神经干细胞激活状态的分类 体外 利用自发荧光

本方案提供了一种具有多项技术优势的神经干细胞激活状态分类新方法。利用该方案，我们能够实现对神经干细胞激活状态的活细胞、免标记、单细胞分辨率分析。该方案可用于揭示调控成年神经发生的机制。

自发荧光通常比研究人员惯用的许多荧光染料要微弱得多。在采集数据时，可放心使用较高的激光功率。本实验操作将由我实验室前研究生 Chris Morrow 演示。

首先将共聚焦显微镜设置为自发荧光成像模式。点击405激光器，并在405激光器菜单下输入发射波长窗口。然后点击TD以采集透射光图像，并调节HV值以清晰显示样品。

将激光功率调整至3.5%，增益设为75。将缩放倍数设为2。共聚焦扫描参数中，像素驻留时间设为0.5，分辨率设为2048 × 2048像素。

在明场下使用 60X 油镜物镜，将细胞调至清晰对焦。单击目镜端切换至共聚焦扫描模式。确保光路导向扫描头，并确认无滤光立方阻挡光路。

单击“扫描”，然后聚焦图像，再单击“捕获”以获取静息神经干细胞和活跃神经干细胞中自发荧光的图像。确保采集细胞质处于焦平面的单层图像，以获得每个细胞的代表性横截面。从低激光功率开始成像，并逐步增加功率，直至自发荧光信号可被检测到且未发生信号饱和。

使用配备130微米喷嘴的流式细胞仪分析静息态神经干细胞（qNSCs）和活化态神经干细胞（aNSCs）。根据仪器性能设置光学条件，并检测点状自发荧光。在数据文件中至少收集10,000个单细胞态的qNSCs和aNSCs。

利用这些数据设计分选门，以富集收集qNSCs或aNSCs细胞群体。随后将单细胞分选至预先用PLO-层粘连蛋白包被并加入aNSC培养基的孔中。流式分选后，让神经干细胞孵育三小时。

为了固定细胞，加入4%多聚甲醛，确保其足以覆盖培养皿底部，并进行孵育。15分钟后，在室温下用含0.25%Triton的PBS溶液对细胞透膜处理15分钟。随后，在室温下用EdU染色液处理细胞30分钟。

接着，用 PBS 每次 10 分钟，共洗涤样品三次。首先使用目镜找到合适的视野，并调整显微镜的光路至样品，以实现使用多光子在暗处成像。设置通道一图像的采集。

转到功率增益选项卡，将光电倍增管（PMT）的增益调节至800。单击双光子激光器选项卡，选择750纳米作为激光波长，并确保使用正确的滤光片组。要采集第一通道图像，请单击功率增益选项卡并将普克尔斯盒（Pockels）设为30。

然后进入屏幕的扫描部分，点击“Live Scan”以启动预览模式。逐步增加Pockels电压，以在低激光功率下获得合适的视野。确定合适的视野后，将激光功率调节至3.6毫瓦。

然后进入扫描部分，点击单次扫描，以采集通道一的图像，持续 60 秒。要采集通道二的图像，请点击 2P 激光标签，选择 890 纳米的激光波长，并将滤光立方体更换为通道二的发射滤光立方体。

启动预览模式。调节普克尔斯盒，直至功率计显示约为七毫瓦，且CFD计数在10,000至100,000之间。点击单次扫描，对通道二进行为期60秒的图像采集。

采用共聚焦自体荧光成像技术来区分静息态神经干细胞与激活态神经干细胞。研究发现，静息态神经干细胞（qNSCs）的PAF数量高于激活态神经干细胞（aNSCs），表明自体荧光可作为细胞状态识别的标志物。通过流式细胞荧光分选（FACS），根据自体荧光特性对神经干细胞的不同细胞状态进行了富集。

来自高自发荧光门的细胞与混合样本相比增殖速率较低，而来自低自发荧光门的细胞增殖能力更强，证实了神经干细胞（NSC）激活状态的有效富集。此外，采用荧光寿命成像显微技术（FLIM）评估NSC的自发荧光，以区分NSC的激活状态。值得注意的是，静息态NSC（qNSC）在通道一中表现出较长的平均荧光寿命，但其荧光组分alpha1的比例较激活态NSC（aNSC）更低。

结合两个通道数据的逻辑回归模型对神经干细胞激活状态具有近乎完美的预测能力，受试者工作特征曲线结果突显了荧光寿命成像技术（FLIM）在分类神经干细胞状态方面的潜力。在此基础上，建议采用其他方法进一步验证神经干细胞激活状态的检测结果。