使用自发荧光对 体外 神经干细胞活化状态进行分类
April 12th, 2024
该方案描述了通过使用 i） 共聚焦显微镜，ii） 荧光激活细胞分选仪进行强度成像，或 iii） 多光子显微镜进行荧光寿命成像，通过自发荧光成像识别和富集原代成年小鼠神经干细胞培养物中细胞状态的策略。
该协议提供了一种对神经干细胞活化状态进行分类的新方法，具有一组技术优势。使用该协议，我们可以实现神经干细胞活化状态的活细胞无标记单细胞分辨率分析。该方案可用于阐明调节成体神经发生的机制。
自发荧光比研究人员习惯使用的许多荧光团要暗得多。自信地使用更高的激光功率来收集数据。演示该程序的是 Chris Morrow，他是我实验室的前研究生。
首先配置共聚焦显微镜进行自发荧光成像。单击 405 Laser 并在 405 Laser 菜单下的发射窗口中键入。继续单击 TD 以收集透射光图像并设置 HV 值以可视化样品。
将激光功率调整为 3.5%，并将增益设置为 75。将缩放设置为 2。对于共聚焦扫描参数，将像素停留设置为 0.5，将分辨率设置为 2048 x 2048 像素。
在明场下使用 60 倍油浸物镜，使细胞聚焦。单击 Eye Port 切换到共聚焦扫描模式。确保光路指向扫描头，并确认没有滤光片立方体阻碍光路。
单击 Scan（扫描），然后专注于图像并单击 Capture（捕获）以获取静止神经干细胞和活性神经干细胞中的自发荧光图像。确保收集单平面图像，聚焦细胞的细胞质，以获得每个细胞的代表性横截面。从低激光功率开始成像，然后逐渐增加功率，直到可检测到自发荧光信号而不会引起饱和。
使用 130 微米喷嘴的流式细胞仪分析静止神经干细胞和活性神经干细胞。根据仪器的功能应用光学条件并检测点状自发荧光。在数据文件中收集至少 10， 000 个单重态 qNSC 和 aNSC。
利用这些数据来设计门，以收集 qNSCs 或 aNSC 的富集群体。然后将单细胞分选到填充有 aNSC 培养基的 PLO 层粘连蛋白包被的孔中。FACS 后，让神经干细胞孵育 3 小时。
要固定细胞，请添加 4% 多聚甲醛，确保其足以覆盖培养皿底部并孵育。15 分钟后，在室温下用 0.25% Triton 的 PBS 溶液透化细胞 15 分钟。然后，在室温下用 EdU 染色溶液处理细胞 30 分钟。
接下来，用 PBS 洗涤样品 3 次，每次 10 分钟。首先使用目镜找到合适的视野，并调整到显微镜上样品的光路，以便在黑暗中使用多光子进行成像。设置通道 1 图像的集合。
导航到 功率增益 选项卡，并将 PMT 上的增益调整为 800。单击 2P 激光选项卡，选择 750 纳米作为激光波长，并确保使用正确的滤光片立方体。要收集通道 1 图像，请单击 Power Gain 选项卡并将 Pockels 设置为 30。
然后继续屏幕的扫描部分并单击 Live Scan 启动预览模式。逐渐增加普克尔斯，以在低激光功率下获得合适的视野。确定合适的视野后，将激光功率调整为 3.6 毫瓦。
然后进入扫描部分并单击单次扫描以在 60 秒内捕获通道 1 图像。要收集通道 2 图像，请单击 2P 激光选项卡并为激光选择 890 纳米。将滤镜立方体替换为通道 2 发射立方体。
启动预览模式。增加普克尔斯，直到功率计显示大约 7 毫瓦，并且 CFD 计数介于 10， 000 和 100， 000 之间。单击单次扫描并在 60 秒的持续时间内捕获通道 2 图像。
采用共聚焦自发荧光成像来区分静止神经干细胞和活化的神经干细胞。研究发现，qNSCs 显示比 aNSC 更多的 PAF，表明使用自发荧光作为细胞状态鉴定的标志物。使用 FACS，基于自发荧光富集 NSC 细胞状态。
与混合样品相比，从高自发荧光门分选的细胞显示出较低的增殖速率，而来自低自发荧光门的细胞增殖率更高，证实了 NSC 激活状态的富集。此外，FLIM 用于评估 NSC 自发荧光并识别 NSC 的激活状态。值得注意的是，与 aNSCs 相比，qNSCs 在通道 1 中显示出较高的荧光平均寿命，但荧光成分 alpha 1 的比例较低。
结合来自两个通道的数据的 logistic 回归模型产生了对 NSC 激活状态的近乎完美的预测能力，如接受者操作员特征曲线所示，强调了 FLIM 在分类 NSC 状态方面的潜力。按照此程序，使用其他方法来测量神经干细胞活化状态将是一个很好的验证结果。
概述
本协议介绍了使用自体荧光成像技术识别和富集初代成年小鼠神经干细胞培养物中的细胞状态的技术。该研究采用共聚焦显微镜、荧光活化细胞分选（FACS）和多光子显微镜分析神经干细胞活化状态，提高了对成年神经发生的理解。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 成像技术
背景
- 神经干细胞（NSCs）在神经发生和脑修复中起着关键作用。
- 了解NSC活化状态可以提供对其在脑功能中作用的洞察。
- 目前的方法缺乏精确的技术来评估单细胞分辨率下的NSC状态。
- 自体荧光成像提供了一种分析活细胞而无需标记的新方法。
研究目的
- 开发一个用于活细胞、无标记分析神经干细胞活化状态的协议。
- 使用自体荧光作为标记来富集休眠和活化的神经干细胞。
- 通过改进的成像技术探索调控成年神经发生的机制。
所用方法
- 使用共聚焦显微镜和多光子显微镜进行成像。
- 使用初代成年小鼠神经干细胞培养物作为生物模型。
- 本研究未进行多组学或代谢分析。
- 该协议包括共聚焦设置步骤、用于细胞分选的FACS以及自体荧光分析。
- 关键步骤包括优化激光功率设置和基于自体荧光强度对细胞群体进行分选。
主要结果
- 自体荧光成像根据信号强度成功地区分了休眠和活化NSCs。
- FACS允许NSCs的富集，显示了分选群体之间的增殖率差异。
- 荧光寿命成像（FLIM）揭示了qNSCs和aNSCs之间在荧光寿命和成分上的显著差异。
- 逻辑回归模型表明对识别NSC活化状态具有强大的预测能力。
结论
- 本研究实现了对神经干细胞活化状态的先进识别和分析，这对理解神经发生至关重要。
- 使用自体荧光和FACS对未来神经可塑性和干细胞生物学研究具有前景。
- 获得的见解可能为神经退行性疾病的治疗策略提供信息。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol provides a label-free, single-cell resolution method to classify neural stem cell activation states using autofluorescence, enabling mechanistic de-risking in target validation for neurogenesis-related pathways. By distinguishing quiescent and activated states without exogenous labels, it supports predictive confidence in early discovery and reduces biological ambiguity in stem cell-based therapeutic strategies. The approach enhances translational continuity from discovery through preclinical research by offering a reusable, scalable tool for assessing cell state dynamics in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by classifying NSC activation states based on endogenous autofluorescence markers.
- Operational Value: Supports biological de-risking through label-free, live-cell analysis that preserves native cell function during state discrimination.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by quantifying differences in proliferation and fluorescence lifetime between qNSCs and aNSCs using FACS and FLIM.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows by enriching qNSC or aNSC populations via FACS gating on autofluorescence intensity.
- Reproducibility: Standardizes activation state assessment through quantitative autofluorescence intensity and fluorescence lifetime measurements.
- Scalability: Enables platform reuse across studies by establishing a label-free method compatible with confocal, FACS, and multiphoton imaging.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Aligns with adult neurogenesis mechanisms, offering a translational biomarker-compatible system for studying NSC quiescence exit in preclinical models.
- Predictive De-risking: Supports risk-adjusted advancement decisions by linking autofluorescence signatures to functional outcomes like proliferation rate and cell cycle re-entry.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by providing a consistent, label-free readout across imaging and sorting modalities.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, supporting assay development and analytics with quantitative, label-free outputs that inform go/no-go decisions in stem cell-targeted programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling real-time classification of NSC activation states without perturbing native signaling.
- Screening: Delivers assay readiness through FACS-based enrichment of pure qNSC or aNSC populations for compound screening applications.
- Analytics: Provides quantitative readouts including autofluorescence intensity, fluorescence lifetime, and component analysis to compare activation states across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by allowing longitudinal tracking of quiescent exit dynamics using FLIM in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability across projects due to its label-free nature and compatibility with standard microscopy and flow cytometry infrastructure.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in NSC state transitions.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through instrument-agnostic autofluorescence metrics applicable across labs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of ineffective modulators of NSC activation, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying compounds that reliably modulate qNSC-to-aNSC transition with measurable fluorescence signatures.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy, flow cytometry, and multiphoton FLIM for accurate signal detection and interpretation.
- Dependent on laser tuning and detector sensitivity due to the inherently low signal strength of endogenous autofluorescence.
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters (laser power, gain, wavelength) to ensure reproducible activation state classification.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different NSC sources or culture conditions affecting autofluorescence background.
- Limited by the need for careful optimization to avoid photodamage while achieving sufficient signal-to-noise ratio for state discrimination.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:39
Imaging Autofluorescence in Live qNSCs and aNSCs Using Confocal Microscope
2:13
Autofluorescence Based FACS Enrichment for NSC Activation State in Cultured NSCs
3:36
Using Multiphoton Microscope to Perform Fluorescence Lifetime Imaging on NSCs In Vitro
5:20
Results: Deciphering Neural Stem Cell Activation States Through Advanced Fluorescence Imaging Techniques
6:45
Conclusion
