Name: 模拟人血脑屏障的三重培养细胞系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: 了解三重培养细胞系统模拟人血脑屏障的体外建模方法。该系统由内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞组成，可用于纳米颗粒转运实验和药物递送研究，为临床前评估提供可靠工具。

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本研究由欧盟“地平线2020”研究与创新计划资助，项目编号为764958，属于NANOSTEM项目，即玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里创新培训网络（ITN）（研究员：Eleonora Rizzi）。本研究还获得了“法国北部-加来海峡大区议会”（Clémence Deligne研究员）、&#34;法国儿童与青少年癌症及白血病防治协会&#34;（SFCE）、&#34;马丁之星协会&#34;以及&#34;卡桑德拉抗白血病协会&#34;的资助。

本方案已获得法国高等教育与研究部（编号：CODECOH DC2011-1321）以及当地研究伦理委员会（法国贝图纳产科医院，博夫里）的批准。为获取内皮细胞（ECs），已获得供体父母的书面知情同意，以采集脐带血，符合法国法律法规。周细胞由日本山口大学医学研究生院神经病学与临床神经科学系的Takashi Kanda教授提供，其分离方法见参考文献19。原代人脑皮层星形胶质细胞购自商业供应商（见材料表）。
1. 细胞培养
<ol>
	<li>内皮细胞的培养 
	注意：内皮细胞（ECs）来源于CD34+ 根据Pedroso等描述的方法，从人脐带血中分离的造血干细胞20内皮细胞的内皮表型在Pedroso等人中已有描述。20.
	<ol>
		<li>使用内皮细胞培养人内皮细胞&#160;培养基&#160;添加5%胎牛血清（FCS）、0.5%庆大霉素和1%内皮细胞生长添加剂（ECM）（参见 材料表).</li>
		<li>为传代培养内皮细胞（ECs），在建模前两天，将10 mL 2%明胶加入培养皿中，37 °C孵育15分钟，随后更换为20 mL预热的ECM培养基。将一管含100万个细胞的ECs（细胞在冻存前已按步骤2.3.3所述方法进行人工计数）解冻后接种至预先包被的细胞培养皿中。</li>
		<li>37 °C孵育3小时后，更换培养基，并在37 °C、5% CO₂的加湿培养箱中继续培养细胞，直至三重共培养体系建立。2 和 21% O₂2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>培养&#160;周细胞 
	注意：周细胞根据Shimizu等人发表的方案从人脑中分离。19，其分离步骤遵循Kanda等人发表的方法。21 并加以修改。
	<ol>
		<li>使用添加了4.5 g/L葡萄糖的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM HG）、10%胎牛血清（FCS）、1%青霉素/链霉素和1% L-谷氨酰胺培养周细胞（参见 材料表).</li>
		<li>对于周细胞传代培养，在建模前五天，用8 mL/皿的100 µg/mL I型胶原蛋白溶液（溶于0.02 N乙酸中）在室温下孵育培养皿1小时，随后用室温DMEM高糖培养基洗涤两次。将一管含100万细胞的周细胞在含有10 mL预温培养基的锥形管中解冻，并以190 × g离心5分钟。 g 在 20 °C。</li>
		<li>将沉淀重悬于10 mL预热培养基中，接种至预先包被且每皿已加入15 mL预热培养基的细胞培养皿中。于37 °C、5% CO₂的湿化培养箱中培养，3天后更换培养基，持续培养至三联共培养体系建立。2 和 21% O₂2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>培养&#160;星形胶质细胞
	<ol>
		<li>使用以下方法培养星形胶质细胞&#160;添加补充剂的星形胶质细胞培养基&#160;含20%胎牛血清、1%星形胶质细胞生长添加剂和1%青霉素/链霉素溶液（AM）（参见 材料表).</li>
		<li>星形胶质细胞传代时，于建模前一周，用10 mL浓度为2 µg/cm²的包被液对一个T75细胞培养瓶进行包被2 在37 °C下用多聚-L-赖氨酸（PLL）孵育1小时，并用室温无菌水洗涤两次。将一管含有100万细胞的星形胶质细胞在20 mL预温培养基中解冻，接种至预先包被的T75细胞培养瓶中。 
		注意： commercially 获得的细胞冻存管已确认含有约 100 万细胞，因此此处未进行细胞计数。</li>
		<li>将细胞置于37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中培养2 和 21% O₂224小时后更换培养基，之后每2天更换一次，直至三细胞共培养体系建立。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 三重共培养模型的建立
注意：三种细胞的组装需在同一天完成。在三联共培养设置的前一天，对翻转的插入式滤膜（见材料表）进行 I 型胶原包被，并将星形胶质细胞接种至已预先用多聚赖氨酸（PLL）包被的 12 孔板孔中。
<ol>
	<li>星形胶质细胞的铺板
	<ol>
		<li>按照步骤 1.3.2 所述，用 500 µL 浓度为 2 µg/cm2 的 PLL 溶液对孔板进行包被。</li>
		<li>用 10 mL 温热的不含钙和镁的 1X&#160;磷酸盐缓冲液（1X&#160;PBS-CMF）（材料表）洗涤细胞一次，随后加入 10 mL 温热的 20% 胰蛋白酶/EDTA（T/E）溶液，在 37 °C 下孵育 3 分钟，并通过机械方式将细胞从培养瓶上分离。将细胞悬液转移至含有 5 mL 温热未稀释 FCS 的锥形管中。 
		注意：根据供应商的操作规程22，可通过将培养瓶放入培养箱中 1 分钟并轻敲培养瓶以促进细胞完全脱落，从而优化星形胶质细胞的收集。剩余细胞应使用 5 mL T/E 中和液收集，并加入含 FCS 的锥形管中。</li>
		<li>在 20 °C 下以 190 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>用 5 mL 温热的 AM 重悬细胞沉淀。取 20 µL 细胞悬液与 80 µL 的 1X&#160;PBS-CMF 混合，使用血细胞计数板在显微镜下进行细胞计数（见 材料表）。每孔 PLL 预包被的孔中加入 1.5 mL 温热 AM，接种约 40,000 个细胞/cm2。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>周细胞在翻转式插入式滤膜上的铺板
	<ol>
		<li>使用无菌镊子将插入式滤膜置于带盖的 25 mm 高培养皿边缘（见 材料表），并在其上加入 250 µL I 型胶原溶液（100 µg/mL）。在室温下无菌条件下孵育 1 小时。 
		注意：所用培养皿需足够高，以确保在超净台外操作时维持无菌状态，并避免翻转滤膜上的溶液与培养皿盖接触。</li>
		<li>使用连接抽吸系统的玻璃移液管小心移除 I 型胶原溶液。用 250 µL 室温 DMEM 高糖培养基（DMEM HG）洗涤两次，然后小心地将插入式滤膜上的所有液体完全移除。将已包被的插入式滤膜在室温下无菌保存，直至进行细胞接种。 
		注意：包被过程中应避免接触滤膜，以防膜损伤。一旦包被 I 型胶原，插入式滤膜可在室温下保存过夜。</li>
		<li>在三重共培养设置当天，用 10 mL 温热的 1X&#160;PBS-CMF 洗涤周细胞两次，并加入 2 mL 温热胰蛋白酶进行孵育。在显微镜下观察细胞，监测胰蛋白酶作用。当细胞开始脱落时，移除胰蛋白酶并加入 5 mL 温热 ECM，随后进行机械解离。</li>
		<li>取 20 µL 细胞悬液与 80 µL 的 1X&#160;PBS-CMF 混合，使用血细胞计数板在显微镜下进行细胞计数，并在预包被的翻转式插入式滤膜上以 250 µL 体积接种 44,500 个细胞/cm2。将插入式滤膜置于 37 °C、5% CO2 和 21% O2 的湿润培养箱中培养 3 小时。</li>
		<li>使用无菌镊子小心地将插入式滤膜翻转，放入含有 1.5 mL 温热 ECM/孔的 12 孔板中。此时插入式滤膜已准备好进行另一侧的包被。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>内皮细胞在插入式滤膜上的铺板
	<ol>
		<li>在插入式滤膜的上表面加入 500 µL 基于细胞外基质的水凝胶（1/48 v/v）（见 材料表）。在 37 °C、5% CO2 和 21% O2 的湿润培养箱中孵育 1 小时后，用 500 µL 室温 DMEM 高糖培养基（DMEM HG）洗涤一次。</li>
		<li>用 10 mL 温热的 1X&#160;PBS-CMF 洗涤一次，加入 2 mL 温热胰蛋白酶孵育。当细胞开始脱落时，移除胰蛋白酶并加入 5 mL 温热 ECM，随后进行机械解离。</li>
		<li>取 20 µL 细胞悬液与 80 µL 的 1X&#160;PBS-CMF 混合，使用血细胞计数板在显微镜下进行细胞计数，并在预包被的插入式滤膜上以 500 µL 温热 ECM 接种内皮细胞，密度为 71,500 个细胞/cm2。</li>
		<li>将每孔中的 AM 替换为 1.5 mL 温热 ECM，然后将已接种细胞的插入式滤膜（含内皮细胞和周细胞）转移至含有星形胶质细胞的孔中。</li>
		<li>将三重细胞共培养系统置于 37 °C、5% CO2 和 21% O2 的湿润培养箱中培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>三重细胞共培养的维持以诱导血脑屏障（BBB）特性 
	注意：为诱导内皮细胞的 BBB 特性，需要进行 6 天的三重共培养。
	<ol>
		<li>每隔一天更换一次培养基直至第 6 天，使用连接抽吸系统的玻璃移液管小心地从上室和下室移除培养基。</li>
		<li>迅速向上室加入 500 µL 温热 ECM，向下室加入 1.5 mL 温热 ECM，并将细胞放回 37 °C、5% CO2 和 21% O2 的湿润培养箱中继续培养。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 血脑屏障表型验证
注意：在三重培养 6 天后，人血脑屏障模型已具备血脑屏障表型，可用于实验。通过免疫荧光染色检测紧密连接蛋白，并结合通透性实验评估血脑屏障完整性标志物，以观察类脑内皮细胞（BLECs）的物理完整性。血脑屏障表型的验证还包括基因/蛋白表达分析以及外排泵功能检测，具体步骤参照 Deligne 等人23所述方法。周细胞和星形胶质细胞的检测则分别采用相应的染色标志物，具体操作依据 Deligne et al. 202023中描述的方案进行。
<ol>
	<li>免疫荧光染色
	<ol>
		<li>用预冷的甲醇/丙酮（50/50 v/v）在冰上固定插入式滤膜和星形胶质细胞1分钟，然后用室温1×&#160;PBS-CMF洗涤两次。</li>
		<li>使用手术刀切割膜，小心地将滤膜从插入物中分离。根据Deligne等人的方法对膜和底部孔板进行免疫细胞化学染色23。 
		注意：封闭步骤使用250 µL SEA BLOCK封闭缓冲液（见材料表），室温孵育30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>血脑屏障完整性检测
	<ol>
		<li>通过通透性实验评估BLECs的物理完整性，使用不同分子量的血脑屏障完整性标志物，如荧光素钠（NaF）和20 kDa葡聚糖（FD20）（见材料表）。 
		注意：实验可按照Deligne等人描述的步骤进行23。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>外排泵功能检测
	<ol>
		<li>通过检测罗丹明123（R123）在P-糖蛋白（P-gp）和乳腺癌耐药蛋白（BCRP）抑制剂Elacridar存在与不存在条件下的细胞内累积情况，评估P-gp和BCRP的功能活性（见材料表）。 
		注意：实验可按照Deligne等人描述的步骤进行23。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基因与蛋白表达分析
	<ol>
		<li>用冷Ringer HEPES缓冲液（RH）（表1）快速洗涤细胞后，在冰上进行基因和蛋白样品的收集。在收集内皮细胞样品前，将周细胞从倒置的插入式滤膜上刮除20。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 纳米凝胶转运
注意：为了评估聚合物纳米凝胶（NG）从三培养BLEC模型管腔侧向非管腔侧的透过情况，于第6天在管腔侧加入浓度为0.1 mg/mL的NG溶液，作用24小时。所研究的NG为荧光标记的基于N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）的水凝胶，平均粒径为8–10 nm（见材料表）。
<ol>
	<li>称取纳米凝胶粉末，并将其溶解于细胞外基质（ECM）中，终浓度为 1 mg/mL。将溶液超声处理 10 分钟，并使用 0.2 µm 聚四氟乙烯（PTFE）滤膜过滤。 
	注意：实验当天需新鲜配制纳米凝胶溶液。</li>
	<li>更换管腔侧培养室中的培养基，并在上室中加入 50 µL 纳米凝胶溶液，使其终浓度为 0.1 mg/mL。 
	注意：将原溶液进行 1:10 稀释后使用。</li>
	<li>孵育 24 小时后，分别从管腔侧（20 µL）和基底侧（200 µL）培养室中取样，置于黑色 96 孔板中。</li>
	<li>使用荧光多孔板读板仪（见材料表），在黑色 96 孔板中设置激发/发射波长为 477/540 nm，测定荧光强度。以初始加入时（时间为 0 小时，t0）的工作溶液为参照，计算跨膜转运的百分比6,15。 
	注意：为进行荧光检测，向 96 孔板中加入 200 µL 基底侧培养室的样品，以及 20 µL 管腔侧培养室的样品和 t0 样品（加入 180 µL ECM 以补足至 200 µL 的终体积）。同时在检测板中设置标准曲线孔和空白对照孔。仪器参数设置如下：检测模式 — 荧光检测，光学检测位置 — 顶部，读数类型 — 终点法，激发波长 — 477 nm，发射波长 — 540 nm，灵敏度 — 100，振荡方式 — 双轨道振荡，持续 5 秒。</li>
</ol>

<ol><li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiology of Disease. 37, 13-25 (2010).</li>
<li>Profaci, C. P., Munji, R. N., Pulido, R. S., Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier+in+health+and+disease%3A+Important+unanswered+questions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier in health and disease: Important unanswered questions.</a> The Journal of Experimental Medicine. 217 (4), 20190062(2020).</li>
<li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+structure+and+function+and+the+challenges+for+CNS+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inherited+Metabolic+Disease%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier structure and function and the challenges for CNS drug delivery.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 36 (3), 437-449 (2013).</li>
<li>Kreuter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+delivery+to+the+central+nervous+system+by+polymeric+nanoparticles%3A+What+do+we+know%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Drug delivery to the central nervous system by polymeric nanoparticles: What do we know.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 71, 2-14 (2014).</li>
<li>Zhang, W., Mehta, A., Tong, Z., Esser, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhang%2C+W+%22L.Advanced+science%22">L.Advanced science</a>. 8 (10), Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany. 2003937(2021).</li>
<li>Vashist, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanogels+as+potential+drug+nanocarriers+for+CNS+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Nanogels as potential drug nanocarriers for CNS drug delivery.</a> Drug Discovery Today. 23 (7), 1436-1443 (2018).</li>
<li>Lombardo, S. M., Schneider, M., Türeli, A. E., Günday Türeli, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+for+crossing+the+BBB+with+nanoparticles%3A+The+rational+design%5BTitle%5D)+AND+%22Beilstein+Journal+of+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Key for crossing the BBB with nanoparticles: The rational design.</a> Beilstein Journal of Nanotechnology. 11, 866-883 (2020).</li>
<li>Bernardo-Castro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+nanoparticles+for+the+different+phases+of+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Life%22%5BJournal%5D)">Therapeutic nanoparticles for the different phases of ischemic stroke.</a> Life. 11 (6), Basel, Switzerland. 482(2021).</li>
<li>Salinas, Y., Castilla, A. M., Resmini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+L-proline+based+thermoresponsive+and+pH-switchable+nanogel+as+a+drug+delivery+vehicle%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An L-proline based thermoresponsive and pH-switchable nanogel as a drug delivery vehicle.</a> Polymer Chemistry. 9 (17), 2271-2280 (2018).</li>
<li>Liu, P., Pearce, C. M., Anastasiadi, R. M., Resmini, M., Castilla, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalently+crosslinked+nanogels%3A+An+NMR+study+of+the+effect+of+monomer+reactivity+on+composition+and+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers%22%5BJournal%5D)">Covalently crosslinked nanogels: An NMR study of the effect of monomer reactivity on composition and structure.</a> Polymers. 11 (2), 353(2019).</li>
<li>Preman, N. K., Jain, S., Johnson, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%E2%80%9DSmart%E2%80%9D+polymer+nanogels+as+pharmaceutical+carriers%3A+A+versatile+platform+for+programmed+delivery+and+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">”Smart” polymer nanogels as pharmaceutical carriers: A versatile platform for programmed delivery and diagnostics.</a> ACS Omega. 6 (8), 5075-5090 (2021).</li>
<li>Cuggino, J. C., Blanco, E. R. O., Gugliotta, L. M., Alvarez Igarzabal, C. I., Calderón, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossing+biological+barriers+with+nanogels+to+improve+drug+delivery+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release+Official+Journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Crossing biological barriers with nanogels to improve drug delivery performance.</a> Journal of Controlled Release Official Journal of the Controlled Release Society. 307, 221-246 (2019).</li>
<li>Basso, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel-based+drug+delivery+nanosystems+for+the+treatment+of+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Gels%22%5BJournal%5D)">Hydrogel-based drug delivery nanosystems for the treatment of brain tumors.</a> Gels. 4 (3), Basel, Switzerland. 62(2018).</li>
<li>Harilal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+the+blood-brain+barrier%3A+A+hard+nut+to+crack+in+the+transportation+of+drug+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Revisiting the blood-brain barrier: A hard nut to crack in the transportation of drug molecules.</a> Brain Research Bulletin. 160, 121-140 (2020).</li>
<li>Papadimitriou, S. A., Robin, M. P., Ceric, D., O'Reilly, R. K., Marino, S., Resmini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+polymeric+nanovehicles+for+neural+stem+cell+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Fluorescent polymeric nanovehicles for neural stem cell modulation.</a> Nanoscale. 8 (39), 17340-17349 (2016).</li>
<li>Helms, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier%3A+An+overview+of+commonly+used+brain+endothelial+cell+culture+models+and+guidelines+for+their+use%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism+Official+Journal+of+the+International+Society+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).</li>
<li>Cecchelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+of+the+blood-brain+barrier+in+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 6 (8), 650-661 (2007).</li>
<li>Reichel, A., Begley, D. J., Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+in+vitro+techniques+for+blood-brain+barrier+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">An overview of in vitro techniques for blood-brain barrier studies.</a> Methods in Molecular Medicine. 89, 307-324 (2003).</li>
<li>Shimizu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve+pericytes+modify+the+blood-nerve+barrier+function+and+tight+junctional+molecules+through+the+secretion+of+various+soluble+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve pericytes modify the blood-nerve barrier function and tight junctional molecules through the secretion of various soluble factors.</a> Journal of Cellular Physiology. 226 (1), 255-266 (2011).</li>
<li>Pedroso, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+survival%2C+vascular+differentiation+and+wound+healing+potential+of+stem+cells+co-cultured+with+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Improved survival, vascular differentiation and wound healing potential of stem cells co-cultured with endothelial cells.</a> PLoS One. 6 (1), 16114(2011).</li>
<li>Kanda, T., Iwasaki, T., Yamawaki, M., Ikeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+bovine+endothelial+cells+of+endoneurial+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of bovine endothelial cells of endoneurial origin.</a> Journal of Neuroscience Research. 49 (6), 769-777 (1997).</li>
<li>Data sheet on human astrocytes culture. Technical resources from ScienCell. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.sciencellonline.com/human-astrocytes.html#product_tabs_technicalresources">https://www.sciencellonline.com/human-astrocytes.html#product_tabs_technicalresources</a> (2021).</li>
<li>Deligne, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+human+in+vitro+blood-brain+tumor+barrier+model+of+diffuse+intrinsic+pontine+glioma+to+better+understand+the+chemoresistance%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">Development of a human in vitro blood-brain tumor barrier model of diffuse intrinsic pontine glioma to better understand the chemoresistance.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 17 (1), 37(2020).</li>
<li>Cecchelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+and+reproducible+human+blood-brain+barrier+model+derived+from+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells.</a> PLoS One. 9 (6), 99733(2014).</li>
<li>Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-Brain+Barrier%3A+From+physiology+to+disease+and+back%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Blood-Brain Barrier: From physiology to disease and back.</a> Physiological Reviews. 99 (1), 21-78 (2019).</li>
<li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The Blood-Brain Barrier.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), 020412(2015).</li>
<li>Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+studies+on+in+vitro+blood-brain+barrier+models%3A+Physiology%2C+pathology%2C+and+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: Physiology, pathology, and pharmacology.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 59-127 (2005).</li>
<li>Heymans, M., Figueiredo, R., Dehouck, L., Francisco, D., Sano, Y., Shimizu, F., Kanda, T., Bruggmann, R., Engelhardt, B., Winter, P., Gosselet, F., Maxime, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+brain+pericytes+in+blood-brain+barrier+formation+and+maintenance%3A+A+transcriptomic+study+of+co-cultured+human+endothelial+cells+derived+from+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Contribution of brain pericytes in blood-brain barrier formation and maintenance: A transcriptomic study of co-cultured human endothelial cells derived from hematopoietic stem cells.</a> Fluids Barriers CNS. 17, 48(2020).</li>
<li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRussell%2C+WMS+%22The+Principles+of+Humane+Experimental+Technique%22">The Principles of Humane Experimental Technique</a>. , (1959).</li>
<li>Neuhaus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Models+of+the+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Experimental+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">In Vitro Models of the Blood-Brain Barrier.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. 265, 75-110 (2021).</li>
<li>Hoheisel, D., Nitz, T., Franke, H., Wegener, J., Hakvoort, A., Tilling, T., Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrocortisone+reinforces+the+blood-brain+properties+in+a+serum+free+cell+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Hydrocortisone reinforces the blood-brain properties in a serum free cell culture system.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 247 (2), 312-315 (1998).</li>
<li>Drolez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+a+relevant+in+vitro+blood-brain+barrier+model+to+investigate+pro-metastatic+features+of+human+breast+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Selection of a relevant in vitro blood-brain barrier model to investigate pro-metastatic features of human breast cancer cell lines.</a> PloS One. 11 (3), 0151155(2016).</li>
<li>Neuhaus, W., Gaiser, F., Mahringer, A., Franz, J., Riethmüller, C., Förster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pivotal+role+of+astrocytes+in+an+in+vitro+stroke+model+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The pivotal role of astrocytes in an in vitro stroke model of the blood-brain barrier.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 352(2014).</li>
<li>Mysiorek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor-%CE%B1+activation+protects+brain+capillary+endothelial+cells+from+oxygen-glucose+deprivation-induced+hyperpermeability+in+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Neurovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor-α activation protects brain capillary endothelial cells from oxygen-glucose deprivation-induced hyperpermeability in the blood-brain barrier.</a> Current Neurovascular Research. 6 (3), 181-193 (2009).</li>
<li>Culot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrovascular+protection+as+a+possible+mechanism+for+the+protective+effects+of+NXY-059+in+preclinical+models%3A+An+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Cerebrovascular protection as a possible mechanism for the protective effects of NXY-059 in preclinical models: An in vitro study.</a> Brain Research. 1294, 144-152 (2009).</li>
<li>Vandenhaute, E., Drolez, A., Sevin, E., Gosselet, F., Mysiorek, C., Dehouck, M. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adapting+co-culture+in+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier+for+use+in+cancer+research%3A+Maintaining+an+appropriate+endothelial+monolayer+for+the+assessment+of+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Adapting co-culture in vitro models of the blood-brain barrier for use in cancer research: Maintaining an appropriate endothelial monolayer for the assessment of transendothelial migration.</a> Laboratory Investigation. 96 (5), 588-598 (2016).</li>
<li>Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, V., Marchi, N., Janigro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+shear+stress+in+Blood-Brain+Barrier+endothelial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology.</a> BMC Neuroscience. 12, 40(2011).</li>
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作者声明不存在利益冲突。

考虑到药物难以跨越血脑屏障以到达脑实质中的细胞和分子靶点，脑部疾病的治疗仍然是一个挑战。
脑部疾病药物研发目前成功率较低，因为大多数在临床前模型中显示有前景结果的药物，在临床应用中未能表现出任何疗效。继 &#34;3R原则，&#34; 旨在减少用于实验的动物数量， 体外 血脑屏障模型被用于研究脑部病理并预测药物进入大脑的能力29. 体外 血脑屏障模型主要使用动物细胞开发，并日趋复杂，以提高所得结果的相关性16人类细胞应用中的一项重要进展，为在细胞和分子水平上研究人类疾病机制带来了无可争议的新见解和更高特异性16然而，相关模型的开发需要考虑血脑屏障（BBB）的改进 体外 模型设置及其通过动物模型获得的知识。因此，需要考虑血脑屏障结构的复杂性以及细胞间通讯在生理和病理条件下研究血脑屏障的重要性30.
本文介绍了一种构建完整人脑屏障（BBB）的方法 体外 包含血脑屏障（BBB）三种主要细胞类型的模型，且不受脑组织获取途径的限制。作为一种多细胞体系，该模型通过细胞间通讯诱导并维持BBB特性，而非依赖人工 tighten 化合物，因此更符合生理实际情况，与之相符。 体内 血脑屏障特性的诱导31因此，遵循实验方案的时间顺序对方案的成功至关重要。此外，三重培养体系建立过程中以及三种细胞类型组装完成后的孵育时间是该方案的主要关键步骤。
内皮细胞（ECs）的血脑屏障（BBB）特性是通过与周细胞共培养诱导产生的，如共培养模型所述24。因此，在插入式滤膜的反面培养周细胞是最关键的步骤，必须严格遵循本方案操作，否则可能导致周细胞数量不足，无法有效诱导BBB特性。首先，在包被过程以及细胞接种过程中，需注意避免培养皿盖与包被液接触，细胞接种后也应避免其与培养基接触，以确保滤膜表面包被均匀，并防止细胞丢失（步骤2.2.1和2.2.4）。此外，周细胞接种后，必须等待指定时间以确保周细胞充分贴壁（步骤2.2.4），然后才能翻转插入式滤膜，进行另一侧内皮细胞的包被和接种（步骤2.2.5和2.3）。内皮细胞接种后，需培养六天，通过细胞间相互作用诱导BBB特性（步骤2.4）。
该模型通过限制性通透性（与紧密连接的形成相关）进行验证，因为三重培养模型中的内皮细胞对血脑屏障完整性标志物的通透性值，与已验证的共培养模型以及已验证的动物或人源模型中测得的结果相似。16,27,32此外，对一个 体外 BBB 模型除了需要具备限制性通透性外，还需对神经血管单元（NVU）中的其他细胞类型具有响应能力，并表达功能性受体和转运蛋白16此外，该模型具有可重复性，可生成多个插入式滤膜和孔板，从而在无需细胞分选方法的情况下，对每种细胞类型分别进行多种分析（基因和蛋白表达、荧光染色、毒性检测）。
该模型采用孔径为0.4 µm的滤膜，使每侧滤插中分布一种细胞类型。滤插系统可通过将其转移至含有星形胶质细胞的培养孔中，用于在生理条件下研究细胞间通讯。与初始的共培养系统相比，该体系中星形胶质细胞的存在具有显著优势。 体外 模型24确实，考虑到星形胶质细胞在血脑屏障（BBB）生理功能中的重要性，这种第三种细胞类型有助于进一步理解BBB内部的细胞间通讯。此外，该三细胞共培养系统也可用于研究中风等病理条件，在这些条件下星形胶质细胞发挥着关键作用。33,34,35此外，可将插入式滤膜两侧的BLECs/周细胞设计轻松应用于其他细胞类型，以模拟脑癌等病理条件23.
插入式滤膜的孔径大小可能在某些实验中带来限制，例如细胞跨越血脑屏障（BBB）的迁移实验。然而，使用较大孔径构建模型时，需要对实验方案进行调整，以确保内皮细胞（ECs）形成具有生理相关性的单层结构，而非无生理意义的多层结构，后者无法真实模拟血脑屏障36。
已通过NGs运输实验验证了该模型的适用性，表明可以利用多细胞系统进行运输实验。然而，应当注意的是，为运输实验寻找一种与NGs具有相似特性的对照化合物或分子存在困难，因为每种纳米结构都具有一组独特的特性（分子量、电荷、形状、物理性质、蛋白冠形成）。
该模型的一个局限性是缺乏剪切应力，而剪切应力已被证明会影响内皮细胞（ECs）的分化以及紧密连接蛋白（TJ proteins）的表达37。然而，考虑到在多细胞系统中引入流体组件的复杂性，开发一种模拟脑毛细血管的流体系统具有挑战性，这需要特定的装置。此外，此类特定装置通常无法商业化获取，且难以实现大量重复实验，因此流体系统较不适用于高通量应用。
总之，这种由人类细胞组成的三重共培养系统可重现 体外 血脑屏障的结构。它能够生成大量插入物，可用于化合物的广泛筛选。

血脑屏障（BBB）位于脑毛细血管内皮细胞（ECs）水平，控制并调节物质进入脑实质，这对于维持脑内环境稳态和神经细胞功能至关重要1,2。然而，在脑部病理情况下，难以进入脑实质成为开发治疗策略的实际障碍。
血脑屏障内皮细胞具有一系列复杂的特性，包括紧密连接（TJ）蛋白，可封闭细胞间间隙，并与外排泵系统、特异性转运蛋白和受体共同调控跨细胞转运途径1,2,3此外，这些特性得以诱导和维持，主要得益于与嵌入血脑屏障内皮细胞基底膜中的周细胞以及终足包绕脑部毛细血管的星形胶质细胞之间的相互通讯。1,2,3因此，研究血脑屏障 体外 考虑到神经血管单元（NVU）结构的复杂性以及构成该单元的不同细胞类型之间的相互通讯，这一挑战尤为突出2此外，不同类型的细胞对于血脑屏障特性的诱导和维持至关重要，因此会影响药物穿越血脑屏障的预测。已有多种针对脑部药物递送的策略，通过大量不同的方法来绕过血脑障碍的限制特性并进行了测试。4近年来，随着纳米技术的进步，新型材料正在被开发用于药物载体的应用5,6除了具有更高的载药量、降低的毒性和增强的药物生物利用度外，这些新型纳米材料还可进行功能化修饰，以实现“特洛伊木马”策略穿越血脑屏障，并特异性地靶向脑实质中的细胞。5,6在所评估的各类纳米材料中，纳米凝胶受到了广泛关注，主要归因于其胶体特性以及可通过调控化学结构来引入刺激响应性的能力7,8,9,10,11,12,13,14,15.
体外 现采用人类细胞建立用于临床前研究的模型，以预测药物进入大脑的能力16这些模型具有多种设置形式，从脑微血管内皮细胞的单层培养到多细胞系统不等。16考虑到神经血管单元（NVU）细胞在血脑屏障（BBB）的诱导与维持中的重要作用，以及对病理环境的协调反应，BBB 体外 模型需要考虑所有这些参与者，以提高预测的相关性2,17.
当前方法描述了建立三重共培养体系 体外 人脑微血管屏障（BBB）模型，该模型完全由人类细胞构建，用于研究特定的细胞及人类分子机制。为确保其生理相关性，该模型包含构成BBB的三种主要细胞成分（内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞），可诱导并维持BBB特性，无需使用屏障增强化合物，并具备被视为功能性BBB模型所需的一系列特性 体外 血脑屏障模型16,18该模型构建为分隔血液与脑组织隔室的结构，适用于临床前药物和颗粒转运研究，以预测其进入脑组织的能力。通过测定聚合物纳米凝胶的转运过程，展示了该模型的应用价值。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;细胞培养&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>星形胶质细胞培养基（AM）</td><td>ScienCell&amp;nbsp;</td><td>1801</td><td></td></tr><tr><td>星形胶质细胞生长添加剂</td><td>ScienCell&amp;nbsp;</td><td>1852</td><td>星形胶质细胞生长添加剂包含在AM试剂盒中。</td></tr><tr><td>细胞培养皿 100 mm</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>430293</td><td>100 mm × 20 mm；用于三细胞共培养体系建立前内皮细胞和周细胞的解冻</td></tr><tr><td>细胞培养皿 150 mm</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>430599</td><td>这些培养皿的高度（25 mm）允许在倒置的Transwell小室中接种周细胞，以建立三细胞共培养模型。</td></tr><tr><td>胶原蛋白I型&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>大鼠尾来源&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium）</td><td>Gibco</td><td>31600-083</td><td>粉末</td></tr><tr><td>内皮细胞生长添加剂</td><td>ScienCell&amp;nbsp;</td><td>1051</td><td>内皮细胞生长添加剂包含在ECM试剂盒中。</td></tr><tr><td>内皮细胞培养基（ECM）</td><td>ScienCell&amp;nbsp;</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>Sigma</td><td>G2500</td><td>2% 猪皮来源明胶溶于无钙镁磷酸盐缓冲液（PBS-CMF）</td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>BiochromA6</td><td>A-2712</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G6152</td><td>粉末</td></tr><tr><td>谷氨酰胺</td><td>Merck</td><td>1002891000</td><td></td></tr><tr><td>人脑皮层星形胶质细胞</td><td>ScienCell&amp;nbsp;</td><td>1800-SC</td><td></td></tr><tr><td>马氏细胞计数板</td><td>vWR</td><td>HECH40453702</td><td>计数通过手动完成。</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>基于细胞外基质的水凝胶</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>ScienCell&amp;nbsp;</td><td>0503</td><td>青霉素/链霉素溶液包含在ECM和AM试剂盒中。</td></tr><tr><td>多聚-L-赖氨酸</td><td>ScienCell&amp;nbsp;</td><td>0413</td><td></td></tr><tr><td>Steritop滤器</td><td>Millipore System</td><td>SCGPT0SRE</td><td>0.22 &amp;micro;m 孔径</td></tr><tr><td>Transwell小室&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>3401</td><td>0.4 &amp;micro;m 孔径聚碳酸酯膜滤器&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA中和液</td><td>ScienCell&amp;nbsp;</td><td>0113</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA溶液</td><td>ScienCell&amp;nbsp;</td><td>0103</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;免疫细胞化学&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SEA BLOCK封闭缓冲液</td><td>ThermoScientific</td><td>37527</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 抗小鼠二抗</td><td>Thermofisher</td><td>A11031</td><td>稀释比例 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 抗兔二抗</td><td>Thermofisher</td><td>A11036</td><td>稀释比例 1:500</td></tr><tr><td>抗Claudin-5一抗</td><td>InVitrogen</td><td>34-1600</td><td>稀释比例 1:100</td></tr><tr><td>抗Desmin一抗</td><td>Abcam</td><td>ab6322</td><td>稀释比例 1:200</td></tr><tr><td>抗胶质纤维酸性蛋白（Glial Fibrillary Acidic Protein）一抗</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td>稀释比例 1:500</td></tr><tr><td>抗血小板源性生长因子-&amp;beta;一抗</td><td>Abcam</td><td>ab51090</td><td>稀释比例 1:200</td></tr><tr><td>抗VE-cadherin一抗</td><td>Abcam</td><td>ab207732</td><td>稀释比例 1:200</td></tr><tr><td>抗Zona Occludens-1一抗</td><td>InVitrogen</td><td>61-7300</td><td>稀释比例 1:200</td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Sigma</td><td>G6767</td><td></td></tr><tr><td>含DAPI的ProLong Diamond抗荧光淬灭封片剂</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>P36962</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;基因表达&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin RNA/Protein Macherey Nagel试剂盒</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740,933,250</td><td></td></tr><tr><td>96孔板</td><td>Biorad</td><td>HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>iSCRIPT反转录试剂</td><td>Biorad</td><td>1708841</td><td></td></tr><tr><td>封板膜&amp;nbsp;</td><td>Biorad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast EvaGreen Supermix</td><td>Biorad</td><td>172-5201</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;蛋白表达&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli上样缓冲液</td><td>Biorad</td><td>161-0737</td><td>向950 &amp;micro;L Laemmli缓冲液中加入50 &amp;micro;L β-巯基乙醇，-20&amp;deg;C保存。检测前与蛋白样品按1:1比例稀释。</td></tr><tr><td>抗乳腺癌耐药蛋白（Breast Cancer Resistance Protein）一抗</td><td>Abcam</td><td>ab207732</td><td>室温振荡预处理15分钟；稀释比例1:1000，4&amp;deg;C过夜孵育</td></tr><tr><td>抗Claudin-5一抗</td><td>Abcam</td><td>ab15106</td><td>95&amp;deg;C预处理5分钟；稀释比例1:1000，4&amp;deg;C过夜孵育</td></tr><tr><td>抗葡萄糖转运蛋白1（Glucose Transporter 1）一抗</td><td>Millipore</td><td>07-1401</td><td>95&amp;deg;C预处理5分钟；稀释比例1:1000，4&amp;deg;C过夜孵育</td></tr><tr><td>抗小鼠二抗</td><td>Dako</td><td>P0447</td><td>TBS-Tween中稀释1:5000</td></tr><tr><td>抗P-糖蛋白（P-glycoprotein）一抗</td><td>Genetex</td><td>GTX23364</td><td>室温振荡预处理15分钟；稀释比例1:400，室温孵育3小时</td></tr><tr><td>抗兔二抗</td><td>Dako</td><td>P0448</td><td>TBS-Tween中稀释1:8000</td></tr><tr><td>抗转铁蛋白受体（Transferrin Receptor）一抗</td><td>Abcam</td><td>ab84036</td><td>95&amp;deg;C预处理5分钟；稀释比例1:1000，4&amp;deg;C过夜孵育</td></tr><tr><td>抗Zona occludens-1一抗</td><td>Abcam</td><td>ab216880</td><td>95&amp;deg;C预处理5分钟；稀释比例1:1000，4&amp;deg;C过夜孵育</td></tr><tr><td>Criterion TGX凝胶&amp;nbsp;</td><td>Biorad</td><td>5678083</td><td></td></tr><tr><td>ECL Prime显影液</td><td>Amersham&amp;nbsp;</td><td>RPN2236</td><td>避光保存的显影溶液</td></tr><tr><td>磷酸酶抑制剂混合液2</td><td>Sigma</td><td>P5726</td><td></td></tr><tr><td>磷酸酶抑制剂混合液3</td><td>Sigma</td><td>P0044</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>蛋白标准品</td><td>Biorad</td><td>161-0373</td><td>分子量标记物</td></tr><tr><td>RIPA 10x缓冲液</td><td>Millipore</td><td>20-188</td><td></td></tr><tr><td>TBS 10x缓冲液</td><td>Biorad</td><td>1706435</td><td></td></tr><tr><td>TRIS-甘氨酸</td><td>Biorad</td><td>1610771</td><td></td></tr><tr><td>吐温（Tween）</td><td>Biorad</td><td>1706531</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;血脑屏障完整性检测&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>荧光素钠</td><td>Ampresco</td><td>0681</td><td>&amp;lambda;ex= 490 nm；&amp;lambda;em= 525 nm&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Elacridar</td><td>Sigma</td><td>SML0486</td><td>GF120918</td></tr><tr><td>20 kDa FITC-葡聚糖</td><td>Sigma</td><td>FD-20S</td><td>&amp;lambda;ex= 490 nm；&amp;lambda;em=&amp;nbsp; 525 nm&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>罗丹明123</td><td>Sigma</td><td>R8004</td><td>&amp;lambda;ex= 501 nm；&amp;lambda;em= 538 nm&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Synergy&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; H1&amp;nbsp;</td><td>BioTek Instruments</td><td></td><td>荧光多孔板读板仪</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;纳米凝胶转运&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>Terumo</td><td>SS+01T1</td><td>1 mL注射器&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>滤器</td><td>FisherScientific</td><td>15161499</td><td>0.2 &amp;micro;m 孔径PTFE膜滤器，直径15 mm</td></tr><tr><td>基于N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）的水凝胶&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>本研究中使用的纳米凝胶（NGs）由伦敦玛丽女王大学化学系的合作者提供。NGs共价标记了荧光分子（&amp;lambda;ex= 477 nm；&amp;lambda;em= 540 nm）。NGs以冻干粉形式提供和运输，在此状态下可在室温长期稳定保存。&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

一种模拟人类血脑屏障的三重共培养细胞系统

A Triple Culture Cell System Modeling the Human Blood-Brain Barrier

将药物递送至大脑仍面临挑战，这主要是由于血脑屏障（BBB）具有高度特异性和限制性，可调控并限制物质进入脑实质。然而，随着纳米技术的发展，大量新型纳米材料被开发用于改善药物递送，凸显了建立可靠评估方法的必要性 体外 用于在临床前实验框架内预测血脑屏障穿透性的微系统。本文介绍一种简便的方法，用于建立完全基于人源细胞的血脑屏障微生理系统模型。该模型采用三重共培养体系，包含类脑内皮细胞（BLECs）、周细胞和星形胶质细胞，这三种主要的血脑屏障细胞成分能够更生理化地诱导和调控血脑屏障特性，且无需使用屏障增强化合物。该模型构建于12孔板中，经过6天的三重共培养即可完成，其物理特性、基因表达和蛋白表达均经过表征，并可用于聚合物纳米凝胶的转运测定。该模型适用于多种健康与病理条件下的实验，是评估分子与颗粒物转运以及细胞间和细胞内运输过程的有力工具。

人源三重共培养血脑屏障模型的建立 
建立人血脑屏障所需的实验方案 体外 模型在下文中有描述 图1 并包含一系列必须严格遵守顺序的步骤。首先，三种细胞类型需在细胞培养皿中分别进行单独培养（图1A在插入式滤器系统中组装之前进行。三重共培养体系首先将第一种细胞类型——星形胶质细胞——接种于预先包被的底部小室中。次日，将周细胞和内皮细胞（ECs）分别接种于插入式滤器预先包被的外腔面和腔面。随后将插入式滤器转移至星形胶质细胞上方。该模型在培养中维持6天，此时间为诱导内皮细胞形成血脑屏障（BBB）特性所必需，每隔一天根据专利共培养模型更换一次培养基。24。内皮细胞随后被重新命名为BLECs（图1B).
人血脑屏障模型的表征 
三细胞共培养模型已通过一系列血脑屏障特异性特征的存在得到表征。首先，免疫细胞化学数据证实了常规标志物的表达，如血小板源性生长因子受体β（PDGFR-β）25,26 和周细胞的波形蛋白以及胶质纤维酸性蛋白（GFAP）26 用于星形胶质细胞（图2A）。因此，在与周细胞和星形胶质细胞共培养6天后，通过VE-钙黏蛋白的黏附连接染色所观察到的BLEC单层细胞在细胞边界处显示出紧密连接蛋白Claudin-5和ZO-1的连续定位。图2A）。紧密连接（TJs）的形成与使用低分子量血脑屏障完整性标志物（如NaF（376 Da））测得的低旁细胞渗透系数相关。16,27 高分子量，即 FD20（20 kDa）27，如图所示 图2B测得的数值与经过验证的血脑屏障（BBB）结果具有可比性 体外 使用ECs确切来源构建的模型23,24,28总之，这些结果凸显了三重培养的BLEC单层细胞具有较低的旁细胞通透性，这是该模型的特征性表现 体内 BBB。此外，在外排泵抑制剂Elacridar存在的情况下，BLECs中R123的细胞内蓄积显著增加23,24 与不存在该条件的对照组相比（图2C这表明BLECs中存在有活性的外排泵分子，即P-gp和BCRP。
为进一步表征脑微血管内皮样细胞（BLECs），研究了血脑屏障（BBB）关键特征的相关基因表达及蛋白水平（图3）。将三重培养模型获得的数据与已验证且已取得专利的内皮细胞与周细胞共培养模型进行了比较24 用作对照模型。星形胶质细胞是在三重共培养模型中初始共培养体系中添加的第三种细胞类型。因此，基因表达分析（图3A与共培养的BLECs相比，三重培养的BLECs在蛋白定量数据中显示出关键血脑屏障特征的表达得以维持，例如紧密连接蛋白（claudin-5和zonula occludens-1）和外排泵（P-gp和BCRP），并且大多数研究的血脑屏障转运蛋白（葡萄糖转运蛋白1）和受体（转铁蛋白受体）表达上调。图3B) 与转录结果一致。总体而言，这些数据支持三重共培养BLEC层中血脑屏障特性呈阳性诱导，类似于已验证的共培养模型。综上所述，该三重共培养模型表现出所需的物理和代谢特性 体外 用于模拟血脑屏障的微生理系统
在药物递送策略中的应用——纳米凝胶转运的测定 
为了评估利用三重共培养模型研究新型脑部递送策略的可能性，检测了荧光标记的基于NIPAM的中性纳米凝胶（NGs）的转运情况6,15。在0时间点，将NGs以0.1 mg/mL的浓度加入管腔侧室（图4A）。经过24小时孵育后，在基底外侧室中检测到5.82%的NGs（图4B），证明其能够穿越脑微血管内皮细胞层（BLECs）。
结果表明，该模型适用于测量小分子和大分子化合物的通透性（如完整性标志物所示），并可评估聚合物纳米颗粒等纳米材料的转运情况。
<img alt="血脑屏障模型示意图；内皮细胞、周细胞、星形胶质细胞；三重共培养体系" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63134/63134fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1三重共培养体系建立关键步骤示意图 体外 人血脑屏障模型。 (A) 血脑屏障模型中三种细胞成分的相差显微图像：内皮细胞（EC）、周细胞（PC）和星形胶质细胞（AC）。比例尺 = 250 µm. (B三重培养人脑微血管屏障模型的示意图与时间线示意图 体外 模型。高亮框表示倒置插入式滤膜的包被步骤。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63134/63134fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="血脑屏障模型：内皮细胞标志物（Ve-Cadh、CLD5、ZO1）及相关图表结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63134/63134fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 2"> 
图2：三重共培养血脑屏障模型特性的评估。（A）脑微血管内皮细胞（Claudin-5: CLD5、Zona Occludens-1: ZO1 和 VE-Cadherin: Ve-Cadh）、周细胞（血小板源性生长因子受体-β: PDGFR-β 和结蛋白: desmin）以及星形胶质细胞（胶质纤维酸性蛋白: GFAP）特异性标志物的代表性免疫荧光染色图像。比例尺 = 10 µm。（B）脑微血管内皮细胞对荧光标记的血脑屏障完整性示踪剂——荧光素钠（NaF，376 Da，Pe: 0.61 ± 0.062）和异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖（FD20，20 kDa，Pe: 0.04 ± 0.005）——的旁细胞通透性检测结果。N = 3；n = 9。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。（C）通过定量检测有（124.2% ± 3.39%）和无（100% ± 8.79%）Elacridar 存在时内皮细胞内罗丹明123（R123）的积累量，评估P-糖蛋白（P-gp）和乳腺癌耐药蛋白（BCRP）的功能活性。N = 4；n = 12。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。采用非配对t检验，p = 0.017。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63134/63134fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="基因和蛋白表达柱状图；共培养血脑屏障内皮细胞；CLD5、ZO1、GLUT1、TRFR、PGP、BCRP" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63134/63134fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3三重培养模型与共培养血脑屏障模型中BLEC基因表达及特异性标志物蛋白水平的评估 (A) 以 RPLP0 表达量为标准化参照，检测紧密连接蛋白（Claudin-5：CLD5 和 Zona Occludens-1：ZO1）、转运蛋白（Glucose Transporter-1：GLUT1、P-glycoprotein：PGP 和 Breast Cancer Resistance Protein：BCRP）以及大分子受体（Transferrin Receptor：TRFR）的基因表达水平。N = 3；n = 9。B) 以β-actin表达量为内参，对紧密连接蛋白（CLD5和ZO1）、转运蛋白（GLUT1、PGP和BCRP）及大分子受体（TRFR）的蛋白水平进行标准化。N = 3；n = 9。数据以均值±标准误表示。对于（A）和（B），数值&gt;1 表示在三重培养模型中基因表达或蛋白质水平更高。红色线条对应数值为 1，表示两种模型的表达水平（基因或蛋白质）相等。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63134/63134fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="纳米凝胶转运示意图；使用荧光结果的纳米颗粒评估装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63134/63134fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：在三重共培养模型中测量纳米凝胶的转运。 (A) 纳米凝胶转运实验的示意图。(B) 在三重共培养模型中孵育 24 小时后纳米凝胶的转运百分比（5.82% ± 0.09%）。N = 2；n = 6。均值 ± 标准误。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63134/63134fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2" rowspan="2">缓冲液名称</td>
			<td colspan="3">成分</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">备注</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>分子量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">无钙镁磷酸盐缓冲液</td>
			<td rowspan="5">PBS-CMF</td>
			<td>NaCl</td>
			<td>8 g/L</td>
			<td>58.4</td>
			<td colspan="2" rowspan="5">将所有组分加入无菌水中，待完全溶解。所得溶液的 pH 值应在 7.3–7.4 范围内。使用 0.22 µm 滤膜过滤溶液，并将无菌溶液储存在 4 °C 下。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>0.2 g/L</td>
			<td>74.55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>0.2 g/L</td>
			<td>136.09</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHPO4-12 H2O</td>
			<td>2.87 g/L</td>
			<td>358.14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="8">Ringer HEPES 缓冲液</td>
			<td rowspan="8">RH</td>
			<td>NaCl</td>
			<td>8.8 g/L</td>
			<td>58.4</td>
			<td colspan="2" rowspan="8">将所有组分加入无菌水中，待完全溶解。调节 pH 至 7.4（起始溶液 pH 约为 6.8）。使用 0.22 µm 滤膜过滤溶液，并将无菌溶液储存在 4 °C 下。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>0.387 g/L</td>
			<td>74.55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>0.244 g/L</td>
			<td>110.99</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 6H2O</td>
			<td>0.0406 g/L</td>
			<td>203.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>0.504 g/L</td>
			<td>84.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>1.19 g/L</td>
			<td>238.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>0.504 g/L</td>
			<td>180.16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：本实验方案中所用各种缓冲液的组成。

本方案描述了一种建立人血脑屏障（BBB）的方法 体外 模型。内皮细胞和周细胞接种于插件滤膜的两侧（血液区室），星形胶质细胞接种于底部孔板中（脑区室）。该模型已用于纳米颗粒转运实验的表征。

由于血脑屏障（BBB）具有高度特异性和限制性特征，能够调控……，因此将药物递送至大脑仍是一项挑战。

将药物递送至大脑仍是一项挑战。为改善向大脑的递送，大量新型纳米材料被开发出来，这凸显了在临床前检测框架内，亟需建立真实的体外微系统以预测物质穿越血脑屏障的能力。该技术的主要优势在于，可在同一系统内构建出具有自由通透性且功能完整的血脑屏障细胞模型，支持细胞间的相互作用，从而诱导并维持血脑屏障表型的形成。此外，每种细胞类型均可被单独分离，用于进一步的分子分析。该模型可用于健康和病理条件下的多种实验，是评估分子和颗粒转运以及细胞间和细胞内运输的宝贵工具。本实验操作将由Dr. Clemence Deligne和Dr. Eleonora Rizzi进行演示。首先，向孔板中加入500微升浓度为每平方厘米2微克的聚-L-赖氨酸溶液。在37摄氏度下孵育过夜或至少1小时，然后使用连接至抽吸系统的玻璃移液管小心移除聚-L-赖氨酸溶液。随后用无菌水冲洗两次。为收集星形胶质细胞，首先用 10 毫升温热的 1× PBS CMF 洗涤细胞一次。在 37 摄氏度、5% 二氧化碳和 21% 氧气条件下，用 10 毫升温热的 20% 胰蛋白酶 EDTA 溶液孵育 3 分钟。通过机械方式将细胞从培养瓶上分离，并将悬液转移至含有 5 毫升温热未稀释 FCS 的锥形管中。在20°C条件下，以190 × g离心5分钟。将细胞沉淀重悬于5 mL温热的星形胶质细胞培养基中，然后取20 µL细胞悬液与80 µL不含钙镁的1× PBS混合稀释。在显微镜下使用手动计数板对细胞进行计数。在每个预先包被多聚-L-赖氨酸的孔中，以每平方厘米约40,000个细胞的密度接种，每孔加入1.5毫升预温的星形胶质细胞培养基。将翻转的插入式滤膜置于直径25毫米带盖培养皿的边缘，向插入式滤膜中加入250微升I型胶原溶液。室温孵育1小时。然后使用连接至抽吸系统的玻璃移液管小心吸除 I 型胶原溶液。在室温下用 250 微升高糖 DMEM 洗涤两次，并小心移除插入式滤膜中的全部溶液。用 10 毫升温热的 1× PBS 无钙镁溶液洗涤周细胞两次，随后加入 2 毫升温热的胰蛋白酶孵育细胞。在显微镜下观察细胞，以监测胰蛋白酶的作用。当细胞开始脱落时，移除胰蛋白酶，然后向细胞中加入5毫升温热的内皮细胞基础培养基或ECM，并开始机械解离。取20微升细胞悬液与80微升1×PBS CMF混合稀释，按照之前所示方法，在显微镜下使用手动计数室对细胞进行计数。在250微升体积中，将每平方厘米44,500个细胞接种于预先编码的倒置插入式滤膜上。将插入式滤膜置于37摄氏度、含5%二氧化碳和21%氧气的加湿培养箱中孵育3小时。使用无菌镊子小心地将插入式滤膜翻转至12孔板中，每孔加入1.5毫升预温的ECM。插入式滤膜现在已准备好在另一侧进行包被。将500微升基于细胞外基质的水凝胶涂覆于滤膜上表面及插入式滤膜上。将插入式滤膜置于37摄氏度、含5%二氧化碳和21%氧气的湿润化培养箱中孵育一小时。在室温下用 500 微升 DMEM 高糖培养基洗涤一次。用 10 毫升预热的 1× PBS 无钙镁溶液洗涤内皮细胞培养物一次，然后加入 2 毫升预热的胰蛋白酶进行孵育。当细胞开始脱落时，移除胰蛋白酶，随后加入 5 毫升预热的 ECM 培养基，并开始机械解离。取20微升细胞悬液，与80微升不含钙镁的1×PBS混合稀释，使用手动计数板对细胞进行计数。以每平方厘米71,500个细胞的密度，将内皮细胞接种于预编码插入式滤膜中，接种体积为500微升温热的ECM培养基。每孔更换为1.5毫升温热的ECM培养基以替代星形胶质细胞培养基。然后将接种有细胞的插入式滤膜转移至含有星形胶质细胞的孔中。将三培养细胞系统置于37摄氏度、5%二氧化碳和21%氧气的加湿培养箱中。使用连接抽吸系统的玻璃移液管，小心地从上室和下室中移除培养基。在上室中加入500微升、下室中加入1.5毫升的预热ECM培养基。每隔一天更换一次培养基，直至第六天，重复相同操作。最后将细胞放回37°C、5%二氧化碳和21%氧气的加湿培养箱中继续培养。免疫细胞化学数据证实了周细胞表达经典标志物，如血小板源性生长因子受体β和结蛋白，星形胶质细胞表达胶质纤维酸性蛋白。因此，在与周细胞和星形胶质细胞共培养六天后，通过血管内皮钙黏蛋白的黏附连接染色所观察到的类脑内皮细胞单层（BLECs），其细胞边界处紧密连接蛋白CLD5和ZO-1呈现连续定位。此处展示了BLECs对荧光血脑屏障完整性标志物——荧光素钠和FITC标记的葡聚糖——的旁细胞通透性。与未使用外排泵抑制剂Elacridar的对照条件相比，BLEC细胞内R123的蓄积量在存在Elacridar时显著增加。这表明BLEC细胞中存在活性外排泵分子，即P-糖蛋白和乳腺癌耐药蛋白（BCRP）。此处显示的是以RPLP0表达量为标准化参照的紧密连接蛋白、转运蛋白和大分子受体的基因表达水平。此处，大于一的数值表示三重培养模型中基因表达水平更高。红色线条对应数值为一，表示两种模型的表达水平相当。代表性图像显示了以β-肌动蛋白表达量为标准化依据的紧密连接蛋白、转运蛋白以及大分子受体的蛋白水平。评估了荧光标记的基于NIPAM的中性聚合物纳米凝胶的转运情况。在零时间点，将聚合物纳米凝胶以0.1毫克/毫升的浓度置于管腔室中。经过24小时孵育后，在基底外室中检测到5.82%的聚合物纳米凝胶，证明其能够穿过BLECs。在倒置滤膜上正确包被和接种周细胞至关重要。必须保持滤膜结构的无菌性和完整性，以避免细胞培养系统受到污染。

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