Name: 从 大肠杆菌 和其他细菌中可扩展地分离和纯化细胞外囊泡 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: 学习从大肠杆菌等细菌中可扩展地分离和纯化细胞外囊泡的方法。该方案采用过滤和尺寸排阻色谱技术，适用于大规模培养体系，为体内研究和细菌细胞外囊泡的治疗应用奠定基础。

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上述研究由美国国立卫生研究院（NIH）TL1 TR002549-03 培训资助项目支持。我们感谢凯斯西储大学的 John C. Tilton 博士和 Zachary Troyer 博士协助使用粒径分析仪；感谢 Spectradyne 公司的 Lew Brown 在粒径分布数据分析方面的技术支持；感谢康奈尔大学的 David Putnam 博士提供 pClyA-GFP 质粒14；以及感谢宾夕法尼亚大学的 Mark Goulian 博士为我们提供 E. coli MP113。

注意：涉及细菌和重组 DNA 的所有操作均应遵循针对每种菌株生物安全危害等级的生物安全防护最佳实践。操作应符合当地、国家和国际生物安全法规。
1. 细菌菌株及培养条件
注意：本研究中使用的细菌菌株为Escherichia coli MP113、Akkermansia mucinophila、Bacteroides thetaiotaomicron、Bifidobacterium breve&#160;和Bifidobacterium dentium。
<ol>
	<li>对于 E. coli，使用无菌接种环将单菌落接种至 250 至 1,000 mL 的 Luria-Bertani (LB) 液体培养基中，在 300 rpm、37 °C 条件下于摇床培养箱中好氧培养 48 小时后再进行后续处理。对于携带 p114-mCherry-Clyluc 的重组 E. coli MP1 菌株（补充方法&#160;和 补充图 S1），需在 LB 琼脂平板和液体培养基中加入氯霉素，终浓度为 17 µg/mL。</li>
	<li>对于 A. mucinophila、B. thetaiotaomicron、B. breve 和 B. dentium，在脑心浸液（BHI）琼脂平板上划线，置于乙烯基厌氧舱内进行厌氧培养。挑取单菌落接种至 100 mL 预还原的 BHI 液体培养基中，厌氧条件下培养 48 小时。</li>
</ol>
2. 外泌体分离
<ol>
	<li>通过离心和过滤澄清细菌培养基
	<ol>
		<li>将第1步接种的细菌培养物通过倾倒转移至洁净的250 mL或500 mL聚丙烯离心管中。在4 °C条件下，使用大容量固定角转子离心机以5,000 × g 15分钟。小心倾倒，将上清液转移至干净的离心管中，再以10,000 × g 15 分钟。 
		&#8203;注意：在进行适当的生物安全清洗和去污后，可重复使用这些瓶子。
		<ol>
			<li>如果第二次离心后仍有较大的细菌细胞沉淀，请将样品转移至洁净的离心瓶中再次离心，以进一步去除细胞。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将上清液倾倒至适当大小的0.22 µm聚醚砜真空驱动滤器装置中，通过连接滤器装置至壁式真空系统进行过滤。若过滤速度显著下降，可将未过滤的样品转移至新的滤器装置中继续过滤。将过滤后的培养基于4 °C过夜保存，如需要，可在次日继续后续实验步骤。 
		注意：上述离心步骤通常允许每个装置处理约两倍于标示体积的细胞培养液。例如，一个500 mL的滤器装置可过滤约1,000 mL经预离心的培养液。这些装置通常不重复使用。不建议在此步骤中直接使用注射器滤器，除非经过优化，因为在测试型号中观察到明显的样品损失。此步骤可作为潜在的暂停点。</li>
		<li>此时，取部分过滤后的上清液涂布于适宜的琼脂平板，检查活细胞是否已完全去除，并在该菌株最适培养条件下孵育后确认无任何菌落生长。若检测到细菌残留，需进一步优化上述步骤，增加离心次数和/或过滤次数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>过滤培养基的浓缩
	<ol>
		<li>若处理的体积显著不同 &#62;100 mL，进行步骤 2.2.2。 若处理约100 mL体积的样品，使用刻度移液管将90 mL过滤后的培养基加入相应容量的100 kDa截留分子量（MWCO）离心超滤装置的储液室中。始终使用配对的超滤装置进行平衡，并在4 °C条件下，以2,000 × g的转速在水平转子中离心 g 15-30 分钟，直至上层储液室中的培养基体积浓缩至 &#60;0.5 mL
		<ol>
			<li>用剩余的过滤培养基补充分液储液槽。如果 &#34;补充至满&#34; 移除装置底部的流穿液，并重新平衡各装置。 
			注意：观察到使用这些装置可浓缩的过滤培养基的最大体积为 &#60;推荐体积的2倍。</li>
			<li>如果储液池中浓缩培养基的黏度明显增加（出现深色、黏稠物质），则用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释，并通过离心重新浓缩，以稀释分子量截留值低于100 kDa的非EV蛋白。 
			注意：此处可能是暂停点。</li>
			<li>将浓缩后的培养基转移至低蛋白结合管中，4 °C 过夜保存，如需要，可在次日继续进行后续步骤。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>若处理的体积显著不同 &#62;100 mL选择合适尺寸的TFF装置（100 kDa截留分子量）以适应待处理样品的体积。 
		注意：用于处理 100 mL 至 &#62;1,000 mL 规格可商业购买。具体型号的选择将取决于本地可获得性、成本以及与泵和管路/连接件的兼容性。&#160;最多可使用指定装置处理 2 L 培养基 材料表 在需要清洗滤膜之前（清洗步骤详见下文2.3）。
		<ol>
			<li>使用#16低吸附/低浸出管路、1/8英寸软管接头转鲁尔接头适配器、TFF装置和蠕动泵，按照图示组装过滤回路 补充图 S2. 
			注意：应在生物安全柜内进行切向流过滤（TFF），以最大限度降低环境细菌污染细胞外囊泡制备物的风险。</li>
			<li>在室温下，开始以约 200 mL/min（最低 100 mL/min）的流速循环过滤后的培养基。通过将 200 mL PBS 泵入量筒，确定与目标流速相对应的合适转速（RPM）。在循环过滤后的培养基时，收集目标分子 &#60;100 kDa 的物质穿过超滤膜，作为废液收集于另一个容器中。 
			注意：以下示例假设起始培养体积为 2 L。</li>
			<li>继续循环浓缩培养基，直至其体积减少至约 100–200 mL。根据需要转移至较小容器中。用 PBS 稀释 2 倍，继续使用泵循环，浓缩至 75–100 mL。再用 PBS 稀释 2 倍，继续循环浓缩至终体积 25 mL。用 PBS 稀释 2 倍，并继续循环，直至 &#60;10 mL</li>
			<li>将进样管从样品储液槽中取出，并继续泵液以冲洗滤膜并回收最大量的样品。 
			注意：此处可能是潜在的暂停点。</li>
			<li>将浓缩后的样品转移至锥形管中，如需可于4 °C条件下保存过夜。也可直接继续后续实验步骤。</li>
			<li>将浓缩后的样品转移至一个容量为15 mL、截留分子量为100 kDa的离心超滤装置中。在4 °C条件下，使用水平转子以2,000 × g离心 g 15-30 分钟，直至上层储液槽中的培养基体积浓缩至 &#60;2 mL 
			注意：此处为潜在的暂停点。</li>
			<li>将浓缩后的培养基转移至低蛋白结合管中，4 °C 过夜保存，如需要，可于次日继续进行后续实验步骤。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>清洗TFF装置（可选） 
	注意：随着TFF装置开始出现堵塞，过滤速率会下降 &#34;堵塞&#34; 在过滤过程中（污染发生时）可对滤器装置进行清洗，以利于在同一纯化流程中继续过滤其他样品。尽管理论上可行，但为避免交叉污染，清洗后的切向流过滤（TFF）滤器未被用于不同的纯化流程。
	<ol>
		<li>清洁时，需从TFF装置上拆下所有管路和盖帽，并排干残留液体。</li>
		<li>使用蠕动泵和管路对TFF装置的内室和外室进行灌注（即通过材料清单中所列型号的平行端口和垂直端口） 材料表用约 100 mL 蒸馏水冲洗。取下所有管路和盖帽，排空 TFF 装置。</li>
		<li>封闭外侧（垂直方向，滤液）端口，循环使用 250 mL 20% 乙醇水溶液 &#62;内腔以200 mL/min流速冲洗10分钟。按上述方法排空，用蒸馏水充满后再次排空。</li>
		<li>将250 mL新鲜的0.5 N NaOH溶液在内室中循环30分钟，然后再次排空。</li>
		<li>重新连接所有管路和管帽至进液口、出液口和滤液口，操作同前。 补充图 S2，再次循环0.5 N NaOH溶液直至达到NaOH体积 &#62; 1 mL/cm2 滤膜的表面积允许液体透过并被收集为滤液/废液。</li>
		<li>用蒸馏水按上述方法冲洗TFF装置。立即使用TFF装置，或加入约100 mL的20%乙醇浸泡，并于4 °C过夜保存。 
		&#8203;注意：若保存在乙醇中，务必排干液体，用水冲洗后再次排干，并循环通过250 mL PBS，直至流出液体积达到指定体积 &#62;1 mL/cm2 滤膜的表面积允许液体透过并收集滤液/废液，以在样品处理前去除残留的乙醇。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>凝胶过滤色谱（SEC） 
	注意：SEC 用于提高 EVs 的纯度并去除非囊泡蛋白。
	<ol>
		<li>使用小型尺寸排阻色谱柱（10 mL 床体积）分离细胞外囊泡（EVs） &#60;100 mL 起始材料及更大规格的层析柱（47 mL 床体积）用于分离细胞外囊泡（EVs） &#62;100 mL 起始材料。 
		注意：以下示例将列出较大柱体的体积，较小柱体的体积则标注在括号内。</li>
		<li>将SEC柱和PBS在数小时内恢复至室温。使用标准实验室支架和夹具将SEC柱固定于垂直位置。也可使用商用色谱柱支架。</li>
		<li>在连接SEC柱之前，让5 mL PBS流经烧结滤片并流入废液容器，以水化样品储液室。拧开SEC柱的入口盖，向样品储液室中加入2 mL PBS，并在PBS通过烧结滤片滴出时，小心地将储液室连接至色谱柱（小规格SEC柱不适用此步骤）。 
		注意：此前一步骤可防止空气泡滞留在凝胶过滤层析柱顶部。若已有空气滞留，请取下储液槽，轻敲层析柱以排出气泡，并重复连接操作。对于较小的层析柱，只需打开凝胶过滤层析柱上端，连接样品进样漏斗即可。</li>
		<li>向样品储液池中加入 47 mL（10 mL）PBS，打开 SEC 柱底部盖子。让所有上样缓冲液流过色谱柱以达到平衡，弃去流出液。</li>
		<li>将最多2 mL（0.5 mL）样品加入样品储液室，弃去穿流液，使样品完全进入层析柱。</li>
		<li>立即向样品储液罐或加样斗中加入PBS，体积为14.25 mL减去样品体积（对于小柱，为3 mL减去样品体积）。让溶液流过层析柱，并弃去相当于柱空体积的流出液。 
		注意：对于一个典型的2 mL样品，需加入样品储槽或料斗中的PBS体积为12.25 mL。</li>
		<li>将一个2 mL低吸附微量离心管置于SEC柱正下方。立即向样品储液池中加入2 mL（0.5 mL）PBS，使其自然流入层析柱。将此初段流出的2 mL（0.5 mL）标记为 组分1继续每次向样品储槽中加入 2 mL（0.5 mL），以收集后续每一份组分。 
		注意：大多数细菌EVs在前5个组分中洗脱。在优化过程中，收集了前12个组分。</li>
		<li>将组分储存于4 °C用于短期保存（数天）或-80 °C用于长期保存。</li>
		<li>可重复使用SEC色谱柱的清洗与保存 
		注意：根据制造商说明，本方案中所述的SEC柱最多可重复使用5次。&#160;如果SEC柱的流速在使用后降低 &#60;使用5次后，制造商建议在体积排阻色谱（SEC）前，于10,000 × g离心10分钟以去除聚集物。随后取此离心步骤的上清液上样&#160; 用于EV分离的SEC柱&#160;
		<ol>
			<li>每次使用凝胶过滤层析柱后，加入 2 mL（0.5 mL）0.5 M NaOH，使其完全进入层析柱。随后以 100 mL（20 mL）20% 乙醇冲洗层析柱，并于 4 °C 保存至下次使用。下次使用前，将乙醇溶液平衡至室温，并通过再以 150 mL（30 mL）PBS 缓冲液冲洗层析柱，置换为 PBS 缓冲体系。</li>
			<li>每次使用后若需清洗并立即重复使用SEC柱，加入2 mL（0.5 mL）0.5 M NaOH，使其完全进入柱内。随后运行约150 mL（30 mL）PBS缓冲液以彻底洗去NaOH。当流出液pH值与PBS一致（约7）时，即可上样新的样品。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 细胞外囊泡制备的质量控制
<ol>
	<li>无菌检测 
	注意：由于这些EV来源于细菌培养物，因此在用于后续实验前确保其无菌性至关重要。
	<ol>
		<li>取用于检测的组分100 µL（20 µL），接种至3 mL用于培养来源细菌的培养基中。在各自最适条件下培养至少3天，观察是否出现浑浊。或者，将组分样品涂布于含有生产菌培养基的琼脂平板上，观察是否有菌落形成。 
		注意：若检测到细菌污染，则不建议将该EV制备物用于实验。应重新进行分离操作，并注意通过以下措施尽量降低细菌污染风险：(a) 对细菌条件培养基进行充分的离心/过滤；(b) 使用洁净的瓶子、管路、滤器和层析柱；(c) 采用适当的无菌操作技术。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白质定量 
	注意：使用了一种高灵敏度的基于荧光的蛋白质定量试剂盒（见材料表）。该试剂盒需配合专用荧光计使用，激发/发射波长为485/590 nm。
	<ol>
		<li>将所有试剂、标准品和样品恢复至室温。</li>
		<li>通过将1 µL试剂加入199 µL缓冲液中，为每个待测样品和标准品配制蛋白检测试剂与缓冲液的主混合液。使用薄壁0.5 mL PCR管，向每根标准品管中加入10 µL标准品和190 µL主混合液。 
		注意：为使检测结果处于线性范围内，加入每根样品管的组分体积应根据纯化后预期的蛋白产量确定。通常每根样品管加入5 µL组分和195 µL主混合液。样品与主混合液的最终体积必须为200 µL。</li>
		<li>涡旋混匀各检测管，在室温避光条件下孵育至少15分钟。</li>
		<li>在相应的专用荧光计上（见材料表），使用箭头按钮选择蛋白质检测选项，按GO键确认。按照屏幕提示依次插入各标准品管并按下GO键进行测定。</li>
		<li>插入实验样品管，按GO键读数，并记录显示的结果，该值为样品与检测缓冲液混合物中的实际蛋白质浓度。为获得样品中的蛋白质浓度，使用方向键选择计算样品浓度选项，按GO键，再使用方向键选择该样品加入检测缓冲液中的样品体积，按GO键后记录样品蛋白质浓度。对每个待分析样品重复此步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>颗粒计数与粒径分布分析 
	注意：采用微流控电阻脉冲传感技术（MRPS）对EV浓度和粒径分布进行定量。
	<ol>
		<li>将样品用含1% Tween-20的PBS稀释，该PBS需经0.02 µm注射器滤器过滤，稀释至蛋白浓度约为0.1 µg/mL。 
		注意：稀释的目的是使含EV组分中的预期颗粒浓度达到约1010 颗粒/mL。最佳稀释倍数可能需要通过实验确定。对于较晚的组分（Fraction 6之后），预期EV数量较少，因此即使在低倍稀释下分析，颗粒浓度也可能&#60;1010 颗粒/mL。</li>
		<li>使用微量移液器将每份样品3 µL加载至一次性微流控芯片中，将芯片插入MRPS仪器，按下带有蓝色发光环的金属按钮。</li>
		<li>在采集软件中点击Go!，等待仪器完成样品分析。采集1,000至10,000个颗粒事件，以最小化技术性统计误差。完成后点击Stop和End Run，结束样品采集。 
		注意：除原始数据文件外，仪器会输出一个汇总电子表格，列出样品中的颗粒浓度。需根据样品稀释倍数对数值进行校正。</li>
		<li>使用分析软件加载原始数据，并生成自定义的粒径分布图。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 细胞外囊泡的保存
<ol>
	<li>将单个或混合的组分分装至低蛋白结合管中，每份体积为单个组分体积的25-50%（取决于所用柱的大小），并于-80 °C保存，以避免反复冻融。 
	&#8203;注意：不同应用可能需要根据每次实验预期使用量调整分装体积的大小，需通过实验确定。若非EV组分不适用于研究目的，可予以弃去。</li>
</ol>
5. 透射电子显微镜
<ol>
	<li>负染色法
	<ol>
		<li>取5 µL EV样品加入碳膜铜网（400目）上，室温孵育10分钟。用5滴5 mM Tris缓冲液（pH 7.1）清洗样品面，再用5滴蒸馏水清洗。</li>
		<li>用5滴2%醋酸铀对样品面进行染色。用滤纸吸去多余染液，将铜网置于空气中彻底干燥数小时或过夜。使用80 kV电压的电子显微镜观察样品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫胶体金标记
	<ol>
		<li>将10 µL EV悬液滴加至Formvar/碳膜铜网（400目）上，室温孵育1小时。用PBS洗涤3次，然后加入4%多聚甲醛固定10分钟。再用PBS洗涤5次。</li>
		<li>用含0.1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS洗涤3次以封闭非特异性结合位点。随后加入10 µL一抗，室温孵育40分钟（此处使用nluc抗体，浓度为1 µg/mL）。再用含0.1% BSA的PBS洗涤3次。</li>
		<li>向铜网上加入10 µL胶体金标记的二抗，室温孵育40分钟。用PBS洗涤3次。 
		注意：此处使用的是用封闭缓冲液按1:10稀释的10 nm金颗粒标记的山羊抗小鼠二抗。&#160;若金颗粒标记影响EV的观察，可改用更小尺寸金颗粒（如5 nm）的二抗。</li>
		<li>加入10 µL 2.5%戊二醛，室温下后固定10分钟。用PBS洗涤3次。用2%醋酸铀（10 µL）负染15分钟。将样品在10 µL含0.5%醋酸铀和0.13%甲基纤维素的溶液中嵌入染色10分钟。</li>
		<li>将样品铜网在室温下过夜干燥，然后进行电子显微镜成像。</li>
		<li>在显微镜成像软件中，根据经验确定最佳图像质量所需的曝光时间（例如，在本实验设置中为0.80851 s），并将该数值输入曝光时间选项框中。选择80 kV选项，点击开始采集以获取图像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+bacterial+outer+membrane+vesicles+with+enhanced+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality.</a> Journal of Molecular Biology. 380 (1), 51-66 (2008).</li>
<li>Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+gram-negative+cell+walls+and+their+derived+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles.</a> Journal of Bacteriology. 181 (16), 4725-4733 (1999).</li>
<li>Reimer, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+outer+membrane+vesicle+isolation+methods+with+an+Escherichia+coli+tolA+mutant+reveals+a+hypervesiculating+phenotype+with+outer-inner+membrane+vesicle+content%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of outer membrane vesicle isolation methods with an Escherichia coli tolA mutant reveals a hypervesiculating phenotype with outer-inner membrane vesicle content.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 628801(2021).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

上述方案描述了一种可扩展且可靠的方法，用于从多种革兰氏阴性/阳性以及需氧/厌氧细菌中分离细胞外囊泡（EVs）。该过程包含多个潜在的暂停步骤，但最好避免从条件化细菌培养基中分离EVs的时间超过48小时。
首先，需要培养细菌以制备条件化细菌培养基。研究发现，将培养时间延长至至少48小时，并使用最佳生长培养基，有助于最大化细胞外囊泡（EV）的产量。很可能每种细菌物种都需要针对这两个参数进行优化。细菌培养的体积也很重要，以确保能够分离出足够量的EV用于目标应用。对于体外（in vitro）研究，通常从至少100 mL的培养物中分离EV；而对于体内（in vivo）研究，通常需要从&#62;1 L的培养基中分离EV。同样，每种细菌菌株的EV产生特性以及下游检测所需的EV用量将决定最低起始培养体积。
一旦获得条件培养基，必须去除细胞和大的非细胞外囊泡（EV）碎片。研究发现，离心是该过程中的关键步骤。如上述方案所述，需进行两次逐步增加相对离心力（g）的离心操作。如果发现第二次离心的沉淀物...

细胞外囊泡（EVs）是一类由原核和真核细胞分泌的、大小为纳米级的脂质体样结构，由脂质、蛋白质、糖类和核酸组成1。自早期研究观察到革兰氏阴性菌释放EVs以来2，过去几十年中，人们对细菌来源的EVs（直径为20–300 nm）所具有的生物学功能的认识不断扩展。这些功能包括介导抗生素耐药性转移3、生物膜形成4、群体感应5以及毒素递送6。此外，细菌EVs作为治疗剂的应用也日益受到关注，尤其是在疫苗学7和癌症治疗领域8。
尽管人们对细胞外囊泡（EV）研究的兴趣日益增长，但在分离方法方面仍存在技术挑战。具体而言，亟需具备可重复性、可扩展性且适用于多种EV产生生物体的分离方法。为建立统一的EV分离及研究方法规划与报告原则，国际细胞外囊泡学会定期发布并更新MISEV立场文件9此外，EV-TRACK 联盟提供了一个开放平台，用于报告已发表论文中使用的细胞外囊泡（EV）分离的详细方法，以提高研究透明度10.
在本实验方案中，我们对先前用于从哺乳动物细胞培养物中分离细胞外囊泡（EVs）的方法进行了改进11,12，以实现从细菌细胞培养物中分离EVs。我们旨在采用能够从多种微生物中分离EVs、具有可扩展性，并能在EV纯度与得率之间取得平衡的方法（如MISEV立场文件中所述9）。通过离心和过滤去除细菌细胞及碎片后，使用离心式超滤装置（适用于约100 mL以内的体积）或泵驱动的切向流过滤（TFF，适用于更大体积）对培养基进行浓缩。随后，采用针对小EV纯化优化的尺寸排阻色谱柱（SEC）进行EV的分离。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63155/63155fig01.jpg" /> 
图1：细菌胞外囊泡（EV）分离流程示意图。缩写：EV = 胞外囊泡；TFF = 切向流过滤；SEC = 尺寸排阻色谱；MWCO = 分子量截留值。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63155/63155fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
使用一种与小鼠共生的大肠杆菌（Escherichia coli，即 E. coli MP113）作为模式生物，并通过与细胞溶素A融合表达细胞外囊泡（EV）相关纳米荧光素酶，如先前报道14。本研究所采用的方法可处理至少数升体积的细菌培养物，并能有效分离与细胞外囊泡相关的蛋白和非囊泡相关蛋白。此外，该方法也可适用于其他革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。所有已报道实验的相关数据均已提交至EV-TRACK知识库（EV-TRACK ID：EV210211）10。

<table><tbody><tr><td>0.5 mL 平盖薄壁 PCR 管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>3430</td><td>使用薄壁PCR管对于获得Qubit检测的准确读数至关重要</td></tr><tr><td>16% 甲醛（Paraformaldehyde）水溶液</td><td>电子显微镜科学</td><td>15700</td><td></td></tr><tr><td>250 mL Fiberlite 聚丙烯离心管</td><td>ThermoFisher</td><td>010-1495</td><td></td></tr><tr><td>500 mL Fiberlite 聚丙烯离心瓶</td><td>ThermoFisher</td><td>010-1493</td><td></td></tr><tr><td>65 毫米聚丙烯圆底/锥形瓶适配器</td><td>Beckman Coulter</td><td>392077</td><td>使 Vivacell 能够适配转子</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;阿克曼氏菌（Akkermansia mucinophila）&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td>BAA-835</td><td></td></tr><tr><td>Amicon-15（100 kDa 截留分子量）</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-20 XPI 离心机</td><td>贝克曼库尔特</td><td></td><td>不再由贝克曼销售。Avanti J-26XP 为目前最接近的型号。</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Bacteroides thetaiotaomicron &lt;/em&gt;VPI 5482</td><td>美国典型培养物保藏中心</td><td>29148</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;短双歧杆菌&lt;/em&gt;</td><td>NCIMB</td><td>B8807</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;齿双歧杆菌&lt;/em&gt;</td><td>美国典型培养物保藏中心</td><td>27678</td><td></td></tr><tr><td>脑心浸液（BHI）肉汤</td><td>Himedia</td><td>M2101</td><td>高压灭菌后，将脑心浸液肉汤和琼脂引入厌氧室，并补充甲萘醌（1 &amp;micro;克/升），血红素（1.2 &amp;micro;g/L）和盐酸半胱氨酸（0.05%），然后在厌氧条件下孵育至少24小时，再接种厌氧菌株。</td></tr><tr><td>C-300 微流控芯片</td><td>Spectradyne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN19032105</td><td></td></tr><tr><td>电子显微镜</td><td>FEI公司</td><td>Tecnai G2 SpiritBT</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;大肠杆菌&lt;/em&gt; HST08（Steller 感受态细胞）</td><td>Takara</td><td>636763</td><td></td></tr><tr><td>大肠杆菌 MP1</td><td>Dr. Mark Goulian（赠予）</td><td></td><td>源自小鼠肠道的共生细菌</td></tr><tr><td>Fiberlite 500 mL 至 250 mL 转接头</td><td>ThermoFisher</td><td>010-0151-05</td><td>使用 Fiberlite 转子，以便在较小体积的起始细菌培养中使用 250 mL 瓶</td></tr><tr><td>Fiberlite 定角离心机转子</td><td>ThermoFisher</td><td>F12-6x500-LEX</td><td>可容纳 6 个 500 mL 瓶子</td></tr><tr><td>400目铜载Formvar碳膜</td><td>电子显微镜科学</td><td>FCF-400-CU</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛（电子显微镜级，10% 水溶液）</td><td>电子显微镜科学</td><td>16100</td><td></td></tr><tr><td>血红素</td><td>ChemCruz</td><td>207729B</td><td>储备液用0.2 M L-组氨酸溶液配制&amp;nbsp; 1.2 mg/mL</td></tr><tr><td>Infinite M Nano+ 微孔板读板仪</td><td>Tecan</td><td></td><td>该设备用于测量 mCherry 荧光</td></tr><tr><td>In-Fusion&amp;nbsp; HD克隆Plus</td><td>Takara</td><td>638909</td><td>将PCR片段克隆至PCR线性化载体中</td></tr><tr><td>JS-5.3 AllSpin 摇摆桶转子</td><td>贝克曼库尔特</td><td>368690</td><td></td></tr><tr><td>劳里亚·伯特尼（LB）肉汤，米勒配方</td><td>Difco</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>L-半胱氨酸盐酸盐</td><td>J.T. Baker</td><td>2071-05</td><td>应在厌氧环境中直接称重并加入已灭菌的BHI培养基中</td></tr><tr><td>Masterflex 接头，聚丙烯，直型，阴性鲁尔接头转软管接头，1/8&quot; ID；25/PK</td><td>Cole-Parmer - 特殊</td><td>HV-30800-08</td><td>过滤管路系统的连接适配器</td></tr><tr><td>Masterflex 接头，聚丙烯，直型，公鲁尔接头转软管接头，1/8&quot; ID；25/PK</td><td>Cole-Parmer - 特殊</td><td>HV-30800-24</td><td>过滤管路系统的连接接头</td></tr><tr><td>Masterflex L/S 模拟可调速控制台驱动器，20 至 600 转/分钟</td><td>Masterflex</td><td>HV-07555-00</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 精密管路易装泵头，4 辊轮，PARA 机壳，不锈钢转子</td><td>Masterflex</td><td>EW-07514-10</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 精密泵管，PharmaPure，L/S 16；25 英尺</td><td>Cole Palmer</td><td>EW-06435-16</td><td>低吸附/低溶出管路</td></tr><tr><td>甲萘醌（维生素K3）</td><td>MP</td><td>102259</td><td>储备液以乙醇配制，浓度为1 mg/mL</td></tr><tr><td>MIDIKROS 41.5厘米 100K MPES 0.5毫米 FLL × FLL 1/包</td><td>Repligen</td><td>D04-E100-05-N</td><td>我们使用的TFF装置可过滤多达2 L的大肠杆菌培养上清液</td></tr><tr><td>Nano-Glo 荧光素酶检测系统</td><td>Promega</td><td>N1110</td><td>该检测试剂盒用于检测nluc报告蛋白的发光情况</td></tr><tr><td>NanoLuc (Nluc) 荧光素酶抗体，克隆 965808</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>MAB10026</td><td></td></tr><tr><td>nCS1 微流控电阻脉冲传感仪</td><td>Spectradyne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nCS1 Viewer</td><td>Spectradyne</td><td></td><td>用于粒径分布的分析软件</td></tr><tr><td>OneTaq 2x Master Mix（含标准缓冲液）</td><td>美国新英格兰生物实验室</td><td>M0482</td><td>用于菌落鉴定常规PCR反应的DNA聚合酶预混液</td></tr><tr><td>蛋白低吸附 LoBind，2.0 mL，PCR 洁净管</td><td>Eppendorf</td><td>30108450</td><td></td></tr><tr><td>Q5 高保真 2x 预混液</td><td>NEB</td><td>M0492</td><td>用于克隆所需PCR反应的DNA聚合酶预混液</td></tr><tr><td>qEV 原始型，35 nm</td><td>Izon</td><td></td><td>最大上样体积为 0.5 mL</td></tr><tr><td>qEV 样品架</td><td>Izon</td><td></td><td>用于 qEV-original SEC 柱</td></tr><tr><td>qEV-2，35 nm</td><td>Izon</td><td></td><td>最大上样体积为 2 mL</td></tr><tr><td>Qubit 荧光仪</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>该产品已不再提供。最接近的可用产品为 Qubit 4.0 荧光计（货号 Q33238）</td></tr><tr><td>Qubit 蛋白质检测试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33211</td><td>将试剂盒于室温保存。标准品于 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Sorvall Lynx 4000 离心机</td><td>ThermoFisher</td><td>75006580</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax i3x 微孔板读板仪</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>该设备用于测量纳米荧光素酶的生物发光</td></tr><tr><td>Stericup Quick-release-GP 无菌真空过滤系统（150、250 或 500 mL）</td><td>MilliporeSigma</td><td>S2GPU01RE&lt;br/&gt; S2GPU02RE&lt;br/&gt; S2GPU05RE</td><td>可使用一个或多个滤器以适应工作体积。根据我们的经验，过滤体积可达产品规格所列体积的两倍。</td></tr><tr><td>醋酸铀酰</td><td>电子显微镜科学</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>乙烯厌氧室</td><td>Coy 实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vivacell 100，100,000 截留分子量 PES</td><td>Sartorius</td><td>VC1042</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Anotop 10 Plus 注射器滤器（0.02 微米）</td><td>MilliporeSigma</td><td>WHA68093002</td><td>过滤 MRPS 稀释液</td></tr></tbody></table>

可扩展的细胞外囊泡分离与纯化方法 大肠杆菌 及其他细菌

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

多种细菌可分泌直径约20-300 nm的细胞外囊泡（EVs），其成分包括来自亲代细胞的脂质、蛋白质、核酸、聚糖及其他分子。EVs可作为种内和种间通讯的载体，同时在感染与定植过程中参与细菌与宿主生物之间的相互作用。鉴于EVs在健康与疾病状态下具有多种功能，目前对分离EVs用于体外（in vitro）和体内（in vivo）研究的兴趣日益增加。有研究假设，根据EVs的物理特性（特别是尺寸）进行分离，将有助于从不同细菌培养物中实现囊泡的有效分离。
分离流程包括离心、过滤、超滤和尺寸排阻色谱法（SEC），用于从细菌培养物中分离细胞外囊泡（EVs）。引入泵驱动的切向流过滤（TFF）步骤以提高可扩展性，从而能够从数升起始培养液中分离材料。Escherichia coli 被用作模型系统，表达与EV相关的纳米荧光素酶（nanoluciferase）和非EV相关的mCherry作为报告蛋白。通过将纳米荧光素酶的N端与溶细胞素A融合，使其靶向定位至EVs。含有20–100 nm EVs及与溶细胞素A融合的纳米荧光素酶（cytolysin A - nanoLuc）的早期色谱组分，与含有游离蛋白的后期组分明显不同。EV相关纳米荧光素酶的存在通过免疫金标记和透射电子显微镜得到证实。该EV分离流程适用于其他与人类肠道相关的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌物种。综上所述，结合离心、过滤、超滤/TFF和SEC的方法可实现从多种细菌物种中规模化分离EVs。采用标准化的分离流程将有助于跨物种开展微生物EVs的比较研究。

为了评估哪些SEC色谱组分富含EVs，将2 mL样品加载至SEC色谱柱中 E. coli 经TFF浓缩1000倍的MP1条件培养基，并收集连续洗脱组分。通过MRPS分析发现，第1-6组分含有最多的EVs（图2A）。后续的组分中含有极少的EVs，主要由无EV的蛋白质组成（图2B）。细胞外囊泡（EVs）主要 &#60;直径100 nm（图2C）。透射电子显微镜（TEM）证实了细胞外囊泡（EV）的富集及其大小特征，尤其在第2至第6组分中。图2D).
为了进一步验证这些方法能否将细胞外囊泡（EVs）与非EV相关蛋白分离，构建了一种表达溶细胞素A-纳米荧光素酶融合蛋白以及游离（非融合）mCherry的重组 E. coli MP1 菌株（示意图见图3A）。先前研究...

细菌会分泌携带生物活性分子的纳米级细胞外囊泡（EVs）。EV研究主要关注其生物发生机制、在微生物间及宿主-微生物相互作用和疾病中的作用，以及潜在的治疗应用。本文介绍了一种可放大的从多种细菌中分离EV的方法流程，以促进EV研究的标准化。

多种细菌分泌直径约20-300 nm的细胞外囊泡（EVs），其成分包括脂质、蛋白质、核酸、聚糖及其他分子……

本方案的重要性在于，它提供了一种高度可重复的方法，用于从多种细菌中分离出细胞外囊泡。该技术的优势在于，可从规模较大的细菌培养环境中分离EVs，从而为体内研究创造条件。尽管我们展示的数据反映的是临床前应用，但可以预见，本方案有望被改进并用于治疗用细菌EVs的生产制造。该方法经过少量修改后可应用于任何可放大的细胞培养系统。由于该方案具有可扩展性，因此必须配备合适尺寸的滤器和尺寸排阻色谱柱，以处理所需起始体积的细菌培养物。演示实验操作的人员包括：贾斯汀·拉西亚（Justin Lathia）博士实验室的助理技术员萨迪·约翰逊（Sadie Johnson）、贾斯汀·拉西亚（Justin Lathia）博士实验室的肿瘤学研究员狄奥尼修斯·沃森（Dionysius Watson），以及我实验室的研究技术员阿基姆·桑托斯（Akeem Santos）。使用无菌接种环将大肠杆菌的单菌落接种于250至1000毫升的Luria-Bertani（LB）液体培养基中。随后，将培养物置于摇床培养箱中，在300转/分钟、37°C条件下进行好氧培养。培养48小时后，将菌液转移至洁净的500毫升聚丙烯离心管中，于4°C、5,000 × g条件下，使用大容量固定角转子离心机离心15分钟，以澄清细菌培养液。将上清液小心倾倒入干净的离心管中，于10,000 × g离心15分钟。随后，将上清液转移至适当大小的0.2微米聚醚砜真空驱动滤器装置，并将过滤装置连接至真空壁式供气系统。若过滤速度显著下降，需将未过滤的样品转移至新的过滤装置中。过滤后的培养基可在4°C下保存过夜，或立即进行后续处理。为检测活细胞是否完全去除，取一份过滤后的上清液涂布于合适的琼脂平板上，在该细菌菌株的最佳培养条件下孵育后，确认无任何菌落生长。对于体积为100毫升的过滤培养基，将其90毫升加入截留分子量为100千道尔顿的离心超滤装置的储液室中，于4°C条件下，使用摆桶转子以2,000 × g离心15至30分钟为一个区间，重复操作直至储液室中的液体体积浓缩至小于0.5毫升。为补充储液池中剩余的过滤培养基，需移除装置底部的流穿液以重新平衡。若储液池中浓缩培养基的黏度明显增加，可用 PBS 稀释培养基，再通过离心重新浓缩，以去除分子量低于 100 千道尔顿的非细胞外囊泡（EV）蛋白。随后，将浓缩后的培养基转移至低蛋白结合管中，在 4 摄氏度下过夜保存。对于体积超过 100 毫升的过滤培养基的浓缩，应选择合适尺寸、分子量截留值为 100 千道尔顿的切向流过滤（TFF）装置。按照文稿中所述组装过滤系统后，将200毫升PBS泵入量筒，以确定与目标流速相对应的合适泵速。设定泵速后，在室温下以约200毫升/分钟的速度循环过滤后的条件培养基，并收集穿过超滤膜、分子量小于100千道尔顿的组分作为废液，置于另一容器中，直至条件培养基体积减少至100至200毫升。随后，用PBS将过滤后的液体体积依次进行两倍稀释，并继续在较小容器中通过泵循环培养基，逐步将体积浓缩至75至100毫升，然后进一步浓缩至25毫升和10毫升。将进样管从样品储液槽中取出，并通过泵冲洗滤膜以最大限度回收样品。将浓缩后的样品转移至分子截留量为100千道尔顿的15毫升离心超滤装置中，在4°C条件下，使用水平转子以2,000 × g离心15至30分钟，重复此步骤直至上层储液槽中的液体体积小于2毫升。将浓缩后的培养基转移至低蛋白吸附管中，于4°C下过夜保存。为了分离细胞外囊泡（EVs），使用尺寸排阻色谱法（SEC）。当起始材料体积小于100毫升时，采用床体积为10毫升的小型色谱柱；当起始材料体积大于100毫升时，则使用床体积为47毫升的较大色谱柱。在实验开始前数小时内，将SEC色谱柱和磷酸盐缓冲液（PBS）恢复至室温，随后使用标准实验室支架和夹具将色谱柱固定于垂直位置。在连接SEC色谱柱之前，先让5毫升PBS流经滤芯进入废液容器，以润湿样品储液室。然后，拧开色谱柱的入口盖，在样品储液槽中加入 2 毫升 PBS，并在 PBS 通过烧结滤板滴出时，小心地将储液槽连接到色谱柱上。为平衡色谱柱，向样品储液槽中加入 47 毫升 PBS，随后打开 SEC 色谱柱底部的盖子。接着，使所有上样的缓冲液流经色谱柱，并弃去流出液。将两毫升样品加入样品储液室后，让样品完全进入层析柱，并收集穿流液。立即向样品储液室中加入体积为14.25毫升减去样品体积的PBS，使溶液流经层析柱，同时弃去相当于层析柱空体积的流出液。随后，将一个两毫升低吸附微量离心管置于SEC层析柱正下方，待两毫升PBS流经层析柱后，收集最初的穿流液，即第一组分。继续向样本储液池中加入两毫升 PBS，以收集后续每一份组分。将收集的组分在4摄氏度下短期保存，或在负80摄氏度下长期保存。对于所收集EV组分的无菌检测，取100微升待用组分接种于三毫升培养基中进行检测。然后，在最佳条件下培养培养基，并观察浑浊度至少三天。或者，可将组分样品接种于含有用于培养产菌细菌的培养基的琼脂平板上，随后检查菌落形成情况。接下来，将单个或混合组分的25%至50%转移至低蛋白结合管中，在-80摄氏度条件下保存，以避免冻融循环。代表性分析显示大肠杆菌MP1的细胞外囊泡（EVs）在层析早期组分中被洗脱出来。第1至第6组分含有最多的EVs，其平均直径小于100纳米。同时，后续组分中仅含有无EV的蛋白质及极少量EVs。通过透射电子显微镜确认了细胞外囊泡（EV）的富集情况及其大小，尤其在第2至第6组分中得到证实。观察发现，富含EV的第2至第7组分具有较高的纳米荧光素酶活性，但与后续组分相比，非EV相关的mCherry荧光信号极低。免疫胶体金标记证实了纳米荧光素酶在第2至第5组分中与EV相关联。通过从多种厌氧细菌的培养物中分离EVs，评估了该方案对其他细菌种类的适用性。观察发现，早期层析组分（组分一至四）富含直径小于100纳米的EVs。复杂的脑心浸液（BHI）中所含EV尺寸的颗粒占总EV产量的比例低于25%。使用能够处理细菌培养液起始体积的切向流过滤装置非常重要。该技术使我们能够获得足够的细胞外囊泡，以在复杂的动物模型中研究其生物学功能。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

从 大肠杆菌 和其他细菌中可扩展地分离和纯化细胞外囊泡

来源：Watson, D. C., et.al. 大肠杆菌及其他细菌来源细胞外囊泡的可扩展分离与纯化. J. Vis. Exp.

细菌外膜来源的胞外囊泡的分离与富集

来源：Watson, D. C., 等. 从大肠杆菌及其他细菌中可扩展地分离与纯化细胞外囊泡. J. Vis. Exp.

使用尺寸排阻色谱法分离细菌胞外囊泡

本视频展示了基于密度梯度超速离心的纯化方法，用于分离适合进行表征研究的细胞外囊泡亚群。...

细胞外囊泡亚群的纯化：利用密度梯度超速离心法纯化细胞外囊泡亚群的技术

在本视频中，我们演示一种技术——尺寸排阻色谱法，用于分离来源于细菌的异质性外膜囊泡（OMV）群体。这些囊泡为纳米级球形结构，可通过尺寸排阻色谱法根据其大小分离为大尺寸和小尺寸亚群。...

基于尺寸排阻色谱法分离细菌胞外囊泡：一种根据尺寸分离革兰氏阴性菌外膜囊泡异质群体的技术

尺寸排阻色谱法，细菌胞外囊泡，外膜囊泡，革兰氏阴性菌，囊泡分离，尺寸分离，纳米颗粒，生物分离技术

本视频演示了利用尺寸排阻色谱法（SEC）从结核分枝杆菌（Mycobacterium...

一种用于纯化分枝杆菌胞外囊泡的尺寸排阻色谱技术

本文介绍了一种用于制备、纯化和使用酶包封外膜囊泡（OMV）的实验方案，该囊泡可提高酶的稳定性，适用于多种不同应用。...

定向蛋白质包装至外膜囊泡中 大肠杆菌设计、生产与纯化

本方案通过结合细胞外囊泡（EV）沉淀、密度梯度超速离心和颗粒捕获技术，高效且高得率地将细胞外囊泡与病毒颗粒分离，从而实现简化的操作流程并降低起始样本体积需求，最终获得可重复的细胞外囊泡制备物，适用于所有细胞外囊泡相关研究。...

高产量细胞外囊泡与病毒分离纯化

细菌囊泡在致病过程中发挥重要作用，并具有广阔前景的生物技术应用价值。由于囊泡具有异质性，其分析和应用受到限制；因此，亟需一种简单且可重复的方法来分离不同大小的囊泡。本文中，我们展示了利用尺寸排阻色谱法分离由Aggregatibacter...

利用尺寸排阻色谱分析细菌外膜囊泡的异质性

本方案表明，可利用尺寸排阻色谱法从细胞培养条件培养基中有效分离出细胞外囊泡。...

利用尺寸排阻色谱法从细胞条件培养基中分离细胞外囊泡

本实验方案详细描述了一种用于在胞外膜结合囊泡内生产重组蛋白（包括通常不溶性蛋白或含二硫键蛋白）的细菌表达方法。该方法有望应用于应用生物技术、医学等多个广泛的科学研究领域。...

优化生产与分析重组蛋白填充囊泡的方法 E. coli

本研究描述了一种从人粪便中富集、分离和纯化细菌胞外囊泡（BEVs）的方法 通过...

利用密度梯度离心法从人粪便中分离和纯化细菌胞外囊泡

学习从大肠杆菌等细菌中可扩展地分离和纯化细胞外囊泡的方法。该方案采用过滤和尺寸排阻色谱技术，适用于大规模培养体系，为体内研究和细菌细胞外囊泡的治疗应用奠定基础。

可扩展的细胞外囊泡分离与纯化方法大肠杆菌及其他细菌

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