从小鼠视网膜中分离内皮细胞用于下一代测序

这种视网膜内皮细胞分离方法将有助于采用先进的测序技术揭示血管发育的新机制。所述方案已优化至高存活率和高纯度，这对于新一代测序应用至关重要。本实验操作将由赫希实验室的研究生 Shelby Cain 演示。

使用解剖剪在眼睑处作垂直切口，剪除覆盖眼球的皮肤和膜，开始从已处死的新生小鼠身上摘除眼球。然后用镊子在眼球上下方按压，使眼球脱离眼窝。用镊子小心夹住眼球下方，并剪断连接眼球的视神经。

然后将小鼠的两只眼睛放入48孔板的一个孔中，置于新配制的预冷PBS中，直至完成所有眼球的采集。为分离小鼠视网膜组织，使用带宽口移液管头的转移管，将眼球转移至含有500 µL预冷PBS的培养皿中的解剖垫上并悬浮。在解剖显微镜下操作，用一把精细镊子夹住视神经，用另一把镊子在角膜与巩膜连接处刺穿前房形成小孔。

然后沿角膜约75%的范围撕裂成一个环形孔。用一把镊子夹住视神经，同时用第二把镊子轻轻撕除巩膜和玻璃体，使其与视网膜组织分离。为去除晶状体和玻璃体动脉系统（hyaloid plexus vessels），将镊子张开后伸入视网膜内部，接近但不接触视网膜，然后闭合镊子，夹住并从视网膜中拉出晶状体及玻璃体动脉系统。

当所有血管去除后，将视网膜放入装有500微升冰上预冷的1×PBS的2毫升微量离心管中。用移液器吸除2毫升微量离心管中多余的PBS，保留约100微升PBS以完全覆盖视网膜组织。随后向管中加入500微升 freshly prepared 消化液。

使用 P1000 移液器和移液枪头，在消化液中上下吹打视网膜组织 5 次。操作完成后，将消化混合物置于 37 °C 水浴中孵育 20 分钟，每 5 分钟上下吹打消化混合物一次，方法如前所述。孵育结束后，视网膜组织将溶解形成单细胞悬液，使消化混合物变浑浊。

接下来，将细胞在4°C条件下以375×g离心5分钟，使细胞沉淀。离心后，用移液器吸除洗涤后细胞沉淀中的PBS，然后通过将沉淀重悬于每0.5×10⁶个细胞加入100 µL抗体染色溶液中对细胞进行免疫染色。将单细胞悬液与抗体染色溶液在冰上避光孵育30分钟，每隔10分钟轻敲管壁以温和混匀细胞。

进行荧光激活细胞分选时，将细胞在4摄氏度下以375g离心5分钟，使细胞沉淀。去除上清液后，用500微升PBS重悬并再次离心收集细胞，操作步骤同前。随后，用移液器轻轻混匀，将细胞重悬于300微升荧光激活细胞分选缓冲液（FACS缓冲液）中。

接下来，向含有 FACS 缓冲液的样品管中加入碘化丙啶（propidium iodide）或 PI 作为活力标记物，使其终浓度为 0.5 微克/毫升。使用移液器将细胞悬液通过带有 35 微米滤膜的细胞筛 snap cap 转移至 5 毫升离心管中。过滤后，将 FACS 管置于冰上避光保存，然后将该管转移至细胞分选仪中。

打开流式细胞仪和计算机，启动流式细胞仪软件以运行和操作仪器。执行常规质量控制测试。将对照染色样本加载到流式细胞仪中，以调整坐标轴。

首先使用仅含IgG抗体的细胞来设定和调整前向散射光和侧向散射光，然后使用仅含CD31抗体的细胞来设定和调整CD31信号，最后使用仅含CD45抗体的细胞来设定和调整CD45信号。

记录对照样品的数据。接着，将染色后的样品细胞加入流式细胞仪中并运行样品。根据前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）参数对细胞进行门控分析。

通过FSCA和FSCH对细胞进行门控，以识别细胞双联体，并仅收集单个细胞。通过PI和SSCA对细胞进行门控，以识别活细胞。使用对照样本建立CD31+CD45-门控，通过CD31和CD45对细胞进行门控。

在仪器中插入含有 250 微升 FACS 缓冲液的收集管。接着，开始分选 CD31+CD45- 的细胞至已安装的收集管中。分选完成后，将收集管置于冰上，用于后续分析。

样本可进行下一代测序应用的处理。在该研究中，消化时间的变化影响了细胞得率和活细胞百分比。20分钟的消化时间可获得最佳得率，且内皮细胞中非活细胞的比例较低。

后续的碘化丙啶染色表明，分离得到的内皮细胞在分离后60分钟内仍保持活性。通过定量PCR（qPCR）分析内皮细胞基因的表达水平，评估细胞群的纯度，结果显示CD31+CD45-细胞群中内皮细胞基因显著富集。从分离的内皮细胞中提取RNA，经反转录并扩增生成cDNA，再进行文库构建和测序。cDNA文库在九个独立样本中鉴定出超过16,000个基因。

在低于该阈值的基因中，每百万条读段的转录本数（TPM）出现下降。通过10x Genomics流程对分离的视网膜内皮细胞进行单细胞RNA测序，结果在917个细胞中平均每个细胞检测到1,171个基因，共检测到15,247个基因，每个细胞的唯一分子标识符（UMI）计数中位数为2,255。本方案中的关键步骤是视网膜组织的分离和组织消化，应严格按照所述方法准确操作，以优化细胞得率和存活率。

分离得到的内皮细胞可用于先进的测序技术，例如全转录组RNA测序、单细胞RNA测序、染色质免疫沉淀测序以及转座酶可及性染色质测序。将该优化方法与下一代测序技术结合，并辅以计算分析方法，可进一步阐明调控血管发育的相互关联信号通路的作用机制。