方块。使用玻璃切割刀在表面划过，留下一条凹痕轨迹，然后用手握住载玻片两端，沿凹痕处弯曲使其断裂成四个小片。清洗载玻片时，将载玻片金面朝上放入培养皿中，加入100%乙醇，并置于摇床上浸泡至少10分钟。
吸去乙醇后，用氮气流吹干载玻片。在用氮气干燥聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章之前，先用肥皂水清洗。将5.74毫克十八烷硫醇（C18）溶解于10毫升100%乙醇中，配制成2毫摩尔的C18溶液，然后用100%乙醇清洗PDMS印章。
将PDMS印章的图案面朝下浸入C18溶液中10秒，然后用氮气轻轻吹干60秒。干燥后，将印章图案面朝下贴附在金载玻片上，保持60秒后再揭下。为确保转印效果，可用镊子轻轻敲击印章表面，以充分转移图案。
接下来，通过将一毫升70%乙醇加入倒置的培养皿盖中来制备湿度箱。然后用镊子将一片Parafilm膜铺在表面，确保完全覆盖且无气泡残留。如有需要，移除多余的乙醇。
在加湿室内的Parafilm上，为每块四分之一载玻片分别加入40微升EG3溶液液滴，液滴之间需留出足够空间，以匹配金膜载玻片的间距。使用镊子将C18打印的金膜载玻片有打印面朝下放置于液滴上，确保载玻片下方无气泡残留。轻轻推动载玻片使其贴合，过程中避免抬起，以尽量减少蒸发。
用封口膜将培养皿密封后，在室温下静置至少三小时。在生物安全柜中，将金片朝上，用70%乙醇浸泡并冲洗三次以去除EG3，然后在乙醇中静置10分钟进行消毒。吸除乙醇后，加入无菌PBS。
另准备一个湿度培养盒，其中使用 PBS 代替乙醇，操作如前所示。接着，在 Parafilm 上为每块四分之一载玻片滴加 50 µL 纤连蛋白溶液，各液滴之间需留出一定间距。然后将载玻片倒置，使其朝下接触液滴，操作方式与之前相同，并将培养皿置于生物安全柜中静置 30 分钟。
将镀金载玻片冲洗三次后，将其正面朝上放入磷酸盐缓冲液（PBS）中。接种细胞前，将培养基和胰蛋白酶在37摄氏度的水浴中预热。为促进细胞更好地贴壁，将图案化载玻片浸入含有培养基的12孔板中，并在37摄氏度的培养箱中预热。
细胞经胰蛋白酶消化后，用含FBS的培养基中和，于100 × g离心3分钟收集细胞，再将细胞沉淀重悬于新鲜培养基中。计数细胞，并将细胞悬液稀释至浓度为每毫升200,000个细胞。向每孔含一张金片的孔中加入0.5毫升细胞悬液。
轻轻晃动培养板数次，以确保细胞接种均匀，然后孵育15分钟以促进细胞贴壁。15分钟后，在显微镜下检查细胞贴壁情况，如有需要，可继续孵育一段时间。待细胞完全贴壁后，吸出各孔中含未贴壁细胞的培养基，并加入1毫升新鲜培养基。
将细胞在培养箱中培养24小时，检查汇合度以确定是否形成手性结构。当达到所需汇合度时，移除培养基以固定细胞。用PBS冲洗一次后，向载玻片上加入4%多聚甲醛溶液，室温孵育15分钟，再用PBS冲洗三次。
为获取图像，使用带相机功能的相差显微镜，以高分辨率拍摄载玻片上的每个环。对于手性表征，下载 MATLAB 代码文件，将代码文件夹及其子文件夹添加到 MATLAB 路径中，并打开 ROI_selection.m 文件。
在第四行，将目录更改为所需的数据文件夹。在第14行中修改图像尺寸，其中前两个数值代表环的内圆尺寸，后两个数值代表外圆尺寸。为了确定相差图像中的感兴趣区域（ROI），运行MATLAB代码ROI_selection。
通过点击运行按钮来操作。手动拖动选择框以匹配环形区域，然后在图像上双击以确认选择。在从文件夹中的所有图像中选择感兴趣区域（ROI）后，将生成一个 mat 文件，用于存储每幅图像的 ROI 信息。
然后打开 analysis_batch.m 文件，并按照之前的方法更改文件夹目录。点击运行按钮以执行 analysis_batch 代码。
用于确定多种细胞环状模式的手性。将生成一个 datatoexcel.txt 文件，其中包含每个环的圆形统计学数据，以及顺时针、非手性和逆时针环的数量。
目前的研究结果在实验上证明了所开发的环形图案手性检测方法的有效性，以及该检测方法对细胞骨架变化的敏感性。本研究发现，通过使用50纳摩尔的拉盾菌素A处理来破坏肌动蛋白聚合，小鼠成肌细胞C2C12的手性偏好由逆时针（CCW）转变为顺时针（CW）。此外，经12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯（TPA）处理以激活蛋白激酶C的人脐静脉内皮细胞（hUVECs）表现出从顺时针（CW）向逆时针（CCW）的手性转变，且该转变呈剂量依赖性。在将细胞接种至图案后，可在培养基中添加化学物质或药物以研究细胞反应，同时可结合使用transwell系统来研究细胞共培养。
该实验方法为在不同实验条件下研究多细胞手性提供了高效工具，有助于深入理解细胞手性在多种生物现象与过程中的作用。
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概述
本文介绍了一种利用微图形化技术在体外测定多细胞手性的实验方案。该检测方法可自动量化多种细胞类型中的左右偏向性，适用于高通量筛选。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 发育生物学
背景
- 多细胞手性在发育和疾病中起着至关重要的作用。
- 理解细胞手性有助于揭示形态发生机制。
- 目前研究手性的方法在自动化和可扩展性方面存在局限。
- 微图形化技术为解决这些局限提供了一种新途径。
研究目的
- 建立一种可靠的检测方法，用于研究多细胞手性。
- 实现细胞手性的高通量筛选。
- 增进对手性形态发生机制在生物系统中的理解。
使用的方法
- 制备用于微图形化的钛金镀膜载玻片。
- 将载玻片切割成小的方形片用于实验。
- 在轨道摇床上使用100%乙醇清洗载玻片。
- 定量分析细胞群体中的左右偏向性。
主要结果
- 微图形化检测产生了可靠且可重复的结果。
- 自动化处理实现了对大样本量的分析。
- 在不同细胞类型中成功量化了左右偏差。
- 该方法表现出与高通量应用的良好兼容性。
结论
- 微图形化技术是研究多细胞手性的有力工具。
- 该检测方法可推动细胞研究和发育生物学的进步。
- 未来的应用可能包括筛选与疾病相关的手性模式。
常见问题
执行行业相关性
量化细胞手性可为细胞骨架的组织和定向迁移提供一种机制性读数，这两者在发育生物学和疾病建模中至关重要。该检测方法能够实现对左右细胞偏好的标准化、自动化测量，有助于验证调控细胞极性和形态发生通路中的靶点。其与高通量处理的兼容性使其可整合到早期发现工作流程中，用于表型筛选和先导化合物的鉴定。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：检测细胞骨架调控因子（如肌动蛋白聚合和 Rho GTPase 活性）的功能输出。
- 操作价值：提供定量、可重复的手性度量指标，用于通路解析和靶点风险评估。
- 预测价值：能够检测药物干扰引起的手性偏倚变化，支持作用机制研究。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：生成圆形统计量和方向性分类（顺时针/逆时针/非手性），用于客观的表型分类。
- 操作价值：可与自动图像采集和基于 MATLAB 的分析兼容，适用于可扩展的数据处理。
- 检测适用性：采用标准化的微图案化基底，确保不同重复样本和实验条件之间的一致性。
转化与临床前研究
- 科学价值：将细胞骨架药物反应与手性表型变化联系起来，如使用latrunculin A和TPA处理所证实。
- 操作价值：通过transwell整合支持共培养研究，以模拟手性组织形成中的细胞间信号传导。
- 转化连续性：支持跨细胞类型比较（例如NIH/3T3、C2C12、hUVEC），以评估与疾病模型相关的手性保守机制。
流程与工作流整合
该检测方法通过提供与细胞骨架动态相关的可量化的、基于形态学的表型，在从靶点假设验证到先导化合物优化的整个发现过程中具有重要应用价值。
- 发现生物学：支持对影响细胞极性和定向迁移的基因或化合物进行假设验证。
- 筛选：可在多孔板格式中实现手性模式的可重复、自动化定量分析，用于阳性结果确认。
- 分析：输出圆形统计学数据和手性分类信息，可用于比较不同实验条件及剂量-反应关系。
- 转化研究：将体外手性测量结果与组织层面的形态发生过程相联系，涉及发育障碍和癌症侵袭等研究领域。
- 企业级复用：微图案化基底和分析流程可在研究细胞不对称性或运动性的不同项目间实现标准化应用。
运营与企业影响
- 科学价值：通过将分子扰动与涌现的手性表型关联，减少机制上的模糊性。
- 操作价值：通过标准化的制备、接种和自动化分析步骤，确保实验可重复性。
- 战略价值：通过识别细胞骨架早期缺陷或对细胞极性的脱靶效应，优化“进行/不进行”的决策。
- 组合影响：基于相关细胞模型中的手性表型谱，实现对化合物的风险调整优先排序。
实施注意事项
- 需要具备软光刻、细胞培养和相差显微镜方面的专业知识。
- 依赖于钛/金镀膜载玻片、PDMS印章以及用于数据分析的MATLAB软件。
- 需要在不同实验室之间对微图形几何结构和蛋白包被条件进行标准化。
- 应用于不同细胞类型时，可能需要优化接种密度和培养时间。
- 仅限于在定义的图案上研究二维迁移手性，无法捕捉三维组织手性或剪切力依赖性效应。
