三种用于鉴定未知小种的接种技术对比 Fusarium oxysporum 小种 niveum 分离株

该方案可帮助西瓜研究领域的相关人员评估尖孢镰刀菌，从而确定存在的病原菌群体，并有效进行防控。尖孢镰刀菌的生理小种鉴定过程复杂且耗时，而本方案提供了三种可行的生理小种鉴定生物测定方法，用户可根据自身的实验条件选择最合适的方法。这三种方法均有助于植物健康从业者诊断特定分离株所引起的尖孢镰刀菌枯萎病的潜在严重程度。

这些信息有助于做出科学且有效的综合病害管理决策。开始种植准备时，将种植基质填入8x16孔育苗盘中，并轻压以压实土壤。然后将种子尖端朝上播种，深度与其长度相等。

播种后，用浮石粉覆盖含有埋藏种子的培养基，厚度为 0.3175 至 0.635 厘米，然后喷雾润湿培养基，避免产生积水或水洼。之后，在种子萌发前的五天内，每隔 180 分钟喷雾 20 秒，以保持培养基湿润。萌发后，每天浇水一次。

播种后第五天，将含有优选的尖孢镰刀菌（fusarium oxysporum）菌株、直径为1至1.25厘米的浸润滤纸片，放置于一块澄清的V8汁培养基和1/4浓度的马铃薯葡萄糖琼脂（QPDA）培养基平板上，在28°C培养箱中培养8天。第八天时，将V8和QPDA平板转移至生物安全柜中，用无菌细胞刮铲在培养基表面刮取分生孢子，收集液体分生孢子悬液至无菌的50毫升离心管中。随后，定量测定孢子浓度，并通过将约100万个孢子的计算体积转移至新的无菌离心管中，再用无菌去离子水定容至30毫升，制备最终的接种液。

为接种做准备，将已用10%次氯酸钠溶液消毒并充分冲洗过的6x12孔聚苯乙烯泡沫板放置妥当，用于盛放接种后的植株。接种前数小时，充分浇灌植株。浇水后两小时，将植株从8x16孔聚苯乙烯泡沫板中取出，并冲洗其根部。

然后，将冲洗后的植株暂时存放于装有自来水的洁净容器中，直至使用，注意保持不同品种彼此分离。随后，将幼苗每六个个体分为一组，并将各组幼苗用湿润的纸巾包裹后置于实验托盘上。在6×12孔聚苯乙烯泡沫育苗盘的每个孔底部放入25至30立方厘米的土壤，并用喷瓶向土壤喷水，直至其明显湿润。

首先取健康对照，将同一品种的六株无损伤幼苗放入含有接种物的50毫升离心管中。接种时，将幼苗管涡旋振荡30秒，使根部完全浸入接种液中。随后，将每株幼苗分别放入6×12孔聚苯乙烯泡沫育苗盘的每个孔中，同一品种的植株置于育苗盘的同一列内。

用培养基覆盖组培苗并轻轻压实。使用注射器吸取20毫升水润湿组培苗，注意避免溅洒。当所有组培苗均移栽完成后，将其置于密闭的黑暗环境中过夜，平均温度保持在27°C。

为了使籽粒感染，需先制备接种体：将尖孢镰刀菌西瓜专化型（fusarium oxysporum niveum）菌株在QPDA平板上分离并培养，直至菌丝生长覆盖平板约一半面积。制备籽粒时，向装有200克籽粒的1升玻璃锥形瓶中加入无菌自来水，水量需完全浸没籽粒，并高出籽粒至少5厘米。将锥形瓶中的籽粒在24°C条件下浸泡2小时后，倒掉瓶中水分，用包裹了纱布的一团棉絮塞住瓶口，再用铝箔纸包裹瓶口进行封盖。

将锥形瓶放入高压灭菌锅中，采用重力循环模式灭菌一小时，干燥五分钟，然后让锥形瓶冷却至室温。将谷物转移至带有过滤膜的蘑菇培养袋中。排出袋内空气，然后将多余的塑料部分折叠包裹起来。

将袋子放入一个耐高压的塑料容器中，并用铝箔包裹容器，然后使用与之前相同的设置再次进行高压灭菌。高压灭菌后，将真菌在袋中的籽粒上培养三周。使用无菌的4号打孔器从培养皿上活跃生长区域切取直径为6毫米的琼脂块。

采用严格的无菌技术展开袋子，放入五个琼脂小块。使用无菌的50毫升量筒量取35毫升无菌自来水，并加入袋中。用培养土填满一个塑料盆，然后将定量的培养土加入含有14粒带菌麦粒的大型塑料袋中。

在袋内制造一个空气垫，然后通过多次倒置袋子来混合籽粒与土壤，之后将袋口密封。完成后，用带菌土壤混合物填充经过表面灭菌的花盆。对每种剩余的西瓜品种重复此过程，每种待测菌株共制备四个装满带菌土壤的花盆。

接下来，将六粒西瓜种子播种在花盆中，种子的顶端朝上。使用喷雾瓶将表层0.3至0.6厘米的土壤喷湿，然后在每个花盆的底部和顶部各放置一个透明塑料皿。用经蒸汽巴氏消毒的沙子、泥炭和蛭石按4:1:1的比例混合后填满48孔育苗穴盘，并轻压穴盘以压实基质。

然后，将插入物放入塑料托盘中，并按照前述方法播种。在种植前7天，用浸润的滤纸接种5块QPDA平板，置于培养环境中，在14小时光照/10小时黑暗的光周期下培养8天。第7天时，将两个1平方厘米的琼脂块转移至每个含有100毫升马铃薯葡萄糖培养基的250毫升锥形瓶中，并将锥形瓶置于台式摇床中振荡培养。

接种当天，通过四层无菌纱布过滤接种液，收集孢子，以确定三角瓶中微分生孢子的浓度。播种后14天，将带有幼苗的细胞插件转移至网状托盘中，然后将装有幼苗的网状托盘放入盛有7升接种悬浮液的塑料箱中。接种液静置15分钟后，将含有已接种幼苗的细胞插件转移至无孔托盘中，并将无孔托盘置于温室苗床上，随后根据需要进行浇水。

保持光照和环境条件与根部浸染生物测定中先前所述一致。根据所采用的方法，通过观察并计算枯萎和植株死亡的发生率开始进行病情评级，并拍摄数码图像以记录病害发展进程。在改良的托盘浸染方法中，接种2号生理小种分离物的Black Diamond和Charleston Gray品种表现出严重症状并死亡。

相比之下，野生西瓜（Citrullus amarus）PI 品种表现出抗性。在根部浸染法中，接种 0 小种分离物的幼苗大多存活，而接种 3 小种分离物的幼苗几乎全部死亡。在带菌种粒法中，种植于接种 2 小种土壤中的 Sugar Baby 和 Charleston Gray 品种已开始出现萎蔫和死亡，而 Citrullus amarus PI 植株仍保持健康状态。

务必正确播种并妥善养护植物，检测病原菌分离物的活性，掌握每种接种方法的独特技术，并在评估病害症状时保持一致性。通过这些方法获得的结果，研究人员可借助测序和比较基因组学分析，探究不同分离物之间差异性基因表达的潜在遗传决定因素。利用这些方法，研究人员已能够评估不同毒力表型在不同地区的流行情况，并将这些表型与可观察的遗传元件进行比较。