Name: 移动式单分子FRET探头的自动化二维时空分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 了解移动单分子FRET探头的自动化二维时空分析方法，结合宽场荧光显微镜追踪技术，实时分析分子动力学、构象变化及结合动力学，为活细胞实验中的生物物理研究提供可靠定量工具。

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本工作由奥地利科学基金（FWF）项目 P30214-N36、P32307-B 以及维也纳科学与技术基金（WWTF）项目 LS13-030 资助。

<ol><li>McKinney, S. A., Déclais, A. -C., Lilley, D. M. J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+dynamics+of+individual+holliday+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural dynamics of individual holliday junctions.</a> Nature Structural Biology. 10 (2), 93-97 (2002).</li>
<li>Wang, S., Vafabakhsh, R., Borschel, W. F., Ha, T., Nichols, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+dynamics+of+potassium-channel+gating+revealed+by+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural dynamics of potassium-channel gating revealed by single-molecule FRET.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 23 (1), 31-36 (2015).</li>
<li>Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidomain+structure+and+correlated+dynamics+determined+by+self-consistent+FRET+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks.</a> Nature Methods. 14 (2), 174-180 (2016).</li>
<li>Kilic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+FRET+reveals+multiscale+chromatin+dynamics+modulated+by+HP1%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-molecule FRET reveals multiscale chromatin dynamics modulated by HP1α.</a> Nature Communications. 9 (1), 235(2018).</li>
<li>Stryer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+energy+transfer+as+a+spectroscopic+ruler%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler.</a> Annual Review of Biochemistry. 47 (1), 819-846 (1978).</li>
<li>Wu, P. G., Brand, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resonance+energy+transfer%3A+Methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Resonance energy transfer: Methods and applications.</a> Analytical Biochemistry. 218 (1), 1-13 (1994).</li>
<li>Qiao, Y., Luo, Y., Long, N., Xing, Y., Tu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecular+f%C3%B6rster+resonance+energy+transfer+measurement+on+structures+and+interactions+of+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Single-molecular förster resonance energy transfer measurement on structures and interactions of biomolecules.</a> Micromachines. 12 (5), 492(2021).</li>
<li>Malkusch, N., Dörfler, T., Nagy, J., Eilert, T., Michaelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((smFRET+experiments+of+the+RNA+polymerase+II+transcription+initiation+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">smFRET experiments of the RNA polymerase II transcription initiation complex.</a> Methods. 120, 115-124 (2017).</li>
<li>Lee, J. -B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+views+of+MutS+on+mismatched+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+repair%22%5BJournal%5D)">Single-molecule views of MutS on mismatched DNA.</a> DNA repair. 20, 82-93 (2014).</li>
<li>Phelps, C., Israels, B., Jose, D., Marsh, M. C., von Hippel, P. H., Marcus, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+microsecond+single-molecule+FRET+to+determine+the+assembly+pathways+of+T4+ssDNA+binding+protein+onto+model+DNA+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Using microsecond single-molecule FRET to determine the assembly pathways of T4 ssDNA binding protein onto model DNA replication forks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), E3612-E3621 (2017).</li>
<li>Deindl, S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+conformational+dynamics+with+single-molecule+fluorescence+energy+transfer%3A+Applications+in+nucleosome+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Monitoring conformational dynamics with single-molecule fluorescence energy transfer: Applications in nucleosome remodeling.</a> Methods in Enzymology. 513, 59-86 (2012).</li>
<li>Crawford, D. J., Hoskins, A. A., Friedman, L. J., Gelles, J., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+colocalization+FRET+evidence+that+spliceosome+activation+precedes+stable+approach+of+5%27+splice+site+and+branch+site%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Single-molecule colocalization FRET evidence that spliceosome activation precedes stable approach of 5' splice site and branch site.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6783-6788 (2013).</li>
<li>Wang, Y., Xiao, M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+single+molecule+FRET+signals+reveals+multiple+active+ribosome+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of single molecule FRET signals reveals multiple active ribosome subpopulations.</a> Proteins. 82 (1), 1-9 (2014).</li>
<li>Mori, T., Vale, R. D., Tomishige, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+kinesin+waits+between+steps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">How kinesin waits between steps.</a> Nature. 450 (7170), 750-754 (2007).</li>
<li>Huppa, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCR-peptide-MHC+interactions+in+situ+show+accelerated+kinetics+and+increased+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity.</a> Nature. 463 (7283), 963-967 (2010).</li>
<li>Göhring, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+analysis+of+T-cell+receptor-imposed+forces+via+quantitative+single+molecule+FRET+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Temporal analysis of T-cell receptor-imposed forces via quantitative single molecule FRET measurements.</a> Nature Communications. 12 (1), 2502(2021).</li>
<li>Hellenkamp, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+and+accuracy+of+single-molecule+FRET+measurements-a+multi-laboratory+benchmark+study%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study.</a> Nature Methods. 15 (9), 669(2018).</li>
<li>Kapanidis, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-aided+molecule+sorting%3A+Analysis+of+structure+and+interactions+by+alternating-laser+excitation+of+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-aided molecule sorting: Analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (24), 8936-8941 (2004).</li>
<li>Sakon, J. J., Weninger, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+the+conformation+of+individual+proteins+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Detecting the conformation of individual proteins in live cells.</a> Nature Methods. 7 (3), 203-205 (2010).</li>
<li>McCann, J. J., Choi, U. B., Zheng, L., Weninger, K., Bowen, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+methods+to+recover+absolute+FRET+efficiency+from+immobilized+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Optimizing methods to recover absolute FRET efficiency from immobilized single molecules.</a> Biophysical Journal. 99 (3), 961-970 (2010).</li>
<li>Lee, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+FRET+measurements+within+single+diffusing+biomolecules+using+alternating-laser+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Accurate FRET measurements within single diffusing biomolecules using alternating-laser excitation.</a> Biophysical Journal. 88 (4), 2939-2953 (2005).</li>
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<li>Nye, J. A., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+control+of+histidine-tagged+protein+surface+density+on+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Kinetic control of histidine-tagged protein surface density on supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 24 (8), 4145-4149 (2008).</li>
<li>Platzer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unscrambling+fluorophore+blinking+for+comprehensive+cluster+detection+via+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Unscrambling fluorophore blinking for comprehensive cluster detection via photoactivated localization microscopy.</a> Nature Communications. 11 (1), 4993(2020).</li>
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<li>Szalai, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+of+energy+transfer+by+intensity-based+STED-FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging of energy transfer by intensity-based STED-FRET.</a> Nano Letters. 21 (5), 2296-2303 (2021).</li>
<li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+Ca2%2B+based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).</li>
<li>Zhai, B., Zhai, S., Hao, R., Xu, J., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FRET-based+two-photon+probe+for+in+vivo+tracking+of+pH+during+a+traumatic+brain+injury+process%5BTitle%5D)+AND+%22New+Journal+of+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A FRET-based two-photon probe for in vivo tracking of pH during a traumatic brain injury process.</a> New Journal of Chemistry. 43 (43), 17018-17022 (2019).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本文详细介绍了一种用于自动记录和定量分析来自可移动但表面固定的探针分子的单分子FRET（smFRET）数据的流程。该方法补充了smFRET实验中两种主流技术：一种是探针分子固定在表面，另一种是探针分子在溶液中进出共聚焦激发体积并发生扩散17。该流程可提供随时间变化的正确FRET效率及分子位置信息，因此可作为专门分析程序的输入数据，例如用于量化构象转换动力学1、FRET直方图39或二维扩散行为22。
该软件在开放源代码促进会（Open Source Initiative）批准的免费开源许可下发布，授予用户永久免费使用、修改和重新分发的权利。选择 GitHub 作为开发与分发平台，旨在使用户能够尽可能便捷地获取软件，并通过报告漏洞或贡献代码的方式参与开发过程40。软件采用 Python 编写，不依赖任何专有组件。选用 Jupyter 笔记本作为用户界面，便于在分析的每一步检查数据，并可根据具体实验系统对分析流程进行定制和扩展。sdt-python 库32 作为基础，实现了荧光显微镜数据的多种分析功能，包括单分子定位、扩散分析、荧光强度分析、多色通道配准、共定位分析以及感兴趣区域（ROI）处理。
原则上，单颗粒示踪可在一维、二维或三维系统中进行。本文中的单分子分析流程专为研究二维移动系统而设计。这一选择反映了可利用简单的体系，例如平面支撑脂双层（SLB），以呈现可移动的荧光探针。这类脂双层体系通常由两种或多种磷脂分子组成，其中主要组分决定SLB的关键理化参数（如相态和黏度），而次要组分则提供生物分子的结合位点。这些结合位点可以是生物素化的磷脂，用于构建亲和素（avidin）或链霉亲和素（streptavidin）介导的蛋白质平台；也可以是镍-NTA偶联的磷脂，用于结合带有组氨酸标签的蛋白质平台41。选择何种平台将蛋白质连接至SLB，取决于具体的科学问题。读者可参考相关文献16,38,42，了解已成功应用的策略实例。样品中探针的密度应足够低，以避免点扩散函数重叠；通常建议每平方微米（µm2）的分子数少于0.1个。参见代表性结果部分（特别是图6），以了解合适的探针密度示例。该分析方法同样适用于活细胞质膜中单个荧光标记蛋白质分子的扩散研究。
单分子FRET实验的一个关键方面是FRET探针本身的制备与表征。在选择FRET荧光对时，其福斯特半径应与预期的染料间距离相匹配43。应优先选用抗光漂白的染料，因为它们能够产生较长的时间轨迹。然而，当光漂白速率较高时，可通过逐步光漂白分析，利用其中一种荧光团来识别来自共定位分子的多发射体事件；详见方案部分的步骤8.1.4。荧光团对应特异性地共价连接至目标分子的特定位置，形成分子内或分子间FRET对。
将单分子FRET（smFRET）与其他现有技术相结合，可使其空间分辨率突破衍射极限（例如通过STED44）。本文介绍的smFRET追踪算法扩展了该方法在新实验条件和模型系统中的适用性。这包括对以下方面的研究：（i）移动生物分子化学计量比的动力学变化；（ii）移动生物分子的动态结合；（iii）自由扩散反应物的酶促反应速率；以及（iv）移动生物分子构象变化的动力学。前两个示例需要展示分子间FRET的模型系统，即供体和受体分别标记在不同的目标生物分子实体上。后两个示例则可利用在同一分子实体内携带供体和受体的生物传感器（分子内FRET）。
基于分子内FRET的传感器可揭示生物分子的内在构象变化1,2,3,4，由内源性或外源性力载荷引起的构象变化（分子力传感器）16），或纳米微环境中离子浓度（如钙离子）45 和 pH46根据模型系统和首选的锚定平台，此类单分子FRET事件可在二维或三维中进行追踪：（i）单分子FRET事件的平面追踪可用于量化质膜内受体-配体相互作用时间、膜锚定信号放大级联的关联以及表面受体的化学计量比变化；（ii）单分子FRET事件的体积追踪可用于活细胞内或体外任何分子内或分子间FRET探针 体外 重建系统
单分子FRET追踪方法的开发主要针对分子内FRET探针。这类探针具有固定且明确数量的荧光标记，这一特性被用于排除来自聚集分子、合成错误（例如标记不完全）的分子，以及其中一种荧光团已发生光漂白的探针的数据。然而，通过调整过滤步骤，该方法也可应用于分子间FRET探针。例如，不再仅接受含有单一供体和单一受体荧光团的分子，而是可以分析供体与受体染料的空间轨迹，并选择共扩散的供体-受体轨迹进行研究。
由于3D-DAOSTORM算法支持通过发射光路中柱面透镜引起的像散来确定信号在光轴方向上的位置，因此可轻松将三维实验整合到分析流程中。在此情况下，受体激发时的受体信号可用于确定化学计量比和轴向位置。该分析软件还可通过其高度自动化的处理和过滤方案，用于评估探针固定化实验的数据。事实上，已有研究使用该软件的早期版本分析了固定在凝胶相双层膜上的Holliday junction的单分子FRET效率数据38。

荧光共振能量转移（FRET）一直是分子生物学和生物物理研究的重要推动力，因为它能够以亚纳米级分辨率研究各种过程。由于供体与受体荧光染料之间的能量转移效率强烈依赖于亚纳米至纳米尺度的染料间距，FRET 已被有效用作一种光谱尺，用于探究生物大分子的静态与动态构象1,2,3,4。此外，FRET 现象还被广泛用于在群体水平上研究膜相关蛋白和细胞内蛋白的共定位5,6。在过去的二十年中，该方法被改进用于监测单分子 FRET（smFRET）事件7，显著提高了时间和空间分辨率，并能够分辨异质样品中罕见的亚群。借助这些技术，研究人员对多种分子机器的动力学过程获得了独特的见解，例如 RNA 聚合酶 II 的转录加工速率8、DNA 聚合酶的复制速度9,10、核小体的移位速率11、剪接体组装后的转录本剪接与暂停速率12、核糖体亚群的活性13，以及驱动蛋白马达的行走速度14等。受体-配体相互作用的持续时间15和分子间作用力16也已得到量化。
基于强度的单分子FRET研究通常依赖于敏化发射来测量FRET效率：在激发供体后，发射光路中的分光器在空间上分离来自供体和受体荧光团的光信号，从而可对各自的荧光强度进行定量。随后，FRET效率可计算为受体发射的光子数占总光子数的比例17。此外，供体激发后对受体的激发（ALEX）可用于测量FRET事件的化学计量比，有助于区分真实的低FRET信号与例如由受体荧光团光漂白所导致的假性低信号18。
单分子FRET实验通常采用以下两种方法之一进行。第一种方法是使用共聚焦显微镜照射样品体积中的微小区域。当溶液中的单个探针分子扩散进入焦体积时，会被激发。利用该技术可使用快速光子计数探测器，实现亚微秒级的时间分辨率。第二种方法是将探针特异性地固定在表面，并通过宽场显微镜进行监测，通常采用全内反射（TIR）构型以最大限度减少背景荧光。探针的固定化使得记录时间远长于第一种方法。此外，更大的视场允许同时监测多个探针。但由于需要使用相机，该方法相较于上述方法速度较慢，时间分辨率受限于毫秒至秒级范围。
如果需要长时间的测量轨迹，例如研究毫秒到秒时间尺度上的动态过程，则第一种方法不适用，因为荧光爆发通常过于短暂。当无法实现固定时，第二种方法也不可行，例如在活细胞实验中，探针在细胞膜内扩散的情况。此外，已有研究发现，生物模型系统对接触表面的流动性不同，其响应可能会发生显著变化16。
尽管过去已开展过记录可移动FRET探针的单分子FRET（smFRET）与单粒子追踪联用实验19，但目前尚无公开可用的软件用于分析此类数据。这促使了新分析平台的开发，该平台能够测定可移动荧光探针的多种性质，包括单分子FRET效率和化学计量比、亚像素精度的空间位置，以及随时间变化的荧光强度。已建立多种方法，通过分析逐步漂白行为、最近邻距离、发射强度及其他特征对所得轨迹进行筛选，从而特异性地选择正确合成且功能完整的单探针分子。该软件还支持近期多实验室研究中达成共识的实验与分析技术，以生成可靠且定量的单分子FRET数据17。特别是，其实施严格遵循经验证的FRET效率与化学计量比计算流程。在供体激发下，供体发射通道的荧光强度 IDD 与受体发射通道的荧光强度 IDA 被用于根据公式（1）计算表观FRET效率 Eapp。
<img alt="荧光分析中 E_app 的计算公式，显示强度比值，用于教学。" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 1"> （1）
借助在受体激发条件下受体发射通道中的荧光强度 IAA，可利用公式（2）计算表观化学计量比。
<img alt="用于光学分析的静态平衡方程 S_app=(I_DD+I_DA)/(I_DD+I_DA+I_AA)。" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 2"> （2）
通过考虑四个校正因子，可以从Eapp和Sapp推导出FRET效率E和化学计量比S。
<img alt="化学动力学公式，I&lt;sub&gt;DA&lt;/sub&gt;→I&lt;sub&gt;DA&lt;/sub&gt;-αI&lt;sub&gt;DD&lt;/sub&gt;-δI&lt;sub&gt;AA&lt;/sub&gt;，用于描述反应速率。" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 3">
α 描述的是供体荧光泄漏到受体发射通道的情况，可通过仅含有供体荧光团的样品，或通过分析受体已被漂白的轨迹部分来确定。δ 用于校正供体激发光源对受体的直接激发，可通过仅含有受体荧光团的样品，或通过分析供体已被漂白的轨迹部分来测量。
<img alt="数学符号变换公式，静态方程，I_DD 到 γI_DD。" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 4">.
γ尺度 IDD 用于校正供体和受体发射通道中不同的检测效率以及荧光团不同的量子效率。该因子可通过分析在具有高FRET效率的轨迹中受体漂白后供体强度的增加来计算。20 或通过研究具有多个离散FRET状态的样本。
<img alt="静态平衡公式；I&lt;sub&gt;AA&lt;/sub&gt; ↦ I&lt;sub&gt;AA&lt;/sub&gt;/β；方程；教育物理学概念。" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 5">
β 用于对 IAA 进行缩放，以校正供体和受体激发效率的差异。如果 γ 是通过受体漂白分析确定的，则 β 可通过已知供体-受体比例的样品计算得到21。否则，多状态 FRET 样品也可提供 β 值。
综合这些校正，可利用公式（3）计算校正后的FRET效率。
<img alt="能量转移方程，E=(IDA-aIDD-δIAA)/(IDA-aIDD-δIAA+γIDD)，分子相互作用分析。" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 6"> （3）
以及使用公式 (Eq) 校正后的化学计量比4).
<img alt="静态平衡方程；比率分析；数学公式；S方程图；物理学研究。" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq07.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 7"> （4）
理想情况下，校正后的化学计量比为1:1的供体与受体比例可给出 S = 0.5。在实际操作中，信噪比降低会导致所测数值的离散程度增大 S，阻碍了对仅来自供体信号的区分S = 1）和仅有受体信号（S = 0）。所得的时间轨迹可作为单分子轨迹更详细分析的输入数据，以获取诸如时空力分布等信息16单分子事件的迁移率22或不同状态之间的转换动力学1.
以下方案描述了单分子FRET（smFRET）追踪实验的实验参数和操作步骤，以及使用新开发的软件套件进行数据分析的基本原理。为获取实验数据，建议采用满足以下要求的显微镜系统：i）具备检测单个染料分子发射光的能力；ii）宽场照明：特别是对于活细胞实验，推荐使用全内反射（TIR23,24,25）配置；iii）根据波长对发射光进行空间分离，使供体和受体荧光信号投射到同一相机芯片的不同区域或分别投射到不同的相机上25；iv）对供体和受体激发光源进行毫秒级精度的调制，例如使用可直接调制的激光器或通过声光调制器实现调制。该功能可实现频闪光照以最小化荧光染料的光漂白，并可通过交替激发来确定分子化学计量比；v）每条记录的图像序列输出为一个独立文件，文件格式需可被PIMS Python软件包26读取。特别是支持多页TIFF文件格式。

<table><tbody><tr><td>1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-[(N-(5-氨基-1-羧基戊基)亚氨基二乙酸)琥珀酰]（镍盐）(Ni-NTA-DOGS)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>790404P</td><td></td></tr><tr><td>1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱 (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375P</td><td></td></tr><tr><td>1-棕榈酰-2-油酰-甘油-3-磷酸胆碱 (POPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457P</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha; Plan-FLUAR 100x/1.45 油镜</td><td>Zeiss</td><td>000000-1084-514</td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer 显微镜机身</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>带通滤光片</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>ET570/60m</td><td>供体发射滤光片</td></tr><tr><td>带通滤光片</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>ET675/50m</td><td>受体发射滤光片</td></tr><tr><td>conda-forge</td><td>conda-forge 社区</td><td></td><td>Anaconda/miniconda 的社区维护 Python 软件包仓库</td></tr><tr><td>盖玻片 60 mm × 24 mm #1.5</td><td>MENZEL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>二向色镜</td><td>Semrock Inc</td><td>FF640-FDi01-25&amp;times;36</td><td>分离供体与受体发射光</td></tr><tr><td>二向色镜（四通道）</td><td>Semrock Inc</td><td>Di01-R405/488/532/635-25&amp;times;36</td><td>分离激发光与发射光</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td>用于成像缓冲液</td></tr><tr><td>fret-analysis</td><td>Sch&amp;uuml;tz 团队（维也纳工业大学）</td><td></td><td>单分子 FRET 数据分析 Python 软件包；版本 3</td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11524766</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8264</td><td>用于成像缓冲液</td></tr><tr><td>iBeam Smart 405-S 405 nm 激光器</td><td>Toptica Photonics AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iXon Ultra 897 EMCCD 相机</td><td>Andor Technology Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tek 培养皿（8 孔）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>177402PK</td><td>用于样品制备与成像</td></tr><tr><td>Millenia Prime 532 nm 激光器</td><td>Spectra Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miniconda</td><td>Anaconda Inc.</td><td></td><td>Python 3 发行版，最低版本要求：3.7</td></tr><tr><td>单价链霉亲和素（用于细菌表达的质粒）</td><td>Addgene</td><td>20860 &amp;amp; 20859</td><td></td></tr><tr><td>OBIS 640 nm 激光器</td><td>Coherent Inc</td><td>1185055</td><td></td></tr><tr><td>Optosplit II</td><td>Cairn Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>卵清蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5253</td><td>用于成像缓冲液</td></tr><tr><td>等离子清洗仪</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-002</td><td></td></tr><tr><td>sdt-python</td><td>Sch&amp;uuml;tz 团队（维也纳工业大学）</td><td></td><td>数据分析 Python 库；版本 17</td></tr><tr><td>TetraSpek 微球尺寸试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T14792</td><td>随机分布、固定的定位标记，用于图像配准</td></tr><tr><td>USC500TH 超声波清洗仪</td><td>VWR</td><td></td><td>用于 SUV 制备</td></tr></tbody></table>

自动化二维时空分析可移动单分子fret探针

Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes

单分子荧光共振能量转移（smFRET）是一种多功能技术，可用于检测亚纳米至纳米尺度的距离。该技术已广泛应用于多种生物物理和分子生物学实验中，包括分子力的测量、生物大分子构象动态的表征、蛋白质在细胞内的共定位观察，以及受体-配体相互作用时间的测定。在宽场显微镜配置中，实验通常使用表面固定的探针进行。本文介绍了一种将单分子追踪与交替激发（ALEX）smFRET实验相结合的方法，能够获取等离子膜或玻璃支撑脂双层中表面结合但具有移动性的探针的smFRET时间轨迹。针对所记录数据的分析，开发了一套自动化、开源的软件工具集，支持（i）荧光信号的定位，（ii）单颗粒追踪，（iii）FRET相关参数（包括校正因子）的确定，（iv）smFRET轨迹的严格验证，以及（v）结果的直观呈现。所生成的数据可便捷地作为输入，用于后续通过专用软件进行深入分析，例如探针扩散行为的评估或FRET跃迁过程的研究。

根据实验的科学问题，可以从单分子FRET轨迹中提取多种低级和高级信息。本文分别介绍了使用模拟探针和数字探针的分析流程示例：基于肽的分子力传感器16和具有构象随机切换的DNA探针38。有关这些探针的设计和工作原理，请参见图5。
在按照本方案所述执行定位和追踪算法后，该软件包提供了多种数据可视化工具，用于优化初始参数及后续的过滤步骤：（i）单个单分子FRET事件的可视化，（ii）可选的图像分割功能，用于分析特定感兴趣区域内的数据，（iii）通过FRET效率与化学计量比（E-S）图监控过滤步骤。单分子数据的可视化结果如图6所示。
最后，经过筛选的FRET事件通过E-S图和FRET效率直方图表示（图4）。E-S图是优化上述筛选步骤并分析最终结果的有用工具。部分漂白或标记不完全的FRET探针可通过其化学计量值予以排除。通过在x-y图（图6）或均方位移（MSD）图（图4）中绘制单个轨迹路径，可分析其运动特性。前者特别适用于区分可移动事件与固定事件，而后者用于计算扩散系数。
<img alt="化学计量效率的图示分析、MSD 与滞后时间、显微镜数据比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：典型输出结果。（A）分子力传感器群体在玻璃支撑的脂双层上分布，并受到 T 细胞牵拉，其荧光共振能量转移效率（FRET 效率）相对于化学计量比作图（E-S 图，左图）。仅可见一个群体云。相应的 FRET 效率直方图展示了有细胞与无细胞条件下力传感器群体之间的差异（中图）。在 T 细胞存在时，传感器群体的 FRET 效率未出现向较低值的偏移，表明传感器模块几乎未发生依赖于力的拉伸。在这些实验条件下，均方位移（MSD）图证实了位于 T 细胞下方的力传感器群体比未结合的对应物移动显著更慢（右图）。（B）使用霍利迪交叉 DNA 传感器修饰的玻璃支撑流动脂双层进行了相同的分析。E-S 图清晰显示了两个群体，这在 FRET 效率直方图中也明显可见。MSD 图表明存在一个快速移动的传感器群体。缩写：FRET = Förster 共振能量转移；MSD = 均方位移。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="力作用下T细胞受体激活的FRET分析；示意图显示低FRET与高FRET状态。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图5"> 
图5：分子内FRET探针的设计与工作原理。（A）用于量化分子机械力的模拟肽传感器。供体和受体荧光基团共价连接在肽骨架的两端。传感器模块位点特异性地连接到特定配体上，该配体进一步结合细胞表面的目标受体（此处为特异性识别T细胞受体β链的抗体片段）。在受体-配体结合后，力被施加，传感器模块伸展，并在键断裂后最终回缩。此图板修改自16。（B）用于量化FRET转换的数字DNA传感器。FRET传感器由四条DNA链组成，形成一个霍利迪交叉结构（Holliday junction）。供体和受体荧光基团共价连接在其中两条链上。霍利迪交叉结构会根据周围缓冲液条件频繁切换其构象。这些构象的随机切换可通过量化单个探针的FRET效率进行监测。缩写：TCR = T细胞受体；FRET = Förster共振能量转移。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞成像、轨迹、强度图、效率、化学计量分析的FRET分析示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 6"> 
图6：FRET探针定位与追踪的示例。（A）通过定量供体激发下供体荧光团的强度（D → D）、供体激发下受体荧光团的强度（D → A）以及受体激发下受体荧光团的强度（A → A），计算单个事件的FRET效率和化学计量比。最近邻滤波可防止邻近发射体点扩散函数重叠带来的偏差。图像分割允许用户选择定位于特定区域（例如细胞或微图案）内的单分子FRET事件。作为图像分割的一个示例，T细胞用Fura-2染色（左侧显示），并进行自适应阈值处理以识别细胞边缘（橙色虚线）。比例尺 = 5 µm。（B）使用分子力传感器的单分子FRET轨迹。可在x-y平面上绘制单个轨迹，以可视化其扩散行为和定位（左图）。此外，还可将每个轨迹的强度随时间变化作图，以识别FRET转换或漂白步骤（中图显示左图中的红色轨迹）。所得的FRET效率和化学计量比也可类似地可视化（右图）。（C）使用Holliday junction DNA传感器的单分子FRET轨迹。测量过程中使用HBSS + 12 mM MgCl2作为缓冲液。除这些示例序列末端附近明显的受体漂白步骤外，还可确定每种传感器的FRET转换频率。Holliday junction构象转换频率较高，而分子力传感器则不表现出FRET转换。该信息可用于调整实验条件（例如帧间延迟），以增加或减少观察到的转换次数。缩写：FRET = Förster共振能量转移；smFRET = 单分子FRET；HBSS = Hank's平衡盐溶液。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充信息：单分子定位与追踪（01. Tracking.ipynb）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/si.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文介绍了一种利用宽场荧光显微镜对基于移动单分子荧光共振能量转移（smFRET）探针进行时空分析的方法。新开发的软件工具包能够确定运动探针的smFRET时间轨迹，包括随时间变化的准确FRET效率和分子位置。

自动化二维时空分析可移动单分子FRET探针

单分子Förster共振能量转移（smFRET）是一种多功能技术，可检测亚纳米至纳米尺度的距离。

过去，基于表面固定探针的单分子FRET实验几乎 exclusively 针对固定不动的分子进行。然而，许多生物分子具有扩散性，可利用我们的方法进行分析。将单分子FRET与追踪技术相结合，不仅能够分析运动探针的FRET效率随时间变化的轨迹，还可研究其扩散行为等时空特性。我们的方法可与多种不同的基于FRET的探针兼容。例如，该方法可为活细胞实验中的分子力、构象动态以及结合动力学提供深入见解。高质量的单分子FRET实验以难以开展而著称。为了实现可靠的定量分析，重要的是在良好的信噪比下记录数据，并获得足够长度的单分子轨迹。开始样品测量时，对供体和受体荧光染料进行适当时长的激发，同时触发相机，并等待相机读出信号启用。交替重复激发供体和受体荧光染料。选择足够多的重复次数，以确保在视野内每个探针中至少有一个荧光分子发生光漂白，从而允许通过逐步光漂白分析区分单分子信号与聚集体信号。设定照明序列，以便从记录的图像序列中选择供体和受体激发帧，以及用于图像分割的帧。同时，分析使用相同照明设置记录的数据集。为此，为每个数据集分配一个标识符以及与相应图像序列文件名匹配的模式。此外，为特殊用途定义特定数据集，例如用于图像配准的定位标记记录、用于平场校正的激发光轮廓，以及可选的仅供体和仅受体样品，以确定校正因子。接下来，如果两个通道使用同一台相机进行记录，则选择发射通道和原始图像。为此，使用适当的图形控件选择供体和受体发射的合适区域，然后在两个发射通道中定位基准标记物并进行图像配准。使用提供的用户界面，为供体和受体发射通道的定位算法找到合适的参数。接着，在供体激发条件下，基于供体和受体发射图像的叠加图像，设置FRET探针的单分子定位参数；然后在受体激发条件下，设置受体发射通道中探针的定位参数。在所有帧中分别对供体和受体激发下的FRET探针进行定位。结果合并为一个表格，其中包含原始帧编号、二维坐标以及指向源图像文件的标识符。为追踪并测量荧光强度，需为Trackpy算法选择适当的选项，以将FRET探针的定位结果连接成轨迹。接下来，利用分析软件的功能，处理来自图像序列的辅助图像数据。提取在激发序列中标记为 S 的、用于辅助分割的额外图像。最后，通过在高度标记的样本上记录的图像，确定视野范围内供体和受体激发光的光强分布剖面。在初始筛选步骤中，应舍弃点扩散函数重叠的信号，因为难以可靠地确定其荧光强度。若存在照明不均匀的情况，仅接受视野中照明良好区域内的信号，以确保较高的信噪比。若研究分子内FRET，则应将分析限制在图像序列开始时即存在的轨迹。接下来，执行平场校正，利用先前获得的激发光源轮廓来逆转由非均匀照明引起的与位置相关的荧光强度变化，然后计算表观FRET效率和表观化学计量比。为了通过逐步光漂白分析区分单分子探针与聚集体，需分别在供体和受体激发条件下，确定适用于变点检测算法的合适参数，然后执行变点检测算法。为了排除显示模糊光漂白行为的轨迹，需定义荧光强度阈值，低于该阈值则认为荧光染料已发生漂白，然后选择以下选项之一。选项一：受体荧光染料以单步方式漂白，而供体未出现部分漂白。选项二：供体荧光染料以单步方式漂白，且受体未出现部分漂白。第三种情况是其中一个荧光团以单步方式漂白，而另一个荧光团不发生部分漂白；第四种情况是供体和受体荧光团均表现出单步光漂白，或完全不发生光漂白。随后计算供体发射泄漏至受体通道的校正因子、受体直接激发、检测效率以及激发效率。接下来，使用校正因子从表观效率计算FRET效率，从表观化学计量比计算化学计量比。为进一步筛选，仅选择每条轨迹中第一次漂白事件之前的数据点。此外，为将分析限制在单分子探针范围内，仅接受其至少75%的数据点位于适当化学计量比范围内的轨迹。然后在适当的辅助图像上采用全局或自适应阈值方法进行图像分割，以将分析范围限制在视野内的特定区域。绘制效率与化学计量比关系图，以验证具有错误化学计量比的信号已被正确识别并剔除。随后绘制FRET效率的直方图，以提供FRET效率分布的成熟且可靠的概览，并对直方图进行分组，便于不同实验结果之间的直观比较。利用科学 Python 库，可以在笔记本中进一步评估数据，例如进行扩散分析。此处展示了单分子 FRET 事件的可视化与追踪。经过滤的 FRET 事件通过 FRET 效率直方图中的效率-化学计量比图表示。此外，可以通过在XY图或均方位移图中绘制单个轨迹路径来研究迁移率参数。我们平台的输出结果可进一步用于识别移动探针的FRET效率时间轨迹中的转变，例如，用于评估生物分子的构象变化。利用基于FRET的力传感器，该分析平台使我们能够在T细胞早期信号传导过程中量化免疫突触内的单分子力事件。

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