通过布雷菲德林A注射鉴定肾脏分泌蛋白的来源

我们的技术能够识别受损肾脏中产生细胞因子的细胞来源及其相对贡献。利用布雷菲德菌素A（Brefeldin A）阻断蛋白质分泌，可使我们更深入地了解在实体器官中产生细胞因子的细胞，例如其细胞类型及细胞状态。

我们的实验方案应易于适用于多种器官系统。由于布雷菲德菌素A是一种可穿透细胞膜的小分子，它应在大多数细胞类型中抑制分泌过程，从而实现对细胞因子及其他分泌蛋白的检测。

尾骨注射是最具技术挑战性的步骤，因为小鼠的尾骨非常小。我们建议在实验动物上实施本方案之前，先对该步骤进行练习。

[讲师] 首先将笼子一半放在加热垫上，一半不放，持续10分钟，以确保小鼠体温温暖。将小鼠放入固定装置后，使用聚维酮碘和酒精棉片对尾巴进行三次消毒。水平握住尾巴，观察侧尾静脉。然后插入28号针头，保持针头和注射器与静脉平行，并朝向头部方向推进。注射200微升浓度为1.25毫克/毫升的BFA溶液。随着注射液替代血液，静脉应变得透明。随后拔出针头，并轻轻按压尾巴直至出血停止。将小鼠放回笼中，并监测其是否出现额外出血或痛苦迹象。使用20毫升注射器，通过左心室以每分钟2至4毫升的流速灌注10至20毫升PBS，直至灌注液变澄清。握住靠近乳头部位的肾动脉和肾静脉，从远离肾脏的一侧切断血管，以取出肾脏。然后用手或用无菌精细镊子轻轻剥离并移除肾包膜。使用疏水性屏障标记笔，在组织切片周围绘制轮廓，确保组织与疏水性屏障轮廓之间至少保持5毫米的距离。随后，在切片上加入50微升封闭缓冲液，其中包含3%驴血清、0.1%吐温以及1%牛血清白蛋白的TBS溶液。在湿润室中室温孵育1小时。用PBS将一抗稀释至适当浓度。为检测细胞因子，将针对TGF-β1、PDGF-D或CTGF的抗体稀释于50微升PBS中。将Cy3标记的Anti-Alpha SMA一抗以1:200的比例加入一抗溶液中，用于标记肌成纤维细胞。移除封闭缓冲液，并将一抗溶液加至切片上，确保液体不会溢出圆形疏水性轮廓边界。在4°C湿润室中孵育过夜。从冰箱中取出湿润室，用PBS清洗载玻片三次，每次5分钟。接下来，用PBS将相应的二抗稀释至1:200。在湿润室中室温孵育样品，加入50微升二抗溶液，持续1小时。从湿润室中取出载玻片，用PBS清洗5分钟。将荧光素标记的刀豆四棱豆凝集素（lotus tetragonolobus lectin）溶于含钙和镁的PBS中，配制成10微克/毫升的溶液。然后在湿润室中室温孵育组织，加入50微升LTL溶液，持续30分钟。从湿润室中取出载玻片，用含钙和镁的PBS清洗5分钟。加入50微升DAPI溶液，在室温下孵育5分钟，以染色DNA细胞核。用PBS清洗一次。在组织上加入20微升抗荧光淬灭封片试剂，盖上盖玻片，并缓慢放置。等待24小时，待抗荧光淬灭试剂完全固化后再进行成像。打开配备自动XY载物台的倒置显微镜，选择20倍物镜。将载玻片置于显微镜载物台上，定位组织切片。然后打开图像采集软件，点击“Live”以打开实时预览窗口。找到组织切片，并确保其处于清晰对焦状态。点击“Acquire”菜单，选择“Scan Large Image”。使用操纵杆将载物台移动至组织切片最左侧，点击左箭头，设定扫描区域起点；依次对最上侧、最右侧和最下侧的组织边缘重复此操作。点击采集菜单，确保“Multi-channel Capture”复选框已被勾选。为采集多通道图像，点击“Lambda”标签页，逐一选择每个通道，并设置曝光时间，使染色信号清晰可见，同时避免图像任何部分过饱和。对所有待采集通道重复此步骤。然后点击“Scan”。打开图像采集软件，点击“File”，再点击“Open”并选择图像。在图像窗口中右键，选择“Polygonal ROI”。使用手绘工具勾勒感兴趣区域（ROI）。随后勾勒LTL阳性小管细胞或α-SMA阳性间质细胞区域。点击“Measurement”标签页，然后选择“Threshold”。通过调节滑块，设定阳性信号区域两侧的上下阈值界限。然后点击“ROI”标签页。最后点击导出图标，保存测量数值。使用电子表格软件计算各ROI区域内阳性信号面积所占百分比。

[Presenter] 在顺铂或生理盐水给药后第3天，代表性图像显示了TGF beta阳性囊泡。在存在BFA的情况下，经顺铂处理的肾脏中，标记为LTL的PTC内可见TGF beta阳性囊泡。然而，在未受损或未经BFA处理的肾脏中未观察到这些囊泡。

[讲师] 经BFA处理后，在顺铂诱导的急性肾损伤中，TGFβ阳性区域有所增加。与TGFβ类似，在顺铂诱导的急性肾损伤（AKI）中，经BFA处理后，PDGF-D阳性或CTGF阳性囊泡也出现积聚。定量分析显示，在LTL阳性的近端小管细胞中，PDGF-D阳性和CTGF阳性区域在BFA处理后也显著增加。在顺铂注射后第3天，BFA注射并未显著升高血浆BUN水平。在顺铂诱导的AKI合并BFA治疗的情况下，可在α-SMA标记的间质细胞中观察到TGFβ阳性囊泡。经修饰后的分析显示，在顺铂诱导的AKI中，BFA处理显著增加了α-SMA阳性区域内TGFβ阳性区域的面积。与TGFβ阳性囊泡类似，CTGF阳性囊泡在BFA处理后也有所增加。定量结果表明，在顺铂诱导的AKI中，BFA处理增强了CTGF阳性区域与α-SMA阳性区域的比值。与顺铂诱导的损伤相比，在马兜铃酸（AA）慢性期的近端小管细胞（PTCs）中，TGF-β阳性囊泡要小得多。在LTL阳性的PTCs中仅有极少的阳性染色。然而，在肾损伤分子1（KIM-1）阳性的PTCs中，TGFβ信号强度在BFA处理后有所增加。注射BFA后TGFβ的平均强度水平比未注射BFA时高出三倍。

最关键的步骤是确保尾静脉注射成功。注射失败会影响实验结果。因此，请注意观察注射成功的迹象，例如静脉在注射后变得透明；同时请注意观察失败的迹象，例如尾巴部位出现肿胀。

布雷菲德林A（Brefeldin A）注射可与多种检测方法联合使用，包括蛋白质印迹（western blot）或流式细胞术，以在器官或单细胞水平上评估细胞因子的产生。

利用该技术，我们已能够鉴定出由肾上皮细胞分泌的新型细胞因子，而这些细胞因子此前被认为来源于其他细胞类型。该方法可用于解决关于特定细胞类型在损伤中作用的长期争议。