Name: 小鼠视网膜内皮细胞分离用于二代测序 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: 学习从新生小鼠视网膜中分离高纯度内皮细胞的方法，该方案经过优化可获得高产量和活性的细胞，适用于二代测序等下游应用，有助于揭示血管发育的新机制。

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感谢耶鲁大学流式细胞术中心、弗吉尼亚大学流式细胞术核心实验室、耶鲁大学基因组分析中心以及弗吉尼亚大学基因组分析与技术核心实验室在本研究实验中所提供的努力、专业知识和建议。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助编号如下：N.W.C.（T32 HL007224、T32 HL007284），S.C.（T32 HL007284），K.W.（R01 HL142650），以及 K.K.H.（R01 HL146056、R01 DK118728、UH3 EB025765）。

耶鲁大学和弗吉尼亚大学的机构动物护理与使用委员会已批准本方案中列出的所有动物实验。
1. 获取小鼠眼球以分离视网膜
<ol>
	<li>配制 1x 预冷 PBS 并加入 500 μL 向48孔板的每个孔中加入。</li>
	<li>根据批准的机构指南，在出生后第六天（P6）处死新生小鼠。本实验中，每窝约4-8只新生小鼠在P6处死 通过 吸入异氟烷至少三分钟以确保呼吸停止，随后进行断头处死。</li>
	<li>将每只小鼠的眼球取出。使用解剖剪沿垂直于眼睑的方向剪开眼球表面的皮肤和膜。然后用镊子轻轻按压眼球上方和下方，使眼球脱离眼窝。
	<ol>
		<li>用镊子轻轻夹住眼睛下方，剪断连接眼球的视神经。然后将每只眼球放入已准备好的含有冰上预冷的1×PBS的48孔板中，直至完成所有眼球的采集。 
		注意：每只小鼠使用一个孔，同一只小鼠的两只眼睛置于同一孔中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 分离小鼠视网膜组织
<ol>
	<li>在培养皿底部铺上解剖垫，加入 500 μL 冰冷的 1× PBS，使眼球完全浸没，并将培养皿置于解剖显微镜下，放大倍数设为 4.0×。
	<ol>
		<li>使用带宽口的移液管将眼球悬浮于解剖垫上，避免损伤眼球。 
		注意：确保眼球完全被 PBS 覆盖。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用两把精细解剖镊，用其中一把镊子夹住视神经以固定眼球，用另一把镊子在角膜与巩膜连接处的前房位置刺一个小孔（图 1B）。沿角膜周围撕开一个约 75% 圆周的环形裂口。
	<ol>
		<li>在继续用一把镊子夹住视神经的同时，用第二把镊子轻轻将巩膜从视网膜组织上撕离。</li>
		<li>同上，用第二把镊子轻轻撕除视网膜组织上的玻璃体。</li>
		<li>再次使用第二把镊子，小心移除在去除玻璃体时未一并脱落的晶状体及玻璃体动脉丛血管。操作时，将打开的镊子伸入视网膜内部，接近但不接触视网膜，然后闭合镊子以夹住晶状体和玻璃体动脉丛血管，并将镊子从视网膜中抽出。可重复此操作，直至所有血管完全清除。 
		注意：玻璃体动脉丛呈透明、网状结构。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向 2 mL 微离心管中加入 500 μL 冰冷的 1× PBS，并将分离出的视网膜放入管中。将所有眼球中的视网膜分离后，立即置于冰上 PBS 中，再进行后续操作。 
	注意：每只小鼠使用一个离心管，同一只小鼠的两只视网膜置于同一管中。若视网膜组织撕裂，可分段转移。一窝小鼠的视网膜组织解剖全过程（从安乐死开始至最终完成视网膜分离）应在 15–60 分钟内完成。</li>
</ol>
<img alt="视网膜组织分离过程与FACS；包括眼球切面示意图和细胞沉淀图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63133/63133fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：分离方案概览。（A）分离流程的时间线示意图，并标注每一步的预计耗时：视网膜组织分离、消化、抗体染色、FACS 和细胞活力检测窗口。（B）从眼球中逐步分离视网膜组织的操作指南，编号表示解剖步骤：1）刺穿角膜，2）撕开角膜，3）撕开巩膜，4）将巩膜从视网膜上剥离，5）进一步清除视网膜上的巩膜及连接组织，6）去除视网膜上的玻璃体及玻璃体血管。（C）视网膜组织在不同消化阶段的代表性图像：消化前、消化后、沉淀物（黑色箭头指示视网膜组织或细胞沉淀）。经 Chavkin 等人授权转载，原载于 S. Karger AG, Basel17。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63133/63133fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
3. 将视网膜组织消化为单细胞悬液
<ol>
	<li>每分离两份视网膜组织，准备 500 μL 消化液。将胎牛血清（FBS）和 II 型胶原酶加入 DMEM 培养基中，使终浓度分别为 10% FBS 和 1 mg/mL II 型胶原酶。混匀后，将溶液置于 37 °C 水浴中预热。</li>
	<li>用移液器小心吸除 2 mL 微离心管中多余的 PBS，保留足以完全覆盖视网膜组织的 PBS 量，每管约 100 μL。</li>
	<li>向每管含有视网膜组织的样品中加入 500 μL 消化液（图 1C）。
	<ol>
		<li>使用 P1000 移液器和吸头，在消化液中上下吹打视网膜组织五次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将消化混合物置于 37 °C 水浴中孵育 20 分钟。
	<ol>
		<li>每隔 5 分钟使用 P1000 移液器和吸头将消化混合物上下吹打一次。孵育结束后，视网膜组织应已完全解离为单细胞悬液，因此消化混合物呈现浑浊状态（图 1C）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 细胞计数
<ol>
	<li>将台式离心机设置在 4 °C，并将消化混合物管放入其中。在 375 ×g 条件下离心 5 分钟，使消化混合物中的细胞沉淀。</li>
	<li>用移液器小心吸除上清液消化液，注意不要扰动细胞沉淀（图 1C）。用移液器轻轻吹打，将沉淀重悬于 500 μL 冰冷的 1× PBS 中。</li>
	<li>在显微镜下使用血细胞计数板对细胞进行计数。 
	注意：每两只视网膜的细胞数量约为 1 × 106 个细胞。</li>
	<li>通过轻柔混匀确保细胞充分重悬，然后将 20 μL 细胞悬液分装至三个管中，用于对照染色（管 1：IgG 对照，管 2：CD31 对照，管 3：CD45 对照），具体方法如先前所述17,18。</li>
	<li>将台式离心机设置在 4 °C，并将含有细胞的管放入其中。在 375 × g 条件下离心 5 分钟，使细胞沉淀。</li>
</ol>
5. 使用抗体对细胞进行免疫染色
<ol>
	<li>每染色两份视网膜样本外加四个对照管，准备 100 μL 染色缓冲液。向 HBSS 缓冲液中加入 FBS、HEPES 和 D-葡萄糖，使其终浓度分别为 10% FBS、10 mM HEPES 和 1 mg/mL D-葡萄糖。</li>
	<li>获取荧光标记的 CD31 和 CD45 抗体。将抗体以 1:100 的稀释比例加入染色缓冲液中（管 1：仅加入 IgG 抗体，管 2：仅加入 CD31 抗体，管 3：仅加入 CD45 抗体）。每 100 μL 染色缓冲液中加入 1 μL 抗体，使抗体终浓度为 2 μg/mL。</li>
	<li>用移液器小心吸除洗涤后细胞沉淀中的 PBS。</li>
	<li>每 0.5 × 106 个细胞用 100 μL 抗体染色液重悬沉淀。
	<ol>
		<li>将单细胞悬液与抗体染色液在冰上避光孵育 30 分钟。每隔 10 分钟轻弹管壁，轻轻混匀细胞。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 准备进行荧光激活细胞分选
<ol>
	<li>将台式离心机设置为 4 °C，将含有细胞的离心管放入其中。在 4 °C 下以 375 × g 离心 5 分钟，使细胞沉淀。
	<ol>
		<li>吸除上清液，并用 500 μL 的 1× PBS 重悬细胞，进行洗涤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将台式离心机设置为 4 °C，将含有细胞的离心管放入其中。在 4 °C 下以 375 × g 离心 5 分钟，使细胞沉淀。</li>
	<li>配制 1.5 mL FACS 缓冲液（含 1% FBS 的 1× PBS）。
	<ol>
		<li>吸除上清液，用 300 μL FACS 缓冲液轻轻吹打重悬细胞沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向含有 FACS 缓冲液的样品管中加入碘化丙啶（PI），使其终浓度为 0.5 μg/mL。PI 用作细胞活力标记物。</li>
	<li>通过带 snap cap 的细胞筛网将细胞悬液转移并合并至 5 mL 测试管中。带 snap cap 的细胞筛网应含有 35 μm 滤膜，可直接将细胞悬液用移液器加至滤膜上。
	<ol>
		<li>将 FACS 管置于冰上避光保存，并转移至流式细胞分选仪。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 设置流式细胞仪
<ol>
	<li>将一个100 µm喷嘴安装到流式细胞分选仪（FACS）中。 
	注意：此规格喷嘴可最小化收集体积并最大化分离细胞的密度。</li>
	<li>取250 μL的1×PBS加入1.5 mL微量离心管中，作为收集管安装至FACS仪器中。</li>
</ol>
8. 分离有活力的内皮细胞 通过 FACS
<ol>
	<li>打开流式细胞仪和计算机。点击计算机上的流式细胞仪软件图标，启动软件以运行和操作流式细胞仪。执行常规质量控制测试。</li>
	<li>将对照染色样本加载到流式细胞仪中以调整坐标轴。首先使用仅含IgG抗体的细胞来设置并调整FSC和SSC，然后使用仅含CD31抗体的细胞来设置并调整CD31，再使用仅含CD45抗体的细胞来设置并调整CD45。记录对照样本的数据。</li>
	<li>将染色后的样本细胞加载到流式细胞仪中并运行样本。</li>
	<li>根据前向散射和侧向散射（分别为FSC-A和SSC-A）参数对细胞进行设门（图2A）。 
	注意：FSC-A和SSC-A参数用于根据细胞大小、密度、颗粒度、表面特性及折射率来筛选细胞。</li>
	<li>通过FSC-A和FSC-H对细胞设门，以识别细胞双联体，并仅收集单细胞（图2A）。 
	注意：FSC-A和FSC-H参数基于前向散射原理来筛选单细胞，即在前向散射过程中，细胞双联体会表现为具有更高面积与高度比的液滴。</li>
	<li>通过PI和SSC-A对细胞设门，以识别活细胞（图2A）。 
	注意：活细胞为PI阴性。</li>
	<li>使用对照样本建立CD31+/CD45-设门，并基于CD31和CD45对细胞进行设门（图2A、B）。
	<ol>
		<li>插入含有250 μL流式缓冲液的收集管。</li>
		<li>开始将CD31阳性/CD45阴性的细胞分选至已安装的收集管中。</li>
		<li>将收集管置于冰上，用于后续分析。此时样本可用于下一代测序应用1。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. 进行细胞活力检测
<ol>
	<li>取10 μL细胞与10 μL 0.4%台盼蓝溶液混合，以评估细胞活力。</li>
	<li>将染色后的混合液用移液器加至血细胞计数板上，计数活细胞。将计数板置于显微镜下进行准确的活力计数。蓝色细胞计为非活细胞，透明细胞计为活细胞。
	<ol>
		<li>用活细胞数除以总细胞数，计算细胞活力百分比。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. 进行基因表达检测
<ol>
	<li>每份样品获取 10,000–20,000 个细胞，并进行 RNA 提取以分析小鼠视网膜内皮细胞的基因表达。RNA 提取采用市售试剂盒，该试剂盒利用基于乙醇的 RNA 沉淀方法，随后通过离心和膜柱洗涤并洗脱来自细胞裂解液的纯化 RNA。此步骤完成后，样品可直接用于部分高通量测序应用。1.</li>
	<li>使用逆转录酶及配套试剂将RNA反转录为cDNA19.</li>
	<li>使用DNA结合染料和定量PCR（qPCR）仪器进行定量20. 在384孔qPCR板中加入cDNA样本和用于扩增目的基因的引物。反应体系总体积应为 10 µL，包括用于定量基因扩增的DNA结合染料。
	<ol>
		<li>使用 CD31、VE-Cadherin、CD45 和 β-actin 的上下游引物检测基因表达。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将样品用于下一代测序应用1.</li>
</ol>

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</ol>

作者无相关披露信息。

本方案描述了一种从小鼠出生后视网膜组织中分离内皮细胞的方法，该方法已优化以获得高细胞数量、高纯度和高活性。通过CD31+/CD45-免疫染色，利用流式细胞术（FACS）从消化后的单细胞悬液中分离内皮细胞群体，从而获得细胞纯度。通过台盼蓝染色检测细胞活性，以及通过qPCR检测CD31、CD45和VE-钙黏蛋白（VE-Cadherin）的基因表达（尽管VE-钙黏蛋白未用于免疫染色）来定量评估分离质量。本方案的关键步骤为视网膜组织的分离和组织消化。视网膜组织分离应迅速进行，以维持细胞活性，并确保操作准确以提高细胞纯度。组织消化应按照所述方法进行，以优化细胞得率和细胞活性。
当将本方案应用于不同时间点、转基因小鼠或不同下游应用时，可对本方案进行相应修改。在研究成年小鼠视网膜组织时，这一点尤为重要，因为成年组织可能比P6阶段的视网膜组织更为成熟，需要更长的消化时间才能分离出纯净且具有活性的内皮细胞。修改方案时，必须优化视网膜组织的分离条件和消化时间。细胞得率低时，可能需要更换新鲜的消化酶、延长消化时间或使用新的FACS抗体。纯度低时，可能需要更换FACS抗体。活性低时，可能需要加快视网膜组织...

核酸测序的高通量能力 通过 下一代测序技术极大地推动了研究人员对分子与细胞生物学的认识。这些先进技术包括全转录组RNA测序、靶向DNA区域测序以鉴定单核苷酸多态性（SNPs）、染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）中对结合的转录因子进行DNA测序、转座酶可及染色质检测测序（ATAC-seq）中对开放染色质区域进行DNA测序，以及单细胞RNA测序1在血管生物学领域，这些进展使研究人员能够阐明发育和疾病中复杂的机制，并区分出不同表型连续变化过程中的基因表达模式2,3未来的实验可通过将下一代测序技术与已评估的血管发育模型相结合，进一步阐明复杂的机制，但样品制备方法需与先进的测序技术相兼容。
新一代测序技术的质量、准确性和可重复性取决于样本制备方法。在从组织中分离特定细胞亚群或制备单细胞悬液时，最佳的消化和纯化方法对于最大化细胞数量、细胞活力以及细胞群体的纯度至关重要4,5。这要求在消化方法上取得平衡：较强的消化作用对于从组织中释放细胞并获得足够数量的细胞以进行后续实验是必要的，但如果消化过度，则会对细胞活力产生负面影响6,7。此外，细胞群体的纯度对于获得可靠的结果和准确的数据分析也十分关键，这一点可通过流式细胞分选（FACS）实现。因此，优化细胞分离方法对于将新一代测序技术应用于已建立的血管发育模型具有重要意义。
研究血管发育的一个特征明确的模型是小鼠视网膜血管发育模型。小鼠视网膜血管系统在出生后于二维表层血管丛中发育，出生后第3天（P3）即可观察到从视神经开始的初始血管生成出芽，P6时可见具有领头细胞和尾随细胞的血管生成前沿以及初始的血管成熟现象，P9之后可观察到血管丛的进一步成熟8,9。在初始血管丛重塑过程中，不同血管中的内皮细胞会分化为动脉、毛细血管和静脉表型，从而形成循环网络10,11。因此，该方法使研究人员能够在发育的不同时间点观察血管生成性血管丛的形成以及内皮细胞的动静脉特化与成熟过程9。此外，该模型还提供了一种研究转基因操作对血管生成和血管丛发育影响的方法，已被广泛应用于血管发育、动静脉畸形以及氧诱导新生血管形成的研究中12,13,14,15,16。为了将新一代测序技术与小鼠视网膜血管发育模型相结合，有必要建立一种从视网膜组织中分离内皮细胞的优化方案。
本方案描述了一种优化的小鼠P6期视网膜组织消化方法，旨在最大化细胞得率、纯度和活性。从小鼠P6期视网膜组织中分离组织，消化20分钟，经CD31和CD45免疫染色后，通过流式细胞分选（FACS）获得内皮细胞的单细胞悬液，整个过程约需2.5小时（图1A）。研究发现，这些内皮细胞在分离后60分钟内仍保持高活性17，可用于构建适用于下一代测序技术的文库。此外，本方案还提供了使用该分离方法进行流式细胞分选门控策略及两种不同下一代测序方法的质量控制结果示例：全转录组RNA测序和单细胞RNA测序。该方法可将下一代测序技术与视网膜血管化模型相结合，有助于揭示血管发育的新机制。

<table><tbody><tr><td>2 mL Eppendorf&amp;nbsp;安全锁扣管</td><td>USA Scientific</td><td>&lt;em&gt;4036-3352&lt;/em&gt;</td><td></td></tr><tr><td>带细胞筛网 snap-cap 的 5 ml Falcon 试管</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 非 TC 处理培养皿</td><td>Corning</td><td>430589</td><td></td></tr><tr><td>APC 大鼠抗小鼠 CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>551262</td><td></td></tr><tr><td>APC 大鼠 IgG2a &amp;kappa; 同型对照</td><td>BD Biosciences</td><td>&lt;em&gt;553932&lt;/em&gt;</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSChorus 软件</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCHORUS</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSMelody 细胞分选仪</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSMELODY</td><td></td></tr><tr><td>II 型胶原酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>234115</td><td></td></tr><tr><td>Costar 48 孔透明 TC 处理多孔板，独立包装，无菌</td><td>Corning</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Gibco</td><td>A2494001</td><td></td></tr><tr><td>一次性刻度移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>解剖盘蜡</td><td>Carolina</td><td>629100</td><td></td></tr><tr><td>解剖剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14085-08</td><td></td></tr><tr><td>解剖体视显微镜 M165 FC</td><td>Leica</td><td>M165FC</td><td></td></tr><tr><td>杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Gibco</td><td>11965-052</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;nbsp;Flex-Tubes 微量离心管 1.5 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22364120</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gemini Bio</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>精细解剖镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>11250-00</td><td></td></tr><tr><td>亨克氏平衡盐溶液（HBSS）</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>HEPES（1M）</td><td>Gibco</td><td>15630130</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA 合成试剂盒</td><td>Bio-Rad</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷，USP</td><td>Covetrus</td><td>11695067772</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 通用精密水浴锅</td><td>Fisher Scientific</td><td>FSGPD20</td><td></td></tr><tr><td>引物：ActB_Forward：5&amp;rsquo;- agagggaaatcgtgcgtgac -3&amp;rsquo;</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>引物：ActB_Reverse：5&amp;rsquo;- caatagtgatgacctggccgt -3&amp;rsquo;</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>引物：CD31_Forward：5&amp;rsquo;- gagcccaatcacgtttcagttt -3&amp;rsquo;</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>引物：CD31_Reverse：5&amp;rsquo;- tccttcctgcttcttgctagct -3&amp;rsquo;</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>引物：CD45_Forward：5&amp;rsquo;- gggttgttctgtgccttgtt -3&amp;rsquo;</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>引物：CD45_Reverse：5&amp;rsquo;- ctggacggacacagttagca -3&amp;rsquo;</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>引物：VE-Cadherin_Forward：5&amp;rsquo;- tcctctgcatcctcactatcaca -3&amp;rsquo;</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>引物：VE-Cadherin_Reverse：5&amp;rsquo;- gtaagtgaccaactgctcgtgaat -3&amp;rsquo;</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 21R 冷冻离心机</td><td>ThermoFisher</td><td>75002477</td><td></td></tr><tr><td>SYBR-Green iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5120</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>ThermoFisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>V450 大鼠抗小鼠 CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>560501</td><td></td></tr><tr><td>V450 大鼠 IgG2b，&amp;kappa; 同型对照</td><td>BD Biosciences</td><td>560457</td><td></td></tr></tbody></table>

从小鼠视网膜中分离内皮细胞用于下一代测序

Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing

新一代测序技术的近期进展极大地推动了研究人员对分子与细胞生物学的认识，多项研究揭示了血管生物学中的新范式。将这些方法应用于血管发育模型的研究，需要优化从胚胎及出生后组织中分离细胞的技术。为了从新一代测序方法中获得准确且可重复的结果，细胞得率、活力和纯度均需达到最大化。新生小鼠视网膜血管化模型被研究人员广泛用于研究血管发育的机制。该模型已被用于探究血管生成以及血管形成与成熟过程中动静脉命运决定的机制。将新一代测序技术应用于视网膜血管发育模型的研究，需要优化一种视网膜内皮细胞分离方法，以最大化细胞得率、活力和纯度。本方案描述了一种利用荧光激活细胞分选（FACS）对小鼠视网膜组织进行分离、消化和纯化的方法。结果表明，经FACS纯化的CD31+/CD45-内皮细胞群体中内皮细胞相关基因表达高度富集，且分选后60分钟内细胞活力无明显变化。本文还提供了采用该方法分离的内皮细胞进行新一代测序的代表性结果，包括批量RNA测序和单细胞RNA测序，证明该视网膜内皮细胞分离方法适用于新一代测序应用。该视网膜内皮细胞分离方法将有助于利用先进的测序技术揭示血管发育的新机制。

视网膜组织经消化并进行CD31和CD45免疫染色后，在对细胞、单细胞及活细胞设门分析后，可识别出一群明显的CD31+/CD45-内皮细胞（图2A）。必须进行CD45免疫染色以排除CD31+/CD45+细胞，后者包括血小板和部分白细胞21。每次实验均应设置对照，以验证抗体特异性并指导设门策略（图2B）。该细胞群比例相对较低，约占消化后单细胞悬液中所有细胞的0.5%-1.0%。
可通过碘化丙啶染色的定量分析以及从不同细胞群中分离的RNA进行基因表达分析，来评估细胞的存活率和纯度。不同的消化时间会影响细胞得率和存活率百分比，其中20分钟的消化时间可获得最佳得率，且内皮细胞的非存活率较低（图3A）。分离的内皮细胞在分离后60分钟内仍保持存活状态，通过后续的碘化丙啶染色进行测定（图3B）。通过qPCR分析内皮...

本方案描述了一种用于分离小鼠出生后视网膜内皮细胞的方法，该方法在细胞得率、纯度和活力方面均经过优化。这些细胞适用于下一代测序技术。

下一代测序技术的近期进展推动了研究人员对分子与细胞生物学的认识，多项研究……

这种视网膜内皮细胞分离方法将有助于采用先进的测序技术揭示血管发育的新机制。所述方案已优化至高存活率和高纯度，这对于新一代测序应用至关重要。本实验操作将由赫希实验室的研究生 Shelby Cain 演示。使用解剖剪在眼睑处作垂直切口，剪除覆盖眼球的皮肤和膜，开始从已处死的新生小鼠身上摘除眼球。然后用镊子在眼球上下方按压，使眼球脱离眼窝。用镊子小心夹住眼球下方，并剪断连接眼球的视神经。然后将小鼠的两只眼睛放入48孔板的一个孔中，置于新配制的预冷PBS中，直至完成所有眼球的采集。为分离小鼠视网膜组织，使用带宽口移液管头的转移管，将眼球转移至含有500 µL预冷PBS的培养皿中的解剖垫上并悬浮。在解剖显微镜下操作，用一把精细镊子夹住视神经，用另一把镊子在角膜与巩膜连接处刺穿前房形成小孔。然后沿角膜约75%的范围撕裂成一个环形孔。用一把镊子夹住视神经，同时用第二把镊子轻轻撕除巩膜和玻璃体，使其与视网膜组织分离。为去除晶状体和玻璃体动脉系统（hyaloid plexus vessels），将镊子张开后伸入视网膜内部，接近但不接触视网膜，然后闭合镊子，夹住并从视网膜中拉出晶状体及玻璃体动脉系统。当所有血管去除后，将视网膜放入装有500微升冰上预冷的1×PBS的2毫升微量离心管中。用移液器吸除2毫升微量离心管中多余的PBS，保留约100微升PBS以完全覆盖视网膜组织。随后向管中加入500微升 freshly prepared 消化液。使用 P1000 移液器和移液枪头，在消化液中上下吹打视网膜组织 5 次。操作完成后，将消化混合物置于 37 °C 水浴中孵育 20 分钟，每 5 分钟上下吹打消化混合物一次，方法如前所述。孵育结束后，视网膜组织将溶解形成单细胞悬液，使消化混合物变浑浊。接下来，将细胞在4°C条件下以375×g离心5分钟，使细胞沉淀。离心后，用移液器吸除洗涤后细胞沉淀中的PBS，然后通过将沉淀重悬于每0.5×10⁶个细胞加入100 µL抗体染色溶液中对细胞进行免疫染色。将单细胞悬液与抗体染色溶液在冰上避光孵育30分钟，每隔10分钟轻敲管壁以温和混匀细胞。进行荧光激活细胞分选时，将细胞在4摄氏度下以375g离心5分钟，使细胞沉淀。去除上清液后，用500微升PBS重悬并再次离心收集细胞，操作步骤同前。随后，用移液器轻轻混匀，将细胞重悬于300微升荧光激活细胞分选缓冲液（FACS缓冲液）中。接下来，向含有 FACS 缓冲液的样品管中加入碘化丙啶（propidium iodide）或 PI 作为活力标记物，使其终浓度为 0.5 微克/毫升。使用移液器将细胞悬液通过带有 35 微米滤膜的细胞筛 snap cap 转移至 5 毫升离心管中。过滤后，将 FACS 管置于冰上避光保存，然后将该管转移至细胞分选仪中。 打开流式细胞仪和计算机，启动流式细胞仪软件以运行和操作仪器。执行常规质量控制测试。将对照染色样本加载到流式细胞仪中，以调整坐标轴。首先使用仅含IgG抗体的细胞来设定和调整前向散射光和侧向散射光，然后使用仅含CD31抗体的细胞来设定和调整CD31信号，最后使用仅含CD45抗体的细胞来设定和调整CD45信号。记录对照样品的数据。接着，将染色后的样品细胞加入流式细胞仪中并运行样品。根据前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）参数对细胞进行门控分析。通过FSCA和FSCH对细胞进行门控，以识别细胞双联体，并仅收集单个细胞。通过PI和SSCA对细胞进行门控，以识别活细胞。使用对照样本建立CD31+CD45-门控，通过CD31和CD45对细胞进行门控。在仪器中插入含有 250 微升 FACS 缓冲液的收集管。接着，开始分选 CD31+CD45- 的细胞至已安装的收集管中。分选完成后，将收集管置于冰上，用于后续分析。样本可进行下一代测序应用的处理。在该研究中，消化时间的变化影响了细胞得率和活细胞百分比。20分钟的消化时间可获得最佳得率，且内皮细胞中非活细胞的比例较低。后续的碘化丙啶染色表明，分离得到的内皮细胞在分离后60分钟内仍保持活性。通过定量PCR（qPCR）分析内皮细胞基因的表达水平，评估细胞群的纯度，结果显示CD31+CD45-细胞群中内皮细胞基因显著富集。从分离的内皮细胞中提取RNA，经反转录并扩增生成cDNA，再进行文库构建和测序。cDNA文库在九个独立样本中鉴定出超过16,000个基因。在低于该阈值的基因中，每百万条读段的转录本数（TPM）出现下降。通过10x Genomics流程对分离的视网膜内皮细胞进行单细胞RNA测序，结果在917个细胞中平均每个细胞检测到1,171个基因，共检测到15,247个基因，每个细胞的唯一分子标识符（UMI）计数中位数为2,255。本方案中的关键步骤是视网膜组织的分离和组织消化，应严格按照所述方法准确操作，以优化细胞得率和存活率。分离得到的内皮细胞可用于先进的测序技术，例如全转录组RNA测序、单细胞RNA测序、染色质免疫沉淀测序以及转座酶可及性染色质测序。将该优化方法与下一代测序技术结合，并辅以计算分析方法，可进一步阐明调控血管发育的相互关联信号通路的作用机制。

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科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

小鼠视网膜内皮细胞分离用于二代测序

在本视频中，我们将演示如何从小鼠眼球的睫状上皮中分离视网膜干细胞，并在体外培养以形成克隆性视网膜球体。所获得的球状细胞集落具有干细胞的核心特性：自我更新能力与多向分化潜能。...

从小鼠眼球中分离视网膜干细胞

本视频演示了使用流式细胞术分离小鼠原代视网膜神经节细胞（RGCs）的操作流程。该方法可为未来RGCs的研究提供支持，旨在更深入地理解神经退行性疾病中功能性RGCs丢失所导致的视力显著下降机制。...

使用荧光激活细胞分选法分离小鼠视网膜神经节细胞

分离心脏瓣膜内皮细胞（VECs）的能力对于理解瓣膜发育、维持及疾病机制至关重要。本文描述了利用FACS技术从胚胎期和成年 Tie2-GFP...

小鼠瓣膜内皮细胞的分离

造血干细胞和祖细胞（HSPC）在发育过程中来源于特化的（生血性）内皮细胞，但关于部分内皮细胞如何特化为造血细胞的过程仍知之甚少。我们展示了一种基于流式细胞术的方法，可从鼠胚组织中同时分离生血性内皮细胞和HSPC。...

小鼠胚胎造血性内皮细胞的分离

本文介绍了一种在分离神经元细胞前对其进行分类，并对单细胞转录组进行后续表征的组合方法。该方案优化了样本制备流程，以确保RNA测序（RNA-Seq）的成功，并描述了一种专门用于深入理解细胞多样性的方法学。...

视网膜神经节细胞特定亚群的单细胞RNA测序

数百万人患有导致不可逆失明的视网膜退行性疾病。这些疾病的一个共同特征是视网膜神经节细胞（RGCs）的丧失。本详细实验方案描述了通过流式细胞术结合阳性与阴性筛选方法分离原代小鼠RGCs的技术。...

通过流式细胞术分离原代小鼠视网膜神经节细胞（RGCs）

我们介绍一种方法，用于从暴露于稳定或扰动血流条件的小鼠颈动脉管腔中分离内皮细胞和细胞核，以进行单细胞组学实验。...

从小鼠颈动脉管腔中分离内皮细胞用于单细胞多组学实验

本文描述了一种从小鼠眼球中逐步分离视网膜色素上皮（RPE）细胞的简化方案。该方案包括小鼠眼球的摘除与解剖，随后进行RPE细胞的分离、接种与培养。...

原代小鼠视网膜色素上皮细胞的分离

本文介绍了一种基于磁珠分离小鼠皮肤淋巴毛细血管内皮细胞的方法。所分离的淋巴内皮细胞可用于后续实验 体外 实验和蛋白质表达分析...

小鼠皮肤淋巴管内皮细胞的分离

视网膜色素上皮（RPE）在脉络膜和视网膜之间起着至关重要的屏障作用，有助于维持视网膜细胞类型（如光感受器细胞）的健康与功能。本文中，我们描述了一种简单且有效的成年小鼠RPE分离与培养方案。...

一种简化的小鼠成年视网膜色素上皮细胞分离与培养方法

视网膜在其层状结构中表现出复杂的空间组织。现代空间转录组学和测序技术需要厚度小于&lt; 20 µm的组织切片，这限制了其在视网膜研究中的应用。本新鲜冷冻冷冻切片方法可在保持视网膜平面空间关系的同时，制备小鼠视网膜的薄层en...

En face 小鼠视网膜冷冻切片用于高维空间分子分析

学习从新生小鼠视网膜中分离高纯度内皮细胞的方法，该方案经过优化可获得高产量和活性的细胞，适用于二代测序等下游应用，有助于揭示血管发育的新机制。

从小鼠视网膜中分离内皮细胞用于下一代测序

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