Name: 使用分子可视化免费软件对酶活性位点进行建模 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 37 s
Description: 学习使用iCn3D、Jmol、PyMOL和UCSF ChimeraX四种免费软件对葡萄糖激酶活性位点进行分子建模与可视化。本教程详细演示如何选择配体并显示五埃范围内的氨基酸残基和水分子。

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本工作的经费由美国国家科学基金会提供：
提升本科 STEM 教育资助项目（资助编号 #1712268）
本科生物学教育中的研究协调网络（资助编号 # 1920270）
我们感谢西菲尔德大学的 Karsten Theis 博士就 Jmol 问题进行的有益讨论。

作者声明，他们对本文所述研究不存在任何相关或重大的经济利益。

本方案概述了酶活性位点建模的十个步骤，并将其应用于四种常用的生物分子建模软件。该方案的关键步骤包括：识别活性位点中的配体，选择距活性位点5 Å以内的残基以界定活性位点区域，以及展示酶与活性位点配体之间的相互作用。区分与生物学功能相关的配体至关重要，因为这使用户能够确定5 Å范围内可能参与配体结合的氨基酸残基。最后，利用程序展示分子相互作用，使用户能够掌握理解促进结合的分子相互作用所必需的技能。
基于计算机的分子建模方法的一个局限性在于其对特定命令和语法的依赖性。尽管生物化学实验方案可能允许操作步骤中有微小变动，但基于计算机的研究若未严格遵循既定流程，则可能产生截然不同的最终结果。这一点在使用命令行界面时尤为重要，因为必须使用程序特定的语法才能获得预期输出，而标点符号或大小写的看似微不足道的更改都可能导致命令执行失败。每种程序通常都有相应的各种 Wiki 页面和用户手册，用户可在其中查找并排查命令行输入的问题；因此，用户应仔细关注命令语法的每一个细节。尽管大多数分子可视化程序都包含“撤销”命令，但由于界面复杂，“撤销”功能并不总能准确地逆转上一步操作。因此，建议经常保存当前工作状态，特别是对于新用户而言更为重要。
模型本身所使用的数据也可能带来进一步的局限性。尽管蛋白质数据库（Protein Data Bank）中的固有标准确保了一定程度的一致性，但分子可视化程序的使用者常常会在蛋白质的渲染图像中遇到意想不到的效果。首先，大多数结构是通过X射线晶体学确定的，该方法仅提供蛋白质的一个单一模型；然而，核磁共振（NMR）结构通常由多个模型组成，可逐个进行可视化。其次，通过晶体学或冷冻电子显微镜实验确定的结构可能包含某些无法明确其位置的原子，这些原子在蛋白质的某些表示形式中会呈现为缺口。蛋白质结构中的侧链可能存在多种构象，在以棍状模式显示时，会表现为从同一氨基酸主链上伸出的两组不同结构。甚至短段的主链也可能存在此类替代构象，有时配体在活性位点中也会以多种结合构象叠加存在。
对于晶体结构，已提交的三维坐标包含非对称单元的所有组分，这些信息足以重构蛋白质晶体的重复单元。有时，该结构所包含的蛋白质链可能多于蛋白质的生物学活性形式（例如，胎儿血红蛋白突变体，PDB ID: 4MQK）。相反，某些程序可能不会自动加载生物学活性单元中的全部蛋白链。例如，在ChimeraX、PyMOL和Jmol中使用本实验方案所述命令获取SARS-CoV-2主蛋白酶（PDB ID: 6Y2E）结构时，仅加载了生物学活性二聚体的一半（由两条蛋白链组成）。尽管对命令稍作修改即可加载完整的生物学活性二聚体，但对于建模软件的新手用户而言，这一操作可能并不直观。另一个可能出现的问题是活性位点或底物本身的识别。晶体学实验中使用了多种分子，这些分子可能被建模到最终结构中。例如，硫酸根分子可能结合在活性位点的磷酸结合位点，也可能结合在与催化机制无关的其他区域。这些分子可能妨碍对活性位点的正确识别，甚至可能使学生误认为它们参与了催化机制。
用户可能希望将此方法应用于其他活性位点或结合位点。在今后涉及新蛋白质活性位点分析的工作中，若要应用本实验方案，用户需要确定哪些结合的配体与蛋白质功能相关。某些配体并不参与蛋白质功能，而是实验所用溶剂或结晶条件的产物（例如 3FGU 模型中存在的钾离子）。关键配体应通过查阅原始文献来确认。通过实践，以及在适用的情况下掌握命令行语法，用户将能够将该方案应用于任意酶活性位点的建模，并对其选择的其他大分子进行建模。
鉴定和分析结合的底物与配体对于阐明分子机制以及基于结构的药物设计至关重要，这些研究已直接推动了包括获得性免疫缺陷综合征（艾滋病）和 COVID-19 在内的疾病治疗手段的进步47,48,49,50,51,52。尽管不同的分子可视化程序提供各具特色的界面和用户体验，但大多数程序具备相似的功能。在生物化学高年级学生中培养生物分子可视化能力至关重要，他们需要熟悉结构可视化及其图像生成工具4,20,53。这有助于学生超越教科书和期刊文章中二维图像的解读，更轻松地基于结构数据提出自己的科学假设54，从而为未来科研人员应对公共卫生问题、深化对生物化学过程的理解做好准备。
综上所述，本实验方案详细介绍了使用四种主流的免费大分子建模程序进行活性位点建模的方法。我们的社区 BioMolViz 采用与具体软件无关的生物分子建模教学方法。本文并未对各程序的功能进行批评或比较，尽管用户在试用不同程序后，可能会发现其中某一程序在某些大分子建模方面更符合个人偏好。我们邀请读者使用 BioMolViz 教学框架，该框架明确了本方案所涉及的基于生物分子可视化学习的学习目标与教学目的，并通过 BioMolViz 社区网站&#160;http://biomolviz.org 获取有关生物分子可视化教学与学习的更多资源。

理解分子世界的表征对于成为生物分子科学领域的专家至关重要1，因为对这些图像的解读是理解生物功能的关键2。学习者通常首先通过教科书中以二维形式呈现的细胞膜、细胞器、大分子等图像来接触大分子，但生物学的真实情况是，这些结构本质上是三维的，理解其性质需要能够可视化并从三维模型中提取信息的方法。
因此，高年级分子生命科学课程中生物分子可视化素养的培养已受到关注，多篇文章报道了教授和评估可视化技能的重要性及困难1,3,4,5,6,7,8,9。针对这些文章的回应是，课堂干预措施的数量有所增加，通常是在单一机构的一个学期内实施，利用分子可视化程序和模型来攻克难点概念2,10,11,12,13,14,15。此外，研究人员还致力于表征学生如何使用生物分子可视化程序和/或模型来学习特定主题16,17,18,19。我们所在的 BioMolViz 团队已提出一个框架，将可视化素养中的总体主题细分为学习目标和具体目标，以指导此类教学干预20,21，并组织培训工作坊，指导教师使用该框架进行逆向设计评估工具，以测量可视化素养技能22。
所有这些工作的核心都依赖于一项关键技能：利用生物分子可视化软件来操控大分子结构的能力。这些工具在不同的平台上独立开发，因此在操作和使用方式上可能各具特点。这就需要针对不同软件提供特定的操作说明，同时选择一款用户熟悉的软件对于持续应用至关重要。
除了掌握三维结构操作的基本技能（如旋转、选择和修改模型）之外，一个主要目标是构建蛋白质活性位点的模型。该过程有助于学习者深入理解生物分子可视化框架（BioMolViz Framework）所提出的三个核心主题：分子相互作用、配体/修饰以及结构与功能之间的关系20,21。
用于生物分子可视化的四种常用程序包括：Jmol/JSmol23、iCn3D24、PyMOL25 和 UCSF Chimera26,27。我们建议初次使用 Chimera 的用户采用 UCSF ChimeraX，这是 Chimera 分子可视化程序的下一代版本，也是目前官方支持的程序版本。
在本实验方案中，我们演示如何使用这四种程序中的每一种，对人葡萄糖激酶的活性位点进行建模，其中包含一个结合的底物类似物复合物（PDB 编号：3FGU），并展示测量结果以说明特定的结合相互作用28。该模型代表了酶的催化复合物。为了捕捉催化前状态的活性位点，将一种不可水解的 ATP 类似物结合到葡萄糖激酶的活性位点。这种磷氨酰磷酸腺苷酯（ANP）在此位置含有一个磷-氮键，取代了通常的磷-氧连接键。活性位点中还包含葡萄糖（模型中记为 BCG）和镁离子（记为 MG）。此外，结构中存在一个钾离子（K），来源于结晶过程中使用的氯化钾溶剂。该离子对生物学功能不具关键作用，且位于活性位点之外。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63170/63170fig01.jpg" /> 
图1：ATP/ANP 结构。 三磷酸腺苷（ATP）结构与磷氨酰基磷酸-腺苷酯（ANP）的比较。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63170/63170fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
该方案展示了如何筛选底物类似物复合物中结合的配体，并鉴定与结合复合物距离在5 Å以内的活性位点残基，从而识别出能够形成相关分子相互作用（包括疏水作用和范德华作用）的氨基酸和水分子。
最初调整显示方式，以卡通形式展示蛋白质的大部分结构，同时将活性位点的氨基酸残基以棍状形式显示，以呈现蛋白质的相关原子并突出分子相互作用。在每个程序的操作步骤3完成后，这些显示方式已被应用，蛋白质的视图在不同程序间保持相似（图2）。在操作流程结束时，隐藏蛋白质的卡通表示，以简化视图，突出活性位点。
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63170/63170fig02.jpg" /> 
图2：不同程序间的结构比较。 在执行“调整显示方式”步骤后（各方案的步骤2或步骤3），对程序中3FGU结构的比较。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63170/63170fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
活性位点的氨基酸和结合配体采用CPK着色法29,30。该着色方案可区分在线条、棍状、球棍和空间填充模型中显示的不同化学元素的原子。在CPK着色方案中，氢为白色，氮为蓝色，氧为红色，硫为黄色，磷为橙色。传统上，碳用黑色表示，但在现代应用中，碳的颜色可能有所不同。
在晶体结构中，氢原子不可见，尽管上述每种程序均能预测其位置。在大型大分子结构中添加氢原子可能会遮挡视图，因此本方案中不显示氢原子。因此，这些结构中的氢键将通过测量两个杂原子中心之间的距离（例如，氧到氧、氧到氮）来表示。
程序概述 
可下载的图形用户界面（GUI）：PyMOL（版本 2.4.1）、ChimeraX（版本 1.2.5）和 Jmol（版本 1.8.0_301）均为基于图形用户界面的分子建模工具。这三种界面均提供命令行以输入代码，同时许多相同的功能也可通过 GUI 中的菜单和按钮实现。这些程序命令行的一个共同特点是，用户可使用键盘上的上下箭头键加载并重新执行先前输入的命令。
基于网页的图形用户界面：iCn3D（I-see-in-3D）是一种基于 WebGL 的浏览器工具，用于在网页上交互式查看三维大分子结构和化学物质，无需安装独立应用程序。它不依赖命令行操作，但完整的网页版本提供可编辑的命令日志。JSmol 是 Jmol 的 JavaScript 或 HTML5 版本，可在网站或网页浏览器窗口中使用，其操作方式与 Jmol 非常相似。JSmol 可用于创建包含动画的在线教程。
Proteopedia31，32、Jmol 中的 FirstGlance33 以及位于密尔沃基工程学院生物分子建模中心的 JSmol 网络界面（JUDE）是基于 Jmol 的在线设计环境的典型示例34。Proteopedia 维基是一个教学工具，允许用户对大分子结构进行建模，并在网站内创建包含这些模型的页面35。该 Proteopedia 场景编写工具基于 JSmol 构建，集成了图形用户界面（GUI），并提供了 Jmol GUI 中所不具备的附加功能。
Jmol 和 iCn3D 基于 Java 编程语言；JSmol 使用 Java 或 HTML5，而 PyMOL 和 ChimeraX 基于 Python 编程语言。这些程序均可加载蛋白质数据库文件，此类文件可从 RCSB 蛋白质数据库根据一个四位字母数字组成的 PDB ID 下载36,37。最常见的文件类型是含有 .pdb 扩展名的蛋白质数据库（PDB）文件，以及含有 .cif 扩展名的晶体学信息文件（CIF 或 mmCIF）。CIF 已取代 PDB 成为蛋白质数据库的默认文件类型，但两种文件格式均可在这些程序中使用。使用 CIF 文件与 PDB 文件时，序列/结构的显示方式可能存在细微差异；然而，两种文件的功能相似，此处不再详细讨论这些差异。分子建模数据库（MMDB）是美国国家生物技术信息中心（NCBI）开发的产品，为蛋白质数据库结构的一个子集，其中关联了分类信息（例如生物学特征、保守的蛋白质结构域）38。iCn3D 是 NCBI 开发的工具，能够加载包含 MMDB 数据的 PDB 文件。
要查看模型，用户可从该结构对应的 Protein Data Bank 专用页面下载所需文件（例如，&#160;https://www.rcsb.org/structure/3FGU），然后使用程序中的下拉&#160;文件菜单打开该结构。所有程序也可通过界面直接加载结构文件，该方法在实验方案中有详细说明。
ChimeraX、Jmol 和 PyMOL 的图形用户界面各自包含一个或多个控制台窗口，可通过拖动角落调整其大小。iCn3D 和 JSmol 完全运行于网络浏览器中。使用 iCn3D 时，由于屏幕尺寸和分辨率的不同，用户可能需要在弹出窗口内滚动，以查看全部菜单项。
本文详述的实验方案提供了一种利用各程序展示酶活性位点的简便方法。需要注意的是，每个程序中的操作步骤均可通过多种方式执行。例如，在ChimeraX中，同一任务可通过下拉菜单、顶部工具栏或命令行来完成。建议希望深入了解某一特定程序的用户查阅这些程序提供的在线教程、使用手册和维基文档39,40,41,42,43,44,45,46。
现有这些程序的手册和教程将本方案中的各项内容作为独立的任务进行介绍。为了显示一个活性位点，用户必须从各种手册和教程中自行整合所需的各项操作。本文通过提供一个用于建模带有分子相互作用的标记活性位点的线性操作流程，补充了现有的教程资源，为用户提供了可用于活性位点建模的逻辑思路，该思路可进一步应用于其他模型和程序中。
<img alt="图 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63170/63170fig03.jpg" /> 
图 3：ChimeraX 图形用户界面。 ChimeraX 图形用户界面，标注了下拉菜单、工具栏、结构查看器和命令行。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63170/63170fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63170/63170fig04.jpg" /> 
图 4：iCn3D 图形用户界面。 iCn3D 图形用户界面，标注了下拉菜单、工具栏、结构查看器、命令日志、选择集弹出窗口以及序列和注释弹出菜单。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63170/63170fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63170/63170fig05.jpg" /> 
图5：Jmol 图形用户界面。 Jmol 图形用户界面，标注了下拉菜单、工具栏、结构查看器、弹出菜单以及控制台/命令行。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63170/63170fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63170/63170fig06.jpg" /> 
图6：PyMOL 图形用户界面。 PyMOL 图形用户界面，标注了下拉菜单、结构查看窗口、名称/对象面板、鼠标控制菜单以及命令行。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63170/63170fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>ChimeraX（版本 1.2.5）https://www.rbvi.ucsf.edu/chimerax/</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>计算机</td><td></td><td></td><td>任意</td></tr><tr><td>iCn3D（仅限网络版：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/icn3d/full.html）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Java（用于 Jmol）https://java.com/en/download/</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jmol（版本 1.8.0_301）http://jmol.sourceforge.net/</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>鼠标（可选）</td><td></td><td></td><td>任意</td></tr><tr><td>PyMOL（版本 2.4.1 - 教育版）：https://pymol.org/2 仅限教育用途版本：https://pymol.org/edu/?q=educational</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

使用分子可视化免费软件模拟酶活性位点

Modeling an Enzyme Active Site using Molecular Visualization Freeware

生物分子可视化技能对于理解生命科学中的关键概念至关重要，例如结构与功能的关系以及分子间的相互作用。多种程序允许学习者操作三维结构，生物分子建模能够促进主动学习、培养计算能力，并弥合二维教科书图像与生命真实三维结构之间的差距。该领域的一项关键技能是构建蛋白质活性位点模型，以展示大分子中能够与小分子（即配体）发生相互作用的部分，并呈现其结合相互作用方式。在本实验方案中，我们使用四种免费的大分子建模程序来描述这一过程：iCn3D、Jmol/JSmol、PyMOL 和 UCSF ChimeraX。本指南适用于希望学习特定程序基础操作的学生，也适用于将生物分子建模纳入课程教学的教师。该方案使用户能够使用某一特定可视化程序构建活性位点模型，或尝试多种可用的免费程序。本方案选用的人类葡萄糖激酶作为建模对象，它是己糖激酶的一种同工酶，可催化糖酵解的第一步反应。该酶结合了其一种底物以及一种非反应性底物类似物，使用户能够分析催化复合物中的相互作用。

每项程序成功执行后，将得到一个聚焦于活性位点的分子模型，其中活性位点的残基和配体以棍状形式显示，蛋白的卡通表示被隐藏，配体采用对比色方案呈现。相互作用的氨基酸残基应标示其残基编号，并用线条显示氢键和离子相互作用。这些特征的存在可通过模型的目视检查来确定。
为了便于进行此项检查，并帮助用户判断是否正确执行了实验方案的各个步骤，我们提供了动画图示，以展示每一步骤完成后结构的形态。对于 ChimeraX、iCn3D、Jmol 和 PyMOL，分别如图7-10所示。
图7：ChimeraX 实验方案输出结果。 该动画图示展示了 ChimeraX 实验方案的步骤1.1–1.8。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63170/Figure 7.mp4" target="_blank">请点击此处下载该图。</a>
图8：iCn3D 协议输出结果。 动态图示展示 iCn3D 协议的步骤 2.1–2.8。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63170/Figure 8.mp4" target="_blank">请点击此处下载该图。</a>
图9：Jmol 实验方案输出结果。 动态图示展示 Jmol 实验方案的步骤 3.1–3.8。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63170/Figure 9.mp4" target="_blank">请点击此处下载该图。</a>
图10：PyMOL 实验方案输出结果。 动态图示展示 PyMOL 实验方案的步骤 4.1–4.8。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63170/Figure 10.mp4" target="_blank">请点击此处下载该图。</a>
影响这些操作结果最常见的错误是选择不当，导致结构的一部分以不期望的渲染方式显示。这通常是由于在结构本身或显示菜单按钮上的误点击所致。一个次优结果的示例是，模型中包含活性位点之外的残基以棍状形式显示。用户可通过目视检查以棍状显示的残基，确认它们是否位于活性位点配体附近，从而初步判断是否发生了此类错误。评估显示的残基是否在活性位点配体5Å范围内的进阶方法是，使用各程序内置的测量工具，测量邻近配体与活性位点残基之间的距离。测量工具的使用超出了本文的范围；然而，我们鼓励感兴趣的用户查阅大量在线教程，深入了解此类分析的具体操作。
我们展示了一个由于在 PyMOL 中错误点击名称/对象面板而导致该实验方案执行不理想的特定示例。此错误会以棍状模型显示整个蛋白质，而不是仅用该表示方式显示活性位点，如图11所示。
<img alt="图11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63170/63170fig11.jpg" /> 
图11：阴性结果。 阴性结果的示例。在 PyMOL 中错误地选中了完整的卡通图并显示为棍状模型。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63170/63170fig11large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
为排除故障，用户需要先隐藏整个模型的棍状表示（在名称/对象面板中标记为 3FGU），然后仅对名为“active”的选定部分使用 PyMOL 中的隐藏和显示按钮/命令来显示其棍状表示。一旦用户能够为模型的不同部分创建合适的选定区域，并有效地显示或隐藏它们，从此类错误中恢复模型就相对简单了。尽管重新开始实验流程并再次逐步操作看似诱人，但我们鼓励用户不要拘泥于既定步骤，大胆对模型进行探索和尝试。根据我们的经验，通过解决显示错误的过程，有助于加深对建模软件的理解和掌握。
每个程序成功执行方案后的最终输出结果并列显示在图12中。视图采用相似的取向，以便用户比较不同程序所创建模型的外观。
<img alt="图 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63170/63170fig12.jpg" /> 
图 12：不同程序的最终结构对比。 对本方案结束时各程序生成的活性位点结构进行比较。A：ChimeraX，B：iCn3D，C：Jmol，D：PyMOL。PyMOL 的活性位点标签包含所有活性位点残基及配体，而其他程序的输出仅标注了形成氢键的侧链。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63170/63170fig12large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

生物分子建模中的一项关键技能是在蛋白质中显示和注释活性位点。本技术演示使用了四种流行的免费大分子可视化程序：iCn3D、Jmol、PyMOL 和 UCSF ChimeraX。

生物分子可视化技能对于理解生命科学中的关键概念至关重要，例如结构与功能之间的关系以及……

可视化生物大分子是生物科学领域学生和专业人员的一项关键技能。在本实验方案中，我们演示了如何利用四种免费的分子建模程序来构建葡萄糖激酶酶活性位点的模型。本教程重点介绍了每个程序操作流程中的多个步骤，包括选择结合配体，并利用这些配体显示五埃范围内的氨基酸残基和水分子。本论文的补充信息中为每个程序提供了专门的视频，详细展示了方案的各个步骤并加以进一步说明。该结构对应 PDBID. 3FGU，代表葡萄糖激酶的催化复合物。酶的活性位点结合了两个底物：β-D-葡萄糖（标识符为BGC）和一个镁离子（MG）。此外，该底物类似物——磷酸氨基磷酸腺苷酯（ANP）——也结合在葡萄糖激酶的活性位点上。这种不可水解的三磷酸腺苷（ATP）类似物ANP可阻止磷酸化反应的发生，从而捕获催化前的活性位点复合物。UCSF ChimeraX建模程序的界面包含下拉菜单、工具栏、结构查看器和命令行。我们从第1.4步开始本实验方案，选择距离在五个埃以内的残基以定义活性位点。要选择配体，请按住Control键和Shift键，然后依次点击三个配体中的任意原子或化学键。按下方向键“上”直至三个配体均被绿色光晕高亮显示。通过点击下拉菜单定义该选择以供将来使用，选择“定义选择器”，在选择器名称中输入“ligands”，然后点击确定。再次使用选择菜单，选择“区域”。将其切换为残基，并确保顶部的复选框已被选中。单击“确定”。注意，这些配体五埃范围内的卡通图部分将被高亮显示。要将侧链以棍状形式显示并展示活性位点的水分子，请使用“操作-原子-键”菜单来显示它们。或使用此处的按钮将其打开。要清除选择，请在空白区域任意位置点击。本实验方案的最终结果应是一个模型，其中蛋白质的活性位点和配体以棍状形式显示，并用对比色标注。关键的极性结合相互作用用虚线表示，并标注了部分参与接触的残基。iCn3D 界面包含下拉菜单、结构查看器和命令日志。此视图展示了选择集、序列以及注释的弹出菜单，这些菜单会在用户执行需要它们的命令时出现。我们从第2.4步开始本实验方案，选择距离在五个埃以内的残基以定义活性位点。要选择配体，请使用选择下拉菜单，点击3D中的“select”，并确保已勾选残基选项。在PC上按住alt键，或在Mac上按住option键，然后点击第一个配体。然后按住 Control 键并单击其余两个配体，将其添加到选中状态。使用下拉菜单保存选区：单击“选择”→“保存选区”，输入名称后点击“保存”。此时，“选择集”弹出菜单中将显示已选中的三个配体。现在选择配体五埃范围内的残基。使用下拉菜单按距离选择。在出现的弹出菜单中，通过在输入框中键入数值，将第二项“spear”更改为半径五埃，然后单击显示。然后通过点击右上角的 X 关闭窗口。点击下拉菜单，选择保存选区，以保存五埃的活性位点，并使用键盘输入名称，然后点击保存。现在创建一个将两个选集合并的新选择。这些选集可以在“选集”弹出菜单中进行合并。在 PC 上，按住 Ctrl 键并单击这两个选集；在 Mac 上，按住 Command 键并单击。再次点击下拉菜单，选择“保存选区”，输入新名称，然后点击保存。要显示相互作用（如氢键），请使用分析菜单并选择“相互作用”。此处我们仅关注氢键和盐桥。因此，我们将取消选中其余选项，选择三个配体，并针对第二组选择五埃范围内的残基。单击3D显示相互作用并关闭窗口。这会显示部分发生相互作用的残基，但不会显示完整的五埃活性位点。为了显示该区域，将再次使用“选择集合”菜单。单击五埃全模型，然后在下拉菜单中单击“样式”→“侧链”→“棍状”。要应用CPK着色，单击颜色下拉菜单并选择“原子”。本实验方案的最终结果应得到一个如下所示的模型，其中蛋白质的活性位点和配体以棍状显示，并采用对比色进行着色。重要的结合相互作用以虚线表示，且在实验步骤中创建的某个选择范围内所有残基均被标注。Jmol 界面包含下拉菜单、工具栏、结构查看器、弹出菜单以及包含命令行的 Jmol 控制台。我们从步骤 3.4 开始 Jmol 操作流程，选择距离在五个埃以内的残基以定义活性位点。Jmol 控制台是选择五个埃范围内残基的最佳方法。输入此命令以选择距离三种配体五个埃范围内的残基。共选中了 193 个原子，但这些原子并不代表完整的氨基酸残基。选择这些时，请使用输入的命令，在 group 和 selected 范围内选择，然后按 Enter 键。注意会出现额外的选择光环。要将这些残基显示为棍状模型，可右键单击以打开弹出菜单，将鼠标悬停在 style 上，再悬停在 scheme 上，然后单击 sticks。注意，此处仍有一些空白的晕圈，它们是活性位点中的水分子。为了仅选择这些水分子，我们可以重新执行此命令，然后对其进行修改。在控制台内单击，然后使用向上箭头键找到该命令，再按回车键重新执行。为了将水分子显示为原子形式，我们需要取消对配体和蛋白质的选择。我们将输入两条命令来完成此操作。我们的配体被视为杂合基团，但水也被视为其中之一。因此在此命令中，我们需要定义不移除水分子。按回车键，现在仅有水分子被选中。单击下拉显示菜单，将鼠标悬停在“atom”上，然后单击“20% of van der Waals radius”。绿色的镁离子仍以棍状形式显示。离子更常见的显示方式是球体。单击 Jmol 控制台，然后输入 select MG，接着输入 space fill 50%。链内的配体以相同颜色显示。为了区分彼此，重新着色配体是很有帮助的。在控制台中，我将执行一个多行命令，该命令是我从一份备忘单中复制粘贴的，相关内容在 Jmol 补充视频中有详细说明。本实验方案的结果应得到一个如下所示的模型，其中蛋白质的活性位点以棍状形式显示，配体以较柔和的颜色以棍状形式显示。黄色线条表示结合相互作用，各个残基可根据需要进行标注。PyMOL 界面包含下拉菜单、结构查看器、名称对象面板和鼠标控制菜单。该图中还标注了主命令行。我们从步骤 4.4 开始基本操作流程，选择距离在五个埃以内的残基以定义活性位点。要选择配体，请依次点击每一个。此时会弹出一个新的选择项，可通过点击 A 按钮对其进行重命名。使用键盘删除字母“sele”，然后输入“ligans”作为新名称。按回车键。我们可以使用此选区来定义其周围的区域。首先单击 A 按钮，然后选择菜单项“复制”。在此新选区 sel01 中，单击 A 并选择重命名菜单项。使用键盘删除现有字母，然后输入 active。此时仍选中我们的三个配体，因此需要再次使用 A 操作按钮对其进行修改。单击该按钮，选择“修改”并以五个埃为半径扩展选区。现在我们已捕获了五个埃范围内的配体和残基。“S”按钮中的“S”代表“显示”。单击此处可以不同方式显示该蛋白质。我们将此球棍模型显示为棍状。单击空白区域可清除选择。这已捕获了五埃范围内的氨基酸，但未包含水分子。我们可以再次复制该选择，然后将其修改为仅选择水分子。在操作 A 按钮中，选择复制。出现选择2。让我们将其重命名为活性水。这次我们将使用A按钮进行修改，并选择当前选中区域周围的原子。四个埃范围内的原子。此操作已选中水分子，但也包含了一些侧链原子。要进一步修改，请使用 A 按钮进行调整，并将选择范围限制为溶剂。现在我们可以看到只有水分子被点亮了。再次点击 A 按钮，我们可以应用一个预设。选择预设中的“球棍模型”，现在水分子将以球体形式显示。该实验方案的最终结果是一个模型，其配体中的活性位点以对比色的棒状形式显示。黄色虚线表示极性结合相互作用，各个残基则使用“名称对象”面板中创建的选择进行标注。若实验操作中出现错误，可能导致结果不理想。例如，整个蛋白质以棍状形式显示。为解决此问题，用户首先需要隐藏整个结构的棍状表示形式，然后仅对名为 active 的对象使用 S 按钮重新显示其棍状表示。此处并列展示了使用每种程序生成的模型。尽管酶的显示方式存在差异，但在四个模型中均可观察到相同的关键特征和相互作用。希望掌握包含命令行程序的用户需要学习如何应用和修改输入的命令。正如我在 Jmol 方案中提到的，一个有用的工具是命令速查表。它是一个包含常用代码的纯文本文件，可供参考。要成为高级用户，了解方案中哪些部分可以调整和修改是非常有帮助的。通过练习，这些方案可被应用于模拟任何感兴趣的酶活性位点。

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