自动化二维时空分析可移动单分子FRET探针

过去，基于表面固定探针的单分子FRET实验几乎 exclusively 针对固定不动的分子进行。然而，许多生物分子具有扩散性，可利用我们的方法进行分析。将单分子FRET与追踪技术相结合，不仅能够分析运动探针的FRET效率随时间变化的轨迹，还可研究其扩散行为等时空特性。

我们的方法可与多种不同的基于FRET的探针兼容。例如，该方法可为活细胞实验中的分子力、构象动态以及结合动力学提供深入见解。高质量的单分子FRET实验以难以开展而著称。

为了实现可靠的定量分析，重要的是在良好的信噪比下记录数据，并获得足够长度的单分子轨迹。开始样品测量时，对供体和受体荧光染料进行适当时长的激发，同时触发相机，并等待相机读出信号启用。交替重复激发供体和受体荧光染料。

选择足够多的重复次数，以确保在视野内每个探针中至少有一个荧光分子发生光漂白，从而允许通过逐步光漂白分析区分单分子信号与聚集体信号。设定照明序列，以便从记录的图像序列中选择供体和受体激发帧，以及用于图像分割的帧。同时，分析使用相同照明设置记录的数据集。

为此，为每个数据集分配一个标识符以及与相应图像序列文件名匹配的模式。此外，为特殊用途定义特定数据集，例如用于图像配准的定位标记记录、用于平场校正的激发光轮廓，以及可选的仅供体和仅受体样品，以确定校正因子。接下来，如果两个通道使用同一台相机进行记录，则选择发射通道和原始图像。

为此，使用适当的图形控件选择供体和受体发射的合适区域，然后在两个发射通道中定位基准标记物并进行图像配准。使用提供的用户界面，为供体和受体发射通道的定位算法找到合适的参数。接着，在供体激发条件下，基于供体和受体发射图像的叠加图像，设置FRET探针的单分子定位参数；然后在受体激发条件下，设置受体发射通道中探针的定位参数。

在所有帧中分别对供体和受体激发下的FRET探针进行定位。结果合并为一个表格，其中包含原始帧编号、二维坐标以及指向源图像文件的标识符。为追踪并测量荧光强度，需为Trackpy算法选择适当的选项，以将FRET探针的定位结果连接成轨迹。

接下来，利用分析软件的功能，处理来自图像序列的辅助图像数据。提取在激发序列中标记为 S 的、用于辅助分割的额外图像。最后，通过在高度标记的样本上记录的图像，确定视野范围内供体和受体激发光的光强分布剖面。

在初始筛选步骤中，应舍弃点扩散函数重叠的信号，因为难以可靠地确定其荧光强度。若存在照明不均匀的情况，仅接受视野中照明良好区域内的信号，以确保较高的信噪比。若研究分子内FRET，则应将分析限制在图像序列开始时即存在的轨迹。

接下来，执行平场校正，利用先前获得的激发光源轮廓来逆转由非均匀照明引起的与位置相关的荧光强度变化，然后计算表观FRET效率和表观化学计量比。为了通过逐步光漂白分析区分单分子探针与聚集体，需分别在供体和受体激发条件下，确定适用于变点检测算法的合适参数，然后执行变点检测算法。

为了排除显示模糊光漂白行为的轨迹，需定义荧光强度阈值，低于该阈值则认为荧光染料已发生漂白，然后选择以下选项之一。选项一：受体荧光染料以单步方式漂白，而供体未出现部分漂白。选项二：供体荧光染料以单步方式漂白，且受体未出现部分漂白。

第三种情况是其中一个荧光团以单步方式漂白，而另一个荧光团不发生部分漂白；第四种情况是供体和受体荧光团均表现出单步光漂白，或完全不发生光漂白。随后计算供体发射泄漏至受体通道的校正因子、受体直接激发、检测效率以及激发效率。

接下来，使用校正因子从表观效率计算FRET效率，从表观化学计量比计算化学计量比。为进一步筛选，仅选择每条轨迹中第一次漂白事件之前的数据点。此外，为将分析限制在单分子探针范围内，仅接受其至少75%的数据点位于适当化学计量比范围内的轨迹。

然后在适当的辅助图像上采用全局或自适应阈值方法进行图像分割，以将分析范围限制在视野内的特定区域。绘制效率与化学计量比关系图，以验证具有错误化学计量比的信号已被正确识别并剔除。随后绘制FRET效率的直方图，以提供FRET效率分布的成熟且可靠的概览，并对直方图进行分组，便于不同实验结果之间的直观比较。

利用科学 Python 库，可以在笔记本中进一步评估数据，例如进行扩散分析。此处展示了单分子 FRET 事件的可视化与追踪。经过滤的 FRET 事件通过 FRET 效率直方图中的效率-化学计量比图表示。

此外，可以通过在XY图或均方位移图中绘制单个轨迹路径来研究迁移率参数。我们平台的输出结果可进一步用于识别移动探针的FRET效率时间轨迹中的转变，例如，用于评估生物分子的构象变化。

利用基于FRET的力传感器，该分析平台使我们能够在T细胞早期信号传导过程中量化免疫突触内的单分子力事件。