Name: 通过布雷菲德菌素 A 注射液鉴定肾脏分泌蛋白的来源 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: 了解利用布雷菲德菌素A抑制蛋白分泌来鉴定肾脏损伤组织中细胞因子来源的方法。该技术通过免疫染色分析TGF-β等细胞因子在肾小管上皮细胞和间质细胞中的积累，为研究肾脏疾病发病机制提供有效工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

美国心脏协会（AHA）：Kensei Taguchi，20POST35200221；卫生与公共服务部 | 国立卫生研究院 | 国家糖尿病、消化与肾脏疾病研究所（NIDDK）：Craig Brooks，DK114809-01 DK121101-01。

所有动物实验均按照范德比尔特大学医学中心机构动物护理与使用委员会批准的动物使用方案进行。
1. 动物
<ol>
	<li>使用8至12周龄的雄性BALB/c小鼠（体重：约25 g）建立顺铂或马兜铃酸诱导的肾病模型。</li>
	<li>确保小鼠健康，无明显痛苦迹象，且无打斗造成的伤口。 
	注意：伤口，尤其是尾部伤口，可能干扰本方案的操作。选择BALB/c小鼠的原因是其尾静脉更易于观察，便于注射。本方案适用于其他小鼠品系，但不同品系间顺铂或马兜铃酸的给药剂量可能有所不同。</li>
</ol>
2. 顺铂注射
<ol>
	<li>将顺铂溶解于无菌生理盐水中，配制成终浓度为 1 mg/mL 的溶液。 
	注意：顺铂在室温下不会完全溶解，应在通风橱中操作。</li>
	<li>将顺铂溶液置于 37 °C 水浴中加热，并反复涡旋振荡，直至顺铂完全溶解。</li>
	<li>称量小鼠体重，并计算每只小鼠按 20 mg/kg 体重（bw）所需注射的顺铂溶液体积。</li>
	<li>使用聚维酮碘（7.5%）和乙醇（70%）棉签交替擦拭腹部皮肤进行消毒，每种棉签各擦拭 3 次。</li>
	<li>使用带 25 G 针头的胰岛素注射器，将顺铂溶液进行腹腔注射。</li>
	<li>注射后第 3 天进入第 4 部分操作。</li>
</ol>
3. 马兜铃酸（AA）注射
<ol>
	<li>将马兜铃酸-I 溶解于磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）中，终浓度为 0.5 mg/mL。 
	注意：马兜铃酸应在通风橱中操作。应使用马兜铃酸-I，因其是导致肾脏损伤的主要形式。</li>
	<li>将马兜铃酸溶液在 37 °C 水浴中预热，并反复涡旋至完全溶解。</li>
	<li>称量小鼠体重，并计算每千克体重注射 5 mg 的马兜铃酸溶液所需体积。</li>
	<li>使用聚维酮碘（7.5%）和酒精（70%）棉签对腹部皮肤消毒 3 次。</li>
	<li>使用带有 25 G 针头的胰岛素注射器，将马兜铃酸溶液腹腔注射。</li>
	<li>每隔一天注射一次马兜铃酸，共注射 3 次。</li>
	<li>末次注射后第 42 天，进入第 4 节操作。</li>
</ol>
4. BFA 溶液的配制
<ol>
	<li>将BFA溶解于二甲基亚砜中，配制成10 mg/mL的储存液。</li>
	<li>将储存液于-20 °C保存。</li>
	<li>用无菌PBS将BFA储存液稀释至终工作浓度为1.25 mg/mL 
	&#8203;注意：每次注射前应立即新鲜配制工作液。</li>
</ol>
5. BFA 尾静脉注射
<ol>
	<li>注射前，将笼子一半放在37 °C&#160;的加热垫上，一半悬空，持续10分钟，以确保小鼠体温升高，防止体温下降导致尾部血管收缩，从而影响注射效果。 
	注意：将笼子放置在加热垫上时，应使笼子一半在加热垫上，另一半不在。这样当小鼠感到过热时，可自行移动到笼子的另一侧，反之亦然。&#160;使用温控装置调节的&#160;37 °C加热垫是必要的，以避免造成热灼伤。</li>
	<li>使用市售的合适尺寸的固定装置固定小鼠。</li>
	<li>用聚维酮碘和酒精棉片对尾部进行三次消毒，方法如上所述。</li>
	<li>水平握住尾部，观察侧尾静脉（图1C）。 
	注意：&#160;使用市售的带有内置低温LED光源的尾静脉注射平台有助于更方便地定位尾静脉。也可使用其他光源，但需注意避免热灼伤。</li>
	<li>插入28 G针头，使针头和注射器保持与静脉平行，并朝向头部方向推进。</li>
	<li>注射200 µL的1.25 mg/mL BFA溶液（含0.25 mg BFA）。观察静脉逐渐变透明，血液被注射液取代，表明注射成功。</li>
	<li>拔出针头，并轻轻按压尾部直至出血停止。</li>
	<li>将小鼠放回笼中，并观察其是否有持续出血或其他不适症状。</li>
</ol>
6. 处死动物并收获肾脏
<ol>
	<li>注射布雷菲德菌素A（BFA）6小时后，使用过量异氟烷（5%异氟烷置于钟形罩内）对小鼠实施安乐死，随后进行颈椎脱位以确保死亡。 
	注意：选择6小时时间点是基于文献报道，其他器官经6小时BFA处理后，细胞内细胞因子已有足够积累，可通过免疫荧光染色进行可视化检测16。</li>
	<li>处死后立即通过腹正中切口暴露小鼠腹部。</li>
	<li>用镊子夹住胸骨以暴露心脏。使用剪刀从胸骨左右两侧剪开肋骨。操作时需小心避免划伤心脏或主要血管。剪开心包组织，使心脏脱离胸壁。&#160;</li>
	<li>通过心脏穿刺采集100–500 µL血液用于血尿素氮（BUN）检测。使用25 G针头连接1 mL胰岛素注射器采集血液。为防止凝血，每份样本中加入5 µL肝素溶液（100 mg溶于15 mL dH2O）。 
	注意：BUN检测至少需要20 μL血液；然而，安乐死后通过心脏穿刺最多可采集约500 μL&#160;血液，可用于其他检测。应尽可能采集更多血液。</li>
	<li>将血液样本置于冰上保存，直至按下方第7节操作采集肾脏。
	<ol>
		<li>以1,300 × g离心10分钟。</li>
		<li>轻柔分离血浆，并于-20 °C保存，待进行下方第17节BUN检测。或者，可将血浆样本保存用于肌酐检测。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 灌注并摘除肾脏
<ol>
	<li>使用20 mL注射器以2–4 mL/min的流速经左心室向小鼠灌注10–20 mL磷酸盐缓冲液（PBS），直至灌注液变澄清。</li>
	<li>用镊子夹住靠近乳头部位的肾动脉和肾静脉，于远离肾脏的一侧剪断血管，取出肾脏。</li>
	<li>用手或精细无菌镊子轻轻剥离并去除肾包膜。</li>
	<li>根据所用抗体的不同，继续进行第8节以制备固定石蜡包埋组织，或进行第10节以制备固定冷冻组织。 
	&#8203;注意：组织处理步骤需针对每种用于染色的抗体进行优化。</li>
</ol>
8. 用于TGF-β和PDGF-D染色的石蜡包埋组织
<ol>
	<li>将肾脏置于洁净的载玻片上，用新的剃须刀片水平横向切开，一分为二。取其中一半放入含有10 mL 4%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液中，在10 rpm转速的翻转摇床上固定24小时。 
	注意：切片无需使用整个肾脏。另一半肾脏可保存或用于其他检测。</li>
	<li>用70%乙醇替换PFA溶液。</li>
	<li>此时将肾脏半块&#160;送至实验平台进行组织处理及石蜡包埋，随后使用切片机将石蜡包埋的肾脏组织切成4–6 µm厚的切片，并贴附于预先清洁并带电荷的载玻片上17,18。 
	&#8203;注意：肾脏组织由范德堡大学医学中心转化病理学共享资源平台进行处理和石蜡包埋，并在室温下保存。</li>
</ol>
9. 脱蜡与复水
<ol>
	<li>将载玻片放入染色架中，并浸入含有D-柠檬烯的染色缸中5分钟，确保组织完全浸没。再用另一缸新鲜的D-柠檬烯重复此步骤。</li>
	<li>通过将载玻片依次浸入100%（两次）、95%、90%和70%的乙醇梯度溶液中进行再水化，每次5分钟。</li>
	<li>用流动的dH2O冲洗载玻片5分钟。</li>
	<li>将切片置于柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中，在压力锅内121 °C、15 psi条件下孵育45分钟，进行抗原修复。</li>
	<li>用流动的dH2O冲洗载玻片20分钟。</li>
	<li>继续进行第12节操作。</li>
</ol>
10. 结缔组织生长因子染色用冷冻组织的制备
<ol>
	<li>使用新的剃须刀片沿水平轴将肾脏切成两半。 
	注意：切片无需使用整个肾脏。其中一半可用于储存或其他检测。</li>
	<li>将半侧肾脏放入含有10 mL 0.5% 多聚甲醛（PFA）的15 mL离心管中，于4 °C、10 rpm转速下在旋转仪上固定2小时。</li>
	<li>倾去PFA溶液至专用废液容器中进行妥善处理，加入10 mL含0.1 M甘氨酸的PBS溶液，于4 °C、10 rpm转速下旋转1小时。</li>
	<li>倾去甘氨酸溶液，加入10 mL用PBS溶解的15%蔗糖溶液，将离心管置于旋转仪上，于4 °C、10 rpm转速下过夜。</li>
	<li>倾去15%蔗糖溶液，更换为10 mL用PBS溶解的30%蔗糖溶液，于4 °C、10 rpm转速下处理1小时。</li>
	<li>在包埋模具中加入适量最佳切割温度化合物（OCT），并将第10.5步中的半侧肾脏组织放入模具中，使肾脏的切面朝下。</li>
	<li>将含有半侧肾脏和OCT的模具小心地浸入液氮中进行冷冻。 
	注意：避免液氮直接接触OCT，以免产生气泡。使用液氮时必须佩戴适当的个人防护装备，如护目镜/面罩、低温手套和实验服。建议使用长约25 cm的长柄镊子将模具放入液氮中。</li>
	<li>待组织完全冻结后，将模具储存于-80 °C环境中。</li>
</ol>
11. 冷冻切片
<ol>
	<li>确保冷冻切片机温度为 -20 °C。</li>
	<li>将含有标本的OCT包埋模具置于冷冻切片机中，在 -20 °C 下保存 2 小时，以平衡温度。</li>
	<li>握住模具边缘的标签，从底部按压，取出模具。</li>
	<li>在样品头表面添加新鲜OCT，并将冷冻的组织块放置其上，确保组织面背离样品头。</li>
	<li>将样品头及组织块放置于冷冻台面上。</li>
	<li>在组织块上方放置带重物的散热块，以压平组织表面。不使用时应保持冷冻切片机盖子关闭，防止温度波动。</li>
	<li>待组织块与样品头之间的新鲜OCT完全冻结后，检查连接是否牢固。</li>
	<li>将样品头夹紧固定于冷冻切片机的切片装置上。</li>
	<li>开始切片，直至在组织块中可见组织。</li>
	<li>以 4–6 μm 厚度对肾组织进行切片，并将切片转移至室温预处理的带电荷载玻片上19。</li>
	<li>切片转移完成后，将载玻片储存于 -20 °C 至 -80 °C 环境中，直至染色前。在准备染色前不得使其解冻。</li>
	<li>染色前，从储存处取出载玻片，使其恢复至室温。切勿让切片干燥。</li>
	<li>待载玻片达到室温后，立即在室温下用PBS洗涤切片两次，每次5分钟，以去除OCT包埋剂。</li>
	<li>继续进行第12节操作。</li>
</ol>
12. 免疫荧光染色
<ol>
	<li>使用疏水屏障记号笔勾画组织切片的轮廓。组织与疏水屏障轮廓之间应保持至少 5 mm 的距离。</li>
	<li>在切片上加入 50 μL&#160;封闭缓冲液（含 3% 驴血清、0.1% Triton 的 1% 牛血清白蛋白/Tris 缓冲盐水（TBS）），于湿盒中室温孵育 1 小时。</li>
	<li>用 PBS 将一抗稀释至适当浓度。检测细胞因子时，使用 50 μL&#160;针对 TGF-β1（1:200）、PDGF-D（1:400）和 CTGF（1:200）的一抗溶液。标记肌成纤维细胞时，使用 50 μL&#160;与 Cy3 偶联的抗 α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）一抗溶液（1:200）。</li>
	<li>去除封闭液，将一抗加至切片上，确保液体不溢出圆形疏水轮廓，于 4 °C 湿盒中孵育过夜。若发生泄漏，需重新涂抹疏水屏障。</li>
	<li>用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>用 PBS 将相应的二抗稀释至 1:200。</li>
	<li>在湿盒中加入 50 μL&#160;二抗溶液，室温孵育 1 小时。</li>
	<li>用 PBS 洗涤 5 分钟。</li>
	<li>用含 Ca2+&#160;和 Mg2+ 的 PBS 将与荧光素偶联的莲藕四棱豆凝集素（LTL）稀释至 10 μg/mL。 
	注意：Ca2+ 和 Mg2+ 对 LTL 结合是必需的。</li>
	<li>在湿盒中加入 50 μL&#160;LTL 溶液，室温孵育 30 分钟。</li>
	<li>用含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS 洗涤 5 分钟。</li>
	<li>加入 50 μL&#160;4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，5 μg/mL 水溶液）染色 DNA/细胞核，室温孵育 5 分钟。</li>
	<li>在组织上滴加 20 μL&#160;抗荧光淬灭封片剂，缓慢盖上盖玻片。封片剂需静置 24 小时使其完全固化后再进行成像。 
	注意：凝集素结合信号可能随时间降解，导致信号减弱。建议在封片剂固化后尽快对凝集素染色样本进行成像。若观察到信号减弱，可在封片剂中添加 Ca2+ 和 Mg2+ 以维持染色效果。</li>
</ol>
13. 图像采集
<ol>
	<li>打开配备自动XY载物台的倒置显微镜（参见材料表）。</li>
	<li>选择20倍物镜。</li>
	<li>启动图像采集软件（参见材料表）。</li>
	<li>点击实时成像以打开实时预览窗口。</li>
	<li>找到组织切片，并确保其处于聚焦状态。</li>
	<li>点击采集菜单，然后选择扫描大图。</li>
	<li>在扫描大图窗口中，使用操纵杆将载物台移至组织切片最左侧，点击左箭头；依次对最上侧、最右侧和最下侧的组织区域重复此操作，以设定扫描范围。</li>
	<li>点击采集菜单。</li>
	<li>确保大图选项的复选框已勾选。
	<ol>
		<li>若需采集多通道图像，请点击光谱选项卡。</li>
		<li>依次点击每个通道，并设置曝光时间，使染色信号清晰可见，且图像任何区域均未饱和。 
		注意：同一实验组内的设置必须保持一致。不同样本间更改采集参数将导致结果不准确。</li>
		<li>对每个待采集的通道重复步骤9.2。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>点击扫描。</li>
</ol>
14. 图像分析
<ol>
	<li>打开图像采集软件。</li>
	<li>点击 文件 | 打开，并选择图像。</li>
	<li>在图像窗口上单击右键，选择多边形感兴趣区域（ROI）。</li>
	<li>使用手绘工具勾画ROI轮廓，圈选LTL阳性小管细胞或α-SMA阳性间质细胞。</li>
	<li>点击测量&#160;选项卡 | 阈值。</li>
	<li>通过调节滑块，设置阈值的上限和下限，使其位于阳性信号区域的两侧。</li>
	<li>点击ROI选项卡。</li>
	<li>点击导出图标以保存数值。使用电子表格软件计算阳性信号面积/ROI面积的百分比。</li>
</ol>
15. 替代方法：使用免费软件（ImageJ）进行图像分析
<ol>
	<li>打开 ImageJ。</li>
	<li>点击 文件 | 打开 以查看图像。</li>
	<li>点击 自由选择 工具。</li>
	<li>使用 自由绘制 工具勾画出 感兴趣区域（ROI），圈选 LTL 阳性小管细胞或 α-SMA 阳性间质细胞。</li>
	<li>点击 编辑 菜单，选择 清除外部。</li>
	<li>点击 分析，选择 测量，以确定 ROI 的面积。</li>
	<li>进入 图像 | 颜色 | 拆分通道。</li>
	<li>调整阈值的上限和下限，以检测阳性信号区域。</li>
	<li>点击 分析，选择 测量。</li>
	<li>保存数据。</li>
	<li>使用电子表格软件打开数据，并计算阳性信号区域与 ROI 面积的比值。</li>
</ol>
16. 可选：使用激光扫描共聚焦显微镜成像
注意：为了获得更高分辨率的图像以用于发表，扫描共聚焦显微镜可提供更清晰的肾脏组织图像并降低背景信号。
<ol>
	<li>打开激光扫描共聚焦显微镜（参见材料表）。</li>
	<li>选择40倍物镜&#160;（参见材料表）。</li>
	<li>点击定位选项卡，并通过调节焦距找到组织。</li>
	<li>进入采集选项卡，点击通道，并在针孔设置中选择1 AU。</li>
	<li>调节每个通道的激光增益强度，使阳性信号可见但不饱和。确保同一批实验样品的设置保持一致。</li>
	<li>点击拍摄并以所需格式保存图像。</li>
</ol>
17. 血浆尿素氮水平
<ol>
	<li>从 -20 °C 取出样品，并在冰上解冻。</li>
	<li>用 dH2O 按 1:10 的比例稀释血浆。</li>
	<li>对于每个样品，在 96 孔板中设置三个独立的重复反应。
	<ol>
		<li>对于样品加标准品孔，加入 5 µL 的 200 mg/dL 尿素和 20 µL 稀释后的血浆。</li>
		<li>对于仅样品孔，加入 5 µL dH2O 和 20 µL 稀释后的血浆。</li>
		<li>对于样品空白孔，加入 5 µL dH2O 和 20 µL 稀释后的血浆。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每份样品将 85 µL 试剂与 1 µL 脲酶混合，以配制工作液。</li>
	<li>向“样品加标准品”和“仅样品”孔中各加入 80 µL 工作液。</li>
	<li>向上述第 17.3 步中的“样品空白”孔加入 80 µL 试剂（不含脲酶）。</li>
	<li>轻轻敲击酶标板以混匀，并在室温下孵育 5 分钟。</li>
	<li>使用酶标仪读取 OD560 值。</li>
	<li>根据公式（1）计算尿素浓度，并使用公式（2）将其转换为 BUN。 
	Urea (mg/dL) = (仅样品 − 样品空白)/(标准品 − 仅样品) × (标准品/4) × (稀释倍数)&#160;（1） 
	BUN (mg/dL) = 尿素浓度 / 2.14 （2） 
	注：本检测测定的是血清中尿素（分子量：60）的含量；然而，BUN 仅指尿素中的氮含量（分子量：28）。因此，需使用校正系数 2.14（60/28）将尿素浓度转换为 BUN。</li>
</ol>

<ol><li>GBD Chronic Kidney Disease Collaboration. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+regional%2C+and+national+burden+of+kidney+disease%2C+1990-2017%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2017%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global, regional, and national burden of kidney disease, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017.</a> Lancet. 395 (10225), 709-733 (2020).</li>
<li>Canaud, G., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+arrest+and+the+evolution+of+chronic+kidney+disease+from+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrology+Dialysis+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Cell cycle arrest and the evolution of chronic kidney disease from acute kidney injury.</a> Nephrology Dialysis Transplantation. 30 (4), 575-583 (2015).</li>
<li>Chawla, L. S., Eggers, P. W., Star, R. A., Kimmel, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+kidney+injury+and+chronic+kidney+disease+as+interconnected+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Acute kidney injury and chronic kidney disease as interconnected syndromes.</a> New England Journal of Medicine. 371 (1), 58-66 (2014).</li>
<li>Berger, K., Moeller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+epithelial+repair+and+regeneration+after+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of epithelial repair and regeneration after acute kidney injury.</a> Seminars in Nephrology. 34 (4), 394-403 (2014).</li>
<li>Bonventre, J. V., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+pathophysiology+of+ischemic+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Cellular pathophysiology of ischemic acute kidney injury.</a> The Journal of clinical investigation. 121 (11), 4210-4221 (2011).</li>
<li>Kurts, C., Panzer, U., Anders, H. J., Rees, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+system+and+kidney+disease%3A+basic+concepts+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">The immune system and kidney disease: basic concepts and clinical implications.</a> Nature Reviews. Immunology. 13 (10), 738-753 (2013).</li>
<li>Panzer, U., Steinmetz, O. M., Stahl, R. A., Wolf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+diseases+and+chemokines%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Kidney diseases and chemokines.</a> Current Drug Targets. 7 (1), 65-80 (2006).</li>
<li>Commins, S. P., Borish, L., Steinke, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+messenger+molecules%3A+cytokines%2C+interferons%2C+and+chemokines%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunologic messenger molecules: cytokines, interferons, and chemokines.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (2), Suppl 2 53-72 (2010).</li>
<li>Jaber, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+gene+promoter+polymorphisms+and+mortality+in+acute+renal+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Cytokine gene promoter polymorphisms and mortality in acute renal failure.</a> Cytokine. 25 (5), 212-219 (2004).</li>
<li>Black, L. M., Lever, J. M., Agarwal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+inflammation+and+fibrosis%3A+A+double-edged+sword%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Renal inflammation and fibrosis: A double-edged sword.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 67 (9), 663-681 (2019).</li>
<li>van Kooten, C., Woltman, A. M., Daha, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+function+of+tubular+epithelial+cells%3A+the+functional+implications+of+CD40+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Immunological function of tubular epithelial cells: the functional implications of CD40 expression.</a> Experimental Nephrology. 8 (4-5), 203-207 (2000).</li>
<li>Canaud, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+G1+and+TASCC+regulate+kidney+epithelial+cell+G2-M+arrest+and+fibrotic+maladaptive+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cyclin G1 and TASCC regulate kidney epithelial cell G2-M arrest and fibrotic maladaptive repair.</a> Science Translational Medicine. 11 (476), (2019).</li>
<li>Burton, C. J., Combe, C., Walls, J., Harris, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+of+chemokines+and+cytokines+by+human+tubular+epithelial+cells+in+response+to+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrology%2C+Dialysis%2C+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Secretion of chemokines and cytokines by human tubular epithelial cells in response to proteins.</a> Nephrology, Dialysis, Transplantation. 14 (11), 2628-2633 (1999).</li>
<li>Ripley, C. R., Fant, J., Bienkowski, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brefeldin+A+inhibits+degradation+as+well+as+production+and+secretion+of+collagen+in+human+lung+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Brefeldin A inhibits degradation as well as production and secretion of collagen in human lung fibroblasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (5), 3677-3682 (1993).</li>
<li>Kovacs, S. B., Oh, C., Aachoui, Y., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+cytokine+production+by+flow+cytometry+using+brefeldin+A+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Evaluating cytokine production by flow cytometry using brefeldin A in mice.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100244(2021).</li>
<li>Fujiwara, T., Oda, K., Yokota, S., Takatsuki, A., Ikehara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brefeldin+A+causes+disassembly+of+the+Golgi+complex+and+accumulation+of+secretory+proteins+in+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Brefeldin A causes disassembly of the Golgi complex and accumulation of secretory proteins in the endoplasmic reticulum.</a> Journal of Biological Chemistry. 263 (34), 18545-18552 (1988).</li>
<li>Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+formalin-fixed%2C+paraffin+embedded+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 253-268 (2019).</li>
<li>Qin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cutting+and+floating+method+for+paraffin-embedded+tissue+for+sectioning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58288(2018).</li>
<li>Honvo-Houeto, E., Truchet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indirect+immunofluorescence+on+frozen+sections+of+mouse+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Indirect immunofluorescence on frozen sections of mouse mammary gland.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53179(2015).</li>
<li>Chung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+promotes+fibrosis+after+severe+acute+kidney+injury+by+enhancing+renal+macrophage+infiltration%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">TGF-β promotes fibrosis after severe acute kidney injury by enhancing renal macrophage infiltration.</a> JCI Insight. 3 (21), 123563(2018).</li>
<li>Meng, X. M., Nikolic-Paterson, D. J., Lan, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2%3A+the+master+regulator+of+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Nephrology%22%5BJournal%5D)">TGF-β: the master regulator of fibrosis.</a> Nature Reviews. Nephrology. 12 (6), 325-338 (2016).</li>
<li>Kok, H. M., Falke, L. L., Goldschmeding, R., Nguyen, T. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+CTGF%2C+EGF+and+PDGF+pathways+to+prevent+progression+of+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Targeting CTGF, EGF and PDGF pathways to prevent progression of kidney disease.</a> Nature Reviews. Nephrology. 10 (12), 700-711 (2014).</li>
<li>Engel, J. E., Williams, E., Williams, M. L., Bidwell, G. L., Chade, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+VEGF+%28vascular+endothelial+growth+factor%29+therapy+induces+long-term+renal+recovery+in+chronic+kidney+disease+via+macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Targeted VEGF (vascular endothelial growth factor) therapy induces long-term renal recovery in chronic kidney disease via macrophage polarization.</a> Hypertension. 74 (5), 1113-1123 (2019).</li>
<li>Liu, B. C., Tang, T. T., Lv, L. L., Lan, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+tubule+injury%3A+a+driving+force+toward+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Renal tubule injury: a driving force toward chronic kidney disease.</a> Kidney International. 93 (3), 568-579 (2018).</li>
<li>de Haij, S., Woltman, A. M., Bakker, A. C., Daha, M. R., van Kooten, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+inflammatory+mediators+by+renal+epithelial+cells+is+insensitive+to+glucocorticoids%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Production of inflammatory mediators by renal epithelial cells is insensitive to glucocorticoids.</a> British Journal of Pharmacology. 137 (2), 197-204 (2002).</li>
<li>Hong, S., Healy, H., Kassianos, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+renal+tubular+epithelial+cells+in+the+immunological+pathophysiology+of+lupus+nephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The emerging role of renal tubular epithelial cells in the immunological pathophysiology of lupus nephritis.</a> Frontiers in Immunology. 11, 578952(2020).</li>
<li>Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+bioinformatics+pipelines%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines.</a> Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).</li>
<li>See, P., Lum, J., Chen, J., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+sequencing+guide+for+immunologists%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">A single-cell sequencing guide for immunologists.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2425(2018).</li>
<li>Gewin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deleting+the+TGF-%CE%B2+receptor+attenuates+acute+proximal+tubule+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Deleting the TGF-β receptor attenuates acute proximal tubule injury.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (12), 2001-2011 (2012).</li>
<li>Nlandu-Khodo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+TGF-%CE%B2+and+%CE%B2-catenin+epithelial+crosstalk+exacerbates+CKD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Blocking TGF-β and β-catenin epithelial crosstalk exacerbates CKD.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (12), 3490-3503 (2017).</li>
<li>Brooks, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIM-1-%2FTIM-1-mediated+phagocytosis+links+ATG5-%2FULK1-dependent+clearance+of+apoptotic+cells+to+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">KIM-1-/TIM-1-mediated phagocytosis links ATG5-/ULK1-dependent clearance of apoptotic cells to antigen presentation.</a> EMBO Journal. 34 (19), 2441-2464 (2015).</li>
<li>Kishi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximal+tubule+ATR+regulates+DNA+repair+to+prevent+maladaptive+renal+injury+responses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Proximal tubule ATR regulates DNA repair to prevent maladaptive renal injury responses.</a> The Journal of Clinical Investigation. 129 (11), 4797-4816 (2019).</li>
<li>Yu, S. M., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+kidney+injury+and+maladaptive+tubular+repair+leading+to+renal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Nephrology+and+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Acute kidney injury and maladaptive tubular repair leading to renal fibrosis.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 29 (3), 310-318 (2020).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

已知肾小管上皮细胞通过分泌TGF-β、TNF-α、CTGF、PDGF、血管内皮生长因子以及许多其他蛋白质来调控急性肾损伤和慢性肾病20,21,22,23同样，肾小球、远端小管及其他肾脏上皮细胞，以及间质细胞，在损伤过程中会分泌这些和/或其他蛋白质24,25,26这些细胞类型在细胞因子分泌中的相对贡献难以阐明，因为细胞因子在产生后会迅速被分泌。尽管如此 原位 杂交及其他RNA染色技术可用于标记分泌蛋白的RNA，但这些技术难以与细胞类型特异性标志物或损伤标志物的染色相结合。相比之下，许多研究采用联合方法 体内 研究结果与 体外 在培养的肾细胞中进行的...

据估计，全球有&#62;10%的人口患有某种形式的肾脏疾病1。急性肾损伤（AKI）以发病迅速为特征，大多可治愈；然而，一次AKI发作可能使患者在日后发展为慢性肾病（CKD）2,3。与AKI不同，CKD的特点是进行性纤维化和肾功能持续恶化，最终导致需要肾脏替代治疗的终末期肾病。大多数肾脏损伤均以构成肾单位的特化上皮细胞（如足细胞或近端小管细胞）为靶点4,5。损伤发生后，存活的上皮细胞通过分泌细胞因子和其他蛋白质，协助协调修复反应。通过这种方式，存活细胞可调节免疫反应、引导细胞外基质重塑，并促进器官恢复。
细胞因子是一类小分子分泌蛋白，对多细胞生物体的成熟、生长及应答能力具有重要的调节作用6,7。它们作为不同类型细胞之间的信号信使发挥作用，包括免疫细胞和上皮细胞8。尽管传统认为细胞因子主要由免疫细胞分泌，但长期研究表明，肾脏上皮细胞和间质细胞也能分泌细胞因子，作为对其他肾脏常驻细胞（如小管细胞、间质细胞和免疫细胞）的信号分子9,10。其中，近端小管细胞（PTCs）在急性肾损伤（AKI）后的启动修复和恢复阶段发挥着重要作用11。然而，已知异常修复的PTCs会分泌促纤维化细胞因子，如转化生长因子-β（TGF-β）、血小板源性生长因子-D（PDGF-D）和结缔组织生长因子（CTGF），从而促进慢性肾脏病（CKD）的进展12。因此，肾脏上皮细胞通过分泌细胞因子来调节肾脏损伤过程。
尽管已知肾上皮细胞能够分泌细胞因子，但由于研究分泌蛋白存在技术难题，每种细胞类型的具体来源及其相对贡献仍难以确定13。流式细胞术是检测细胞因子的常用方法，但在受损肾脏尤其是高度纤维化的肾脏中实施该技术具有挑战性。利用细胞因子启动子驱动Cre重组酶的细胞因子报告小鼠常被用于鉴定表达特定细胞因子的细胞类型。然而，报告小鼠的应用受到多种限制，包括需要将报告小鼠与不同的基因敲除背景小鼠进行杂交、缺乏合适的报告系统，以及每次只能分析一种细胞因子。因此，有必要开发一种简单、通用且经济的技术，用于检测释放细胞因子的肾细胞。
我们假设，注射BFA（一种通过阻断内质网-高尔基体运输来抑制分泌的抑制剂） 体内 可实现对肾脏组织中分泌蛋白的染色（图1A，B如基于流式细胞术的检测所示14,15结合细胞类型特异性标记物，该技术可用于鉴定损伤肾脏中产生细胞因子的细胞来源及其相对贡献。与流式细胞术样本不同，固定组织可长期保存蛋白质和细胞结构，从而更深入地研究分泌细胞。为验证这一假设，采用急性肾损伤模型（顺铂）和慢性肾病模型（马兜铃酸肾病（AAN））诱导小鼠肾脏损伤，注射布雷菲德菌素A（BFA），并使用标准免疫荧光技术进行染色。

<table><tbody><tr><td>1 mL 胰岛素注射器</td><td>BD</td><td>329654</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 注射器</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 离心管</td><td>Fisher brand</td><td>05-408-138</td><td></td></tr><tr><td>20 mL 注射器</td><td>BD</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>25 G 针头</td><td>BD</td><td>305125</td><td></td></tr><tr><td>28 G 针头</td><td>BD</td><td>329424</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Corning</td><td>9017</td><td></td></tr><tr><td>马兜铃酸-I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9461</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-SMA 抗体（与 Cy3 偶联）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6198</td><td>RRID:AB_476856</td></tr><tr><td>冷冻切片机刀片</td><td>C.L. Sturkey. Inc</td><td>DT315R50</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 (BSA)</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>布雷菲德菌素 A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6542</td><td></td></tr><tr><td>顺铂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4394</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>791725</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>ZEISS</td><td>&amp;nbsp;LSM710</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜物镜</td><td>ZEISS</td><td>40x / 1.10 LD C-Apochromat WATER</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜软件</td><td>ZEISS</td><td>ZEN</td><td></td></tr><tr><td>柯普林瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-4</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Fisher brand</td><td>12545F</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica</td><td>CM1850</td><td></td></tr><tr><td>CTGF 抗体</td><td>Genetex</td><td>GTX124232</td><td>RRID:AB_11169640</td></tr><tr><td>Cy3-AffiniPure 驴抗兔 IgG (H+L)</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>711-165-152</td><td>RRID: AB_2307443</td></tr><tr><td>Cy5-AffiniPure 驴抗山羊 IgG (H+L)</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>705-175-147</td><td>RRID: AB_2340415</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜 (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>一次性包埋底模</td><td>Fisher brand</td><td>22-363-553</td><td></td></tr><tr><td>驴血清</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>VETUS</td><td>ESD-13</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Fisher brand</td><td>12007-0050</td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Kent scientific</td><td>DCT-20</td><td></td></tr><tr><td>肝素钠盐</td><td>ACROS organics</td><td>41121-0010</td><td>100mg/15ml dH2O</td></tr><tr><td>湿化室</td><td>Invitrogen</td><td>44040410</td><td>可用铝箔包裹的塑料盒替代湿化室。</td></tr><tr><td>胰岛素注射器</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>NIKON</td><td>Eclipse Ti-E2</td><td>免疫荧光</td></tr><tr><td>KIM-1 抗体</td><td>R &amp;amp; D</td><td>AF1817</td><td>RRID: AB_2116446</td></tr><tr><td>Lemozole (Histo-clear)</td><td>National diagnostics</td><td>HS-200</td><td></td></tr><tr><td>莲属四棱豆凝集素</td><td>Vector</td><td>FL-13212</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Fisher scientific</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>切片机</td><td>Reichert</td><td>Jung 820 II</td><td></td></tr><tr><td>单色 CMOS 相机</td><td>NIKON</td><td>&amp;nbsp;DS-Qi-2</td><td></td></tr><tr><td>小鼠手术器械包</td><td>Kent scientific</td><td>INSMOUSEKIT</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements</td><td>NIKON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>物镜</td><td>NIKON</td><td>Plan Apo 20x/0.75</td><td>与 Eclipse Ti-E2（倒置显微镜）连接的图像采集软件</td></tr><tr><td>OCT 包埋剂</td><td>Scigen</td><td>4586</td><td></td></tr><tr><td>防扩散笔</td><td>Vector</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>含钙镁的 PBS</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>不含钙镁的 PBS</td><td>&amp;nbsp;Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-D 抗体</td><td>Thermo-Fisher scientific</td><td>40-2100</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛 (PFA)</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>15710</td><td>RRID: AB_2533455</td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>Promega</td><td>GloMax&amp;reg; Discover Microplate Reader</td><td>4% PFA 由 16% PFA 在 PBS 中稀释而成。</td></tr><tr><td>聚维酮碘（贝塔碘）</td><td>Avrio Health L.P.</td><td>NDC 67618-151-17</td><td></td></tr><tr><td>高压锅</td><td>&amp;nbsp;Tristar 8</td><td>Qt. Power Cooker Plus</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Quantichrom 尿素（BUN）检测试剂盒 II</td><td>BioAssay Systems</td><td>DUR2-100</td><td></td></tr><tr><td>用于肾脏解剖的单刃剃须刀片（.009&quot;, 0.23 mm）</td><td>IDL tools</td><td>521013</td><td></td></tr><tr><td>载玻片烘片机</td><td>Lab Scientific Inc.,</td><td>XH-2001</td><td></td></tr><tr><td>软件</td><td>NIKON</td><td>NIS elements</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>RPI</td><td>S24060</td><td></td></tr><tr><td>TGF-b1 抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB4502954</td><td></td></tr><tr><td>Tris EDTA 缓冲液</td><td>Corning</td><td>46-009-CM</td><td>RRID: AB_10747473</td></tr><tr><td>二水合柠檬酸三钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBR6660V</td><td></td></tr><tr><td>二水合柠檬酸三钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBR6660V</td><td></td></tr><tr><td>吐温-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>白色带电载玻片，25 x 75 mm，磨边，蓝色磨砂</td><td>Globe Scientific</td><td>1358D</td><td></td></tr></tbody></table>

通过布雷菲德林a注射鉴定肾脏分泌蛋白的来源

Identification of the Source of Secreted Proteins in the Kidney by Brefeldin A Injection

慢性肾病（CKD）是美国十大主要死因之一。急性肾损伤（AKI）虽然通常可恢复，但会增加患者日后发展为CKD的风险。肾小管上皮细胞已被确认为AKI和CKD过程中关键的信号枢纽，这些细胞可通过分泌细胞因子及其他蛋白质来决定疾病的进展方向。尤其是在CKD中，多条证据表明，适应不良性修复的肾小管细胞通过分泌转化生长因子-β（TGF-β）、结缔组织生长因子（CTGF）及其他促纤维化细胞因子，驱动疾病的进展。然而，识别不同细胞类型中分泌蛋白的来源及其相对数量 体内 仍然具有挑战性。
本文介绍了一种利用布雷菲德菌素A（Brefeldin A, BFA）阻止细胞因子分泌的技术，从而能够使用标准免疫荧光方法对肾脏组织中的细胞因子进行染色。BFA可抑制内质网（ER）向高尔基体的转运过程，而该过程是细胞因子及其他蛋白质分泌所必需的。在急性肾损伤（AKI）的顺铂小鼠模型中，于处死前6小时注射BFA，可导致转化生长因子-β（TGF-β）、血小板源性生长因子（PDGF）和结缔组织生长因子（CTGF）在近端小管细胞（PTCs）内积聚；在慢性肾病（CKD）的马兜铃酸（AA）小鼠模型中，则可观察到TGF-β在&#160;近端小管细胞内的积聚。分析结果显示，与单独使用BFA+生理盐水、顺铂或AA相比，BFA+顺铂或BFA+AA处理组中TGF-β阳性信号显著增强。这些数据表明，BFA可用于鉴定产生特定细胞因子的细胞类型，并量化其所产生细胞因子的相对含量和/或不同类型。

为了研究小管上皮细胞在顺铂诱导的急性肾损伤（AKI）后产生细胞因子的作用，以20 mg/kg的浓度注射顺铂，并在注射顺铂后的第3天静脉注射0.25 mg的BFA。6小时后采集肾脏组织。将石蜡包埋的肾脏组织切片，并用TGF-β、PDGF-D和CTGF进行染色，这些是参与AKI组织修复的代表性细胞因子。如图2A所示，在存在BFA的情况下，经顺铂处理的肾脏中，用LTL标记的近端小管细胞（PTCs）内可见TGF-β+囊泡。而在未受损或未用BFA处理的肾脏中则未观察到TGF-β+囊泡。
定量分析显示，在顺铂诱导的急性肾损伤（AKI）中，经BFA处理后TGF-β1+区域增加（图2B）。与TGF-β相似，在顺铂诱导的AKI中，经BFA处理后PDGF-D+或CTGF+囊泡也发生积聚（图2C和<strong cla...

确定分泌细胞因子的细胞类型对于理解肾脏疾病的病理生物学机制至关重要。本文介绍一种利用分泌抑制剂布雷菲德菌素A（brefeldin A）和细胞类型特异性标记物，对肾上皮细胞或间质细胞产生的细胞因子进行定量染色的方法。

通过布雷菲德林A注射鉴定肾脏分泌蛋白的来源

慢性肾病（CKD）是美国十大主要死因之一。急性肾损伤（AKI）虽然通常可恢复，但会增加……

我们的技术能够识别受损肾脏中产生细胞因子的细胞来源及其相对贡献。利用布雷菲德菌素A（Brefeldin A）阻断蛋白质分泌，可使我们更深入地了解在实体器官中产生细胞因子的细胞，例如其细胞类型及细胞状态。我们的实验方案应易于适用于多种器官系统。由于布雷菲德菌素A是一种可穿透细胞膜的小分子，它应在大多数细胞类型中抑制分泌过程，从而实现对细胞因子及其他分泌蛋白的检测。尾骨注射是最具技术挑战性的步骤，因为小鼠的尾骨非常小。我们建议在实验动物上实施本方案之前，先对该步骤进行练习。[讲师] 首先将笼子一半放在加热垫上，一半不放，持续10分钟，以确保小鼠体温温暖。将小鼠放入固定装置后，使用聚维酮碘和酒精棉片对尾巴进行三次消毒。水平握住尾巴，观察侧尾静脉。然后插入28号针头，保持针头和注射器与静脉平行，并朝向头部方向推进。注射200微升浓度为1.25毫克/毫升的BFA溶液。随着注射液替代血液，静脉应变得透明。随后拔出针头，并轻轻按压尾巴直至出血停止。将小鼠放回笼中，并监测其是否出现额外出血或痛苦迹象。使用20毫升注射器，通过左心室以每分钟2至4毫升的流速灌注10至20毫升PBS，直至灌注液变澄清。握住靠近乳头部位的肾动脉和肾静脉，从远离肾脏的一侧切断血管，以取出肾脏。然后用手或用无菌精细镊子轻轻剥离并移除肾包膜。使用疏水性屏障标记笔，在组织切片周围绘制轮廓，确保组织与疏水性屏障轮廓之间至少保持5毫米的距离。随后，在切片上加入50微升封闭缓冲液，其中包含3%驴血清、0.1%吐温以及1%牛血清白蛋白的TBS溶液。在湿润室中室温孵育1小时。用PBS将一抗稀释至适当浓度。为检测细胞因子，将针对TGF-β1、PDGF-D或CTGF的抗体稀释于50微升PBS中。将Cy3标记的Anti-Alpha SMA一抗以1:200的比例加入一抗溶液中，用于标记肌成纤维细胞。移除封闭缓冲液，并将一抗溶液加至切片上，确保液体不会溢出圆形疏水性轮廓边界。在4°C湿润室中孵育过夜。从冰箱中取出湿润室，用PBS清洗载玻片三次，每次5分钟。接下来，用PBS将相应的二抗稀释至1:200。在湿润室中室温孵育样品，加入50微升二抗溶液，持续1小时。从湿润室中取出载玻片，用PBS清洗5分钟。将荧光素标记的刀豆四棱豆凝集素（lotus tetragonolobus lectin）溶于含钙和镁的PBS中，配制成10微克/毫升的溶液。然后在湿润室中室温孵育组织，加入50微升LTL溶液，持续30分钟。从湿润室中取出载玻片，用含钙和镁的PBS清洗5分钟。加入50微升DAPI溶液，在室温下孵育5分钟，以染色DNA细胞核。用PBS清洗一次。在组织上加入20微升抗荧光淬灭封片试剂，盖上盖玻片，并缓慢放置。等待24小时，待抗荧光淬灭试剂完全固化后再进行成像。打开配备自动XY载物台的倒置显微镜，选择20倍物镜。将载玻片置于显微镜载物台上，定位组织切片。然后打开图像采集软件，点击“Live”以打开实时预览窗口。找到组织切片，并确保其处于清晰对焦状态。点击“Acquire”菜单，选择“Scan Large Image”。使用操纵杆将载物台移动至组织切片最左侧，点击左箭头，设定扫描区域起点；依次对最上侧、最右侧和最下侧的组织边缘重复此操作。点击采集菜单，确保“Multi-channel Capture”复选框已被勾选。为采集多通道图像，点击“Lambda”标签页，逐一选择每个通道，并设置曝光时间，使染色信号清晰可见，同时避免图像任何部分过饱和。对所有待采集通道重复此步骤。然后点击“Scan”。打开图像采集软件，点击“File”，再点击“Open”并选择图像。在图像窗口中右键，选择“Polygonal ROI”。使用手绘工具勾勒感兴趣区域（ROI）。随后勾勒LTL阳性小管细胞或α-SMA阳性间质细胞区域。点击“Measurement”标签页，然后选择“Threshold”。通过调节滑块，设定阳性信号区域两侧的上下阈值界限。然后点击“ROI”标签页。最后点击导出图标，保存测量数值。使用电子表格软件计算各ROI区域内阳性信号面积所占百分比。[Presenter] 在顺铂或生理盐水给药后第3天，代表性图像显示了TGF beta阳性囊泡。在存在BFA的情况下，经顺铂处理的肾脏中，标记为LTL的PTC内可见TGF beta阳性囊泡。然而，在未受损或未经BFA处理的肾脏中未观察到这些囊泡。[讲师] 经BFA处理后，在顺铂诱导的急性肾损伤中，TGFβ阳性区域有所增加。与TGFβ类似，在顺铂诱导的急性肾损伤（AKI）中，经BFA处理后，PDGF-D阳性或CTGF阳性囊泡也出现积聚。定量分析显示，在LTL阳性的近端小管细胞中，PDGF-D阳性和CTGF阳性区域在BFA处理后也显著增加。在顺铂注射后第3天，BFA注射并未显著升高血浆BUN水平。在顺铂诱导的AKI合并BFA治疗的情况下，可在α-SMA标记的间质细胞中观察到TGFβ阳性囊泡。经修饰后的分析显示，在顺铂诱导的AKI中，BFA处理显著增加了α-SMA阳性区域内TGFβ阳性区域的面积。与TGFβ阳性囊泡类似，CTGF阳性囊泡在BFA处理后也有所增加。定量结果表明，在顺铂诱导的AKI中，BFA处理增强了CTGF阳性区域与α-SMA阳性区域的比值。与顺铂诱导的损伤相比，在马兜铃酸（AA）慢性期的近端小管细胞（PTCs）中，TGF-β阳性囊泡要小得多。在LTL阳性的PTCs中仅有极少的阳性染色。然而，在肾损伤分子1（KIM-1）阳性的PTCs中，TGFβ信号强度在BFA处理后有所增加。注射BFA后TGFβ的平均强度水平比未注射BFA时高出三倍。最关键的步骤是确保尾静脉注射成功。注射失败会影响实验结果。因此，请注意观察注射成功的迹象，例如静脉在注射后变得透明；同时请注意观察失败的迹象，例如尾巴部位出现肿胀。布雷菲德林A（Brefeldin A）注射可与多种检测方法联合使用，包括蛋白质印迹（western blot）或流式细胞术，以在器官或单细胞水平上评估细胞因子的产生。利用该技术，我们已能够鉴定出由肾上皮细胞分泌的新型细胞因子，而这些细胞因子此前被认为来源于其他细胞类型。该方法可用于解决关于特定细胞类型在损伤中作用的长期争议。

identification-source-secreted-proteins-kidney-brefeldin

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

通过布雷菲德菌素 A 注射液鉴定肾脏分泌蛋白的来源

一种利用高分辨率活体双光子显微镜直接观察和量化表层肾小球滤过功能的技术。该方法可直接测定大分子在正常和疾病状态下的通透性特征。...

使用双光子显微镜定量中国台湾慕尼黑维斯塔大鼠肾小球对荧光大分子的通透性

成年斑马鱼的肾脏是进行肾脏再生和疾病研究的优良体系。此类研究的一个关键方面是评估肾单位的结构和功能。本方案描述了多种可用于评估肾小管组成及肾重吸收功能的方法。...

成年斑马鱼肾脏肾单位组成与功能分析

组织工程化肾脏结构为解决器官短缺及透析带来的有害影响提供了一种方案。本文描述了一种从小鼠肾脏中显微解剖分离皮质-髓质节段的实验方案。这些节段被植入无支架的细胞结构中，形成肾脏类器官。...

原发性肾组织节段的显微解剖及其与新型无支架构建技术的整合

本方案描述了应在肾小球疾病小鼠模型中进行的完整肾脏检查。这些方法可对肾小球功能进行详细的功能性、结构性和机制性分析，适用于所有肾小球疾病的小鼠模型。...

肾小球疾病小鼠模型中肾功能的评估

本文介绍了一种利用生物素对小鼠肾小球细胞表面蛋白进行体内标记的实验方案。该方案包含小鼠肾脏灌注、肾小球分离以及目标蛋白内源性免疫沉淀的操作方法。...

肾小球的分离与 体内 肾小球细胞表面蛋白标记

本文介绍了一种使用高灵敏度、非放射性示踪剂检测小鼠肾小球通透性的实验方案。该方法可利用少量尿液样本进行多次重复的尿液分析。...

使用异硫氰酸荧光素-多聚蔗糖70对小鼠肾小球通透性进行高灵敏度测量

抗体标记、光学透明化与先进光学显微镜技术的结合，可实现对完整结构或器官的三维分析。本文介绍一种简便的方法，将厚肾组织切片的免疫标记、肉桂酸乙酯光学透明化处理以及共聚焦成像相结合，从而实现对肾脏三维结构的可视化观察与定量分析。...

免疫标记肾组织的光学透明化与成像

本实验方案描述了一种在小鼠中追踪狼疮进展的方法。另外提供了两种实验程序，用于通过肾脏中的细胞浸润和蛋白质沉积来表征狼疮性肾炎。...

狼疮易感型MRL/lpr小鼠蛋白尿、肾脏白细胞浸润及肾脏蛋白沉积的分析

本实验方案描述了膜性肾病（MN）动物模型的建立方法，以及康麦方抑制剂通过激活PI3K/AKT信号通路减轻MN大鼠足细胞凋亡的作用机制。...

基于PI3K/AKT信号通路探讨克蒙方抑制膜性肾病大鼠足细胞凋亡的机制

本方案描述了一种在小鼠中诱导单侧输尿管梗阻（UUO）的方法，用于研究梗阻性肾病中组织纤维化的进展。内容包括手术操作、术后护理以及纤维化评估方法。...

单侧输尿管梗阻模型用于研究肾间质纤维化

了解利用布雷菲德菌素A抑制蛋白分泌来鉴定肾脏损伤组织中细胞因子来源的方法。该技术通过免疫染色分析TGF-β等细胞因子在肾小管上皮细胞和间质细胞中的积累，为研究肾脏疾病发病机制提供有效工具。

通过布雷菲德林A注射鉴定肾脏分泌蛋白的来源

探索更多视频