Name: 用于确定未知 尖孢镰刀菌 f.sp的种族的三种接种技术的对比。 尼维姆 分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: 了解三种接种技术用于鉴定尖孢镰刀菌西瓜专化型生理小种的方法。根浸法、带菌种子法和改良托盘浸渍法均可有效诊断枯萎病严重程度，为西瓜种植者提供实用的病害管理方案。

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我们谨向阿里博士、植物分子诊断实验室以及佐治亚大学的季平生博士致以诚挚感谢，他们的领导与支持对建立我们的Fon项目起到了重要作用。

1. 采用根浸法（RDM）测定生理小种
<ol>
	<li>制备&#160;实验环境
	<ol>
		<li>由于症状表现高度依赖于环境条件，需将植物置于受控环境中培养。监测相对湿度、温度、光周期和光照强度（图1).
		<ol>
			<li>将温度设置为26-28 °C，相对湿度设置为50-75%，并设定16小时光周期，以确保植物充分生长和健康。 
			注意：为防止缺氧、幼苗萎蔫和/或种子腐烂，请勿过度浇水，也不要让幼苗周围积水。</li>
			<li>使用两根荧光灯管，每组灯管的光通量至少为1850流明，色温为2800 K，以支持光合作用生长。</li>
			<li>保持区域清洁，采用卫生操作规范，包括清除废土和植物残渣，以防止害虫侵害和偶然感染。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>种植条件
		<ol>
			<li>填充&#160;8个16格（25厘米宽 × 50厘米长）育苗盘，装入种植基质后轻轻压实，使土壤略微紧实（图2).</li>
			<li>获取四种鉴别品种的种子：Black Diamond/Sugar Baby、Charleston Grey/Allsweet/Dixielee、Calhoun Grey 和 PI-296341-FR。</li>
			<li>将种子播种，使其顶端（尖端）朝上，深度等于种子长度。播种后，用100%漂白土或其他膨润土类替代物覆盖含有埋入种子的培养基，覆盖厚度为0.3175–0.635 cm。</li>
			<li>将育苗盘喷雾润湿，使培养基质潮湿但不产生积水。此后，在种子萌发前约5天内，每隔180分钟喷雾20秒，或每天手动浇水一次，以保持基质湿润。萌发后，每天浇水一次，并根据需要补充水分，以促进幼苗生长。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>培养基制备 
		注意：两种培养基均添加额外的颗粒状琼脂以增强硬度，便于通过刮取表面收集孢子。
		<ol>
			<li>澄清V8果汁培养基（V8）
			<ol>
				<li>制备 500 mL 澄清V8汁培养基（V8）27 通过加入100 mL澄清的V8原味100%蔬菜汁和1% CaCO₃3 至400 mL蒸馏水中。</li>
				<li>加入7.5 g颗粒状琼脂。</li>
				<li>充分混合各成分，高压灭菌后冷却至50 °C，再倒入无菌培养皿中。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>四分之一强度马铃薯葡萄糖琼脂培养基（qPDA）
			<ol>
				<li>通过加入4.5 g颗粒状琼脂制备qPDA培养基&#160;向500 mL蒸馏水中加入3.8 g马铃薯葡萄糖琼脂。</li>
				<li>将成分充分混合，高压灭菌后冷却至 50 °C，再将 12–15 mL 倒入无菌培养皿中。</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实验处理的制备
	<ol>
		<li>制备接种物。
		<ol>
			<li>种植后第5天（dpp），将含有偏好物质的浸润滤纸片（直径1-1.25 cm）放置于目标位置 F. oxysporum 在一块V8培养基和一块qPDA培养基上分别分离，并置于培养箱中（约28 °C）培养八天28 (图3A).</li>
			<li>在真菌生长的第8天，即接种前一天（参见第1.3.2节），将V8和qPDA平板从培养箱转移至生物安全柜中。</li>
			<li>对于每个分离株，向每块 V8 和 qPDA 培养平板中加入 6 mL 灭菌去离子水。</li>
			<li>用无菌细胞刮铲在培养基表面轻轻刮擦以释放分生孢子（图3B）。合并液体分生孢子悬液，并转移至无菌50 mL培养管中（图3C).</li>
			<li>重复此过程，直至50 mL培养管中液体分生孢子悬液的总体积约为12 mL。</li>
			<li>在处理下一个分离物之前，用酒精对工作区域和涂布棒进行表面消毒。将涂布棒浸入浓度不低于70%的乙醇后，通过本生灯火焰灼烧以实现灭菌。</li>
			<li>将所有菌株的液体分生孢子悬浮液转移至培养管后，进行孢子计数。首先，将单个50 mL培养管中的悬浮液充分涡旋振荡，然后吸取10 µL加入血细胞计数板的每个计数室中。随后，按照前述方法计算血细胞计数板中的孢子数量。29.</li>
			<li>通过转移计算好的体积来制备最终接种液，以获得106 + 10% 转移至另一无菌培养管中，并加入无菌去离子水至总体积为 30 mL。</li>
			<li>将这些培养管在 8 ± 1 °C 条件下避光保存过夜。 
			注意：根据未发表的数据，此操作不会影响分生孢子的活力。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接种
	<ol>
		<li>准备接种。
		<ol>
			<li>接种前一天，将13日龄的幼苗充分浇水至土壤持水量。</li>
			<li>预先在标牌上标注相关信息，包括待测菌株、西瓜品种及接种日期。</li>
			<li>将6个12格（20 cm宽 × 40 cm长）聚苯乙烯泡沫育苗盘置于操作区域，这些育苗盘需事先用10%次氯酸钠溶液消毒并充分冲洗，用于放置接种后的植株。</li>
			<li>预先准备好所有所需材料（参见 材料表).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>接种植物根部。
		<ol>
			<li>在开始接种前数小时对植株充分浇水。浇水后至少2小时，将幼苗从8×16孔聚苯乙烯育苗盘中取出，冲洗根部以去除附着的种植基质颗粒。</li>
			<li>将冲洗后的植株暂时存放于装有自来水的洁净容器中，直至使用；存放时需将不同品种相互分开（图4A将幼苗每6株分为一组，用湿润的纸巾包裹后置于实验托盘中，以防止干燥。</li>
			<li>放置 25-30 cm3 在6×12孔聚苯乙烯培养盘的每个孔底部加入土壤，并使用喷瓶润湿土壤，直至其明显湿润。</li>
			<li>接种植物后，按照品种顺序重新栽种，依次为 Black Diamond、Charleston Grey、Calhoun Grey，然后&#160;PI 296341 01 FR 从左到右种植。</li>
			<li>从健康对照组开始，放置六只一组&#160;将相同品种的健康幼苗放入含有接种物的50 mL离心管中。对于健康对照组，使用自来水代替孢子悬浮液。最后用阳性对照（Fon 3号生理小种）对植株进行接种。</li>
			<li>进入管内后，确保植物根部接触到接种物（自来水）并暴露于其中。</li>
			<li>将试管涡旋震荡，使植株根部浸没其中，持续30秒（图4B）。涡旋振荡后，将单株小植株放入6 x 12孔聚苯乙烯育苗盘的每个孔中。同一品种的植株应放置在同一列中。</li>
			<li>放置后，将戴手套的手浸入含0.7%有效氯的溶液桶中消毒30秒，随后用自来水冲洗1分钟。</li>
			<li>随后，用栽培基质覆盖已放置的植株，并轻轻固定。使用注射器或移液器，每株植株小心加入20 mL水，避免溅出。</li>
			<li>在继续处理下一组植物之前，使用氯溶液和自来水冲洗手套，对戴着手套的双手进行再次消毒。</li>
			<li>所有小植株移栽后，再次少量浇水，以防止接种物流失。</li>
			<li>将植株在密闭、黑暗的环境中放置过夜，平均温度保持在 27 °C。次日将植株转移至温室中，维持平均温度为 27 °C。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接种植物的维护与护理
	<ol>
		<li>为防止多余的水溢出，每天少量浇水三次，持续4至5天，直至植株稳定。</li>
		<li>每天至少检查托盘2-3次，持续至少三天，以确保浇水充分且均匀。</li>
		<li>避免因阳光直射或遮荫导致的干燥，可通过旋转育苗盘和/或根据需要提供额外遮荫/浇水来实现。</li>
		<li>在播种后第3天，使用20-20-20速效肥料（10 g/3.78 L），按每升水3–6 mL的用量对植株进行施肥。</li>
		<li>授粉&#160;每周一次，持续3至4周。</li>
		<li>在整个步骤中保持相同的光照和环境条件。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 采用受害籽粒法（IKM）确定小种
<ol>
	<li>籽粒接种
	<ol>
		<li>制备接种物。
		<ol>
			<li>从保存的或新采集的样品中分离并培养一株感兴趣的 F. oxysporum f. sp. niveum 菌株，接种于 qPDA 平板上，使其菌丝生长覆盖平板约一半面积。 
			注意：这表明该菌株具有活性和可存活性，是后续步骤中有效侵染籽粒所必需的。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>准备籽粒。
		<ol>
			<li>使用天平，在足够大的容器中称取 200 g 黑麦（Secale spp.）浆果（或 Maxie 品种小麦（Triticum spp.）籽粒），倒入一个或多个 1 L 玻璃锥形瓶中。向锥形瓶中加入无菌自来水，完全浸没籽粒，水位至少高出籽粒 5 cm（图 5A）。</li>
			<li>在室温（约 24 °C）下浸泡籽粒 2 小时。倒掉水分，用包裹在纱布中的棉卷塞住瓶口，并用铝箔包裹瓶口（图 5B）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对籽粒进行去污染处理。待籽粒充分吸水后，采用两种不同的方式两次高压灭菌，以在接种前杀灭其他不需要的微生物。
		<ol>
			<li>第一次灭菌时，将已准备好的锥形瓶中的籽粒在重力循环条件下（121.2 °C，1.06 kg/cm2）高压灭菌 1 小时，干燥 5 分钟。待锥形瓶冷却至室温。</li>
			<li>第二次灭菌前，将籽粒转移至带有 0.5 µm 滤膜的小型食用菌培养袋中。排出袋内空气，然后将多余的塑料部分折叠包裹。</li>
			<li>将袋子放入一个塑料的、可耐受高压灭菌的容器中，并用铝箔包裹容器（图 5C）。 
			注意：在对袋中籽粒进行高压灭菌时，切勿使用金属容器，以免导致袋子熔化。</li>
			<li>在重力循环条件下再次高压灭菌 1 小时，干燥 5 分钟，循环参数与前次相同。 
			注意：袋子仅在第二次进行高压灭菌，而非第一次，因为若两次灭菌可能导致滤膜和接口受损。为防止滤膜上产生冷凝水，在从高压灭菌器中取出袋子前，应让其缓慢且完全冷却，因为若滤膜受潮会失去功能。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>接种籽粒。
		<ol>
			<li>在生物安全柜内操作，使用无菌的 4 号打孔器从培养平板上活跃生长区域切取直径为 6 mm 的琼脂块。打开培养袋，采用严格的无菌技术将 5 块琼脂块放入袋中。使用无菌的 50 mL 量筒量取 35 mL 无菌自来水，加入袋中。</li>
			<li>将袋口稍微卷起，然后用 70% 乙醇喷洒袋外表面以进行表面消毒。 
			注意：切勿喷洒滤膜，因为水分会破坏其功能。</li>
			<li>将袋口的角部向中心折叠，再在滤膜上方翻折两次以封闭袋口。使用厂家提供的夹子和透明乙烯基管固定袋口。 
			注意：夹子可重复使用。</li>
			<li>将袋子从生物安全柜中取出。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>储存病原菌以促进其生长。
		<ol>
			<li>将袋子直立存放。确保滤膜远离袋子的对侧，以实现最大程度的气体交换（图 5D）。</li>
			<li>在室温下培养约三周。定期翻动籽粒，以确保病原菌均匀生长。 
			注意：培养袋不可重复使用。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用带菌籽粒接种西瓜幼苗
	<ol>
		<li>按前述方法获取西瓜种子。</li>
		<li>确定实验分组。 
		注意：实验中所需的病原菌菌株仅为待鉴定生理小种的分离物。然而，设置阴性对照和阳性对照有助于与未感染或特定感染程度的植株进行比较。
		<ol>
			<li>制备阴性对照时，使用按前述方法灭菌但未接种的小麦籽粒。</li>
			<li>制备阳性对照时，使用已分类菌株接种的小麦籽粒，以便与未知分离物进行比较。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>混合土壤与籽粒。
		<ol>
			<li>将 14 粒带菌籽粒量入一个大塑料袋中（图 5E）。用塑料花盆（直径 15 cm，高 10 cm）装满育苗基质，以确定所需基质量，然后将基质倒入袋中。在袋内形成气垫后扭紧或密封袋口。</li>
			<li>通过多次翻转袋子混合籽粒与土壤。对于阴性对照，在另一个袋子中用洁净籽粒进行相同操作。对于阳性对照，在另一个袋子中用接种了比较菌株的籽粒进行相同操作。</li>
			<li>将四只表面灭菌的花盆装入带菌土壤混合物。处理任何被尖孢镰刀菌（Fon）污染的土壤前，先完成阴性对照组的装盆。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>播种西瓜种子。
		<ol>
			<li>每盆播种 6 粒种子。确保每盆仅包含同一品种的种子。将种子尖端朝上放置，以利于出苗时正常生长（图 6A）。</li>
			<li>使用喷雾瓶将土壤表层 0.3–0.6 cm 喷湿。在每盆底部和顶部各放置一个透明塑料皿（直径 15 cm），以创造利于种子萌发的湿润环境（图 6B）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>建立培养条件。
		<ol>
			<li>在种子萌发前（约 5 天），每天用喷雾瓶喷水三次，保持土壤紧实但无径流。 
			注意：所需水量将随植株和花盆尺寸增大而增加。</li>
			<li>种子萌发后，将顶部塑料皿移至花盆底部。</li>
			<li>根据需要每天浇水，以促进植株最佳生长。将植株置于 16 小时光照周期下，光照条件与前述一致，温度保持在 27 °C（± 1 °C）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 采用改良盘浸法（MTDM）测定品系
<ol>
	<li>接种材料的准备
	<ol>
		<li>建立种植条件。
		<ol>
			<li>将蒸汽巴氏消毒的沙子：泥炭：蛭石（4:1:1）混合基质填入48孔（3.68 cm 宽 × 5.98 cm 长 × 4.69 cm 深）育苗穴盘中，并轻压使基质略微压实。将穴盘放入塑料托盘（27.9 cm 宽 × 53.3 cm 长 × 5.1 cm 深）中。</li>
			<li>将种子尖端（近端）朝上播种，播种深度与种子长度相等。</li>
			<li>种子来源按先前所述方法获取。</li>
			<li>之后，通过每180分钟喷雾20秒或每天手动浇水一次，保持基质湿润。</li>
			<li>发芽后（约5天），每天浇水一次，并根据需要补充水分以支持幼苗生长。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>准备培养基。
		<ol>
			<li>通过将5.625 g颗粒状琼脂&#160;加入500 mL蒸馏水中制备qPDA培养基；再加入4.875 g马铃薯葡萄糖琼脂。充分混合各成分，高压灭菌后冷却至50 °C，然后倒入无菌培养皿中。用封口膜密封培养皿，并将平板储存于冰箱（4 °C）中备用。</li>
			<li>制备液体培养基时，称取24 g马铃薯葡萄糖并加入1 L锥形瓶中。加蒸馏水定容至1000 mL，将瓶子置于加热板上搅拌至完全溶解。将100 mL液体培养基分装至250 mL三角瓶中。用纱布封口后进行高压灭菌。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>准备接种物。
		<ol>
			<li>播种前7天，在五个qPDA平板上接种浸润过的滤纸28，并在培养环境中以14小时光照/10小时黑暗的光周期培养8天22。</li>
			<li>第7天，将两个1 cm2的琼脂块转移至每个含有100 mL马铃薯葡萄糖液体培养基的250 mL三角瓶中。将三角瓶置于摇床中，在14小时光照/10小时黑暗的光周期下，以200 rpm振荡培养7天。</li>
			<li>接种当天（播种后第14天），通过四层无菌纱布过滤接种液，收集孢子。</li>
			<li>使用血细胞计数板按先前所述方法测定三角瓶中的微分生孢子浓度。在塑料容器（40.6 cm 宽 × 67.3 cm 长 × 16.8 cm 深）中，将适量孢子悬液加入无菌水中，配制7 L接种液悬液，最终孢子浓度为1 × 106 mL−1（图7A）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接种
	<ol>
		<li>播种后14天&#160;（至少达到第一片真叶期），将带有幼苗的穴盘转移至带网托盘（26.9 cm 宽 × 53.7 cm 长 × 6.28 cm 深）。将装有幼苗的网状托盘轻轻放入盛有7 L接种液悬液的塑料容器中。每次接种一个托盘（图7B）。</li>
		<li>让幼苗在接种液中静置15分钟。15分钟后，将含有接种后幼苗的穴盘轻轻转移至无孔托盘（27.9 cm 宽 × 53.3 cm 长 × 5.1 cm 深）中。对每个托盘重复此操作。</li>
		<li>将无孔托盘放置于温室台面上，并根据需要浇水。维持与根浸生物测定所述相同的光照和环境条件。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 病害评级
<ol>
	<li>选择评级的时间间隔。
	<ol>
		<li>对于根浸法和改良托盘浸法，在接种植株后一周开始进行评级，并在此后每周进行一次，持续四周。 
		注意：在此期间，合并的数据集将包含五组观察数据。</li>
		<li>使用籽粒法时，仅在幼苗出土后开始评级，并每周进行一次，共进行六次评级。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>观察并计算发病率。
	<ol>
		<li>每次评级时，拍摄数码图像以记录病害发展情况。</li>
		<li>报告枯萎和植株死亡的发病率。通过将出现症状的植株数与健康对照组比较，并将死亡植株数占该品种总植株数的比例计算出发病率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析结果。比较不同品种之间以及实验组之间的感染模式，若设置了对照组，则应纳入比较。</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

已提出三种生理小种分型方法。每种方法均适用于特定的研究问题和实验条件。带菌籽粒接种法（土壤接种法）可能更为简单直接，特别适用于致病性评估30。使用该方法进行简单的生理小种分型非常有效。然而，在测定某一特定栽培品种抗性时，该方法的应用可能面临挑战，因为每株植物所经历的侵染程度或暴露水平可能不一致，而要测试目标栽培品种的抗性，通常需要达到相对均一且较高的病害水平。其原因在于，通过该方法产生的接种物难以准确定量，且具有活力的繁殖体比例，或到达根区的具侵染能力繁殖体数量均不易精确控制31。此外，该方法还受限于所播籽粒与根区之间距离的一致性。若籽粒距离根区过远，孢子可能无法萌发，或菌丝无法充分生长以抵达根部。
根浸法32,33 更为费力且耗时；然而，由于能够更准确地测量与植物相互作用的存活繁殖体数量，因此可以更精确地描述寄主抗性，有助于抗性筛选。此外，同一生理小种内毒力的差异也更容...

构成土传真菌的 Fusarium oxysporum 物种复合体（FOSC）是一类重要的半活体营养型植物病原菌，可在多种作物上引起严重病害并导致产量损失1西瓜枯萎病，由 F. oxysporum 专化型 niveum (Fon), 在过去的几十年里，其在全球范围内的波及范围、发生率和严重程度均有所上升2,3幼苗期， Fusarium 枯萎病的症状常与猝倒病相似。在较老的植株中，叶片逐渐变为灰白色、失绿并出现坏死。最终，植株萎蔫进一步发展为整株倒伏和死亡4直接产量损失由症状和植株死亡引起，而间接产量损失可能由于叶片冠层被破坏导致果实受阳光伤害而发生5. 有性生殖及其相关的生殖结构从未被观察到过 F. oxysporum 然而，该病原菌可产生两种无性孢子，即分生孢子和大分生孢子，以及一种较大的长期存活结构，称为厚垣孢子，可在土壤中存活多年6.
尖孢镰刀菌（FOSC）根据观察到的寄主范围被划分为不同的专化型，通常仅限于一种或少数几种寄主物种1。尽管近期研究表明，该物种复合体可能由15种不同的物种组成，但目前尚不清楚具体是哪些物种感染西瓜7。F. oxysporum f. sp. niveum（Fon）是指专门侵染Citrullus lanatus或栽培西瓜的菌株类群8,9。大多数致病性专化型内的F. oxysporum菌株在遗传组成及其对寄主物种的毒力方面表现出一定程度的多样性。例如，某一菌株可侵染某寄主的所有栽培品种，而另一菌株则仅侵染其中较敏感的品种。为了描述此类变异，这些菌株类群通常根据进化关系或共同的表型特征被非正式地划分为生理小种。在Fon中，已根据其对一组选定西瓜栽培品种的致病性划分为四个生理小种（0、1、2和3），其中生理小种3为近期发现10。
尽管表现出明显的多样性，但不同尖孢镰刀菌（Fon）生理小种之间的孢子或菌丝形态无法区分，因此需要借助分子或表型检测方法来确定分离物所属的独特生理小种11。分子研究表明，某些遗传差异已被发现。例如，木质部分泌蛋白（Secreted in Xylem, SIX）效应因子在尖孢镰刀菌（F. oxysporum）中的作用已被研究多年，其中一些效应因子位于水平基因转移过程中交换的染色体上12。例如，SIX6存在于Fon生理小种0和1中，但不存在于生理小种2中13。SIX效应因子已被证实参与尖孢镰刀菌番茄专化型（F. oxysporum f. sp. lycopersici）和尖孢镰刀菌香蕉专化型（F. oxysporum f. sp. cubense）的致病过程，这两种病原菌分别引起番茄和香蕉的镰刀菌枯萎病14,15,16,17。对引起菠菜镰刀菌枯萎病的尖孢镰刀菌菠菜专化型（F. oxysporum f. sp. spinaciae）菌株中SIX效应因子谱的分析，已实现了能够准确反映其遗传和表型多样性的分类18。然而，目前对不同Fon生理小种间致病机制的差异尚未完全阐明，基于这些机制开发的分子检测方法也表现出结果不一致且准确性不足的问题19。因此，目前通过接种试验获得的表型结果仍是对分离物进行分类的最佳方法。
F. oxysporum 最初通过根部侵染寄主，随后进入木质部并向上扩展20。因此，直接接种特定寄主品种的根部是进行生理小种分型的有效方法，也是根浸法和托盘浸根法的基础21。在未侵染寄主时，F. oxysporum 存在于土壤中，并可休眠多年。在来自目标田块的土壤中种植感病的西瓜品种，是检测Fon是否存在的一种方法。将该方法扩展至使用已知不同抗性水平的品种，并在人为接种Fon的土壤中进行种植，也是进行生理小种分型的有效手段（表1），并构成了接种菌核育苗法的基础。改良托盘浸根法是原始托盘浸根法的一种变体，可实现高通量的生理小种分型，能够快速检测大量植株和田间分离物22。快速且成功的生理小种分型生物测定的关键因素包括：选用对不同病原菌生理小种具有明确抗性差异的品种、确保接种物在侵染期间具有生物活性且数量充足、维持有利于病原菌和寄主生长的环境条件，以及采用统一的病害严重程度或发病率评级系统。本文基于上述原理，描述了根浸法23,24、接种菌核育苗法25,26和改良托盘浸根法22等用于表型生理小种分型的方法。

<table><tbody><tr><td>100% 弗勒土（Fuller&amp;rsquo;s Earth）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F200-5KG</td><td></td></tr><tr><td>1 L 玻璃锥形瓶（Erlenmeyer Flask）</td><td>PYREX</td><td>4980-1L</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管（falcon tubes）</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49B</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 量筒</td><td>Lab Safety Supply</td><td>41121805</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Eppendorf 圆底离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-413-921</td><td></td></tr><tr><td>铝箔纸</td><td>Reynolds Wrap</td><td>720</td><td></td></tr><tr><td>漂白剂</td><td>Walmart</td><td>587192290</td><td></td></tr><tr><td>本生灯</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-391-301</td><td></td></tr><tr><td>CaCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>sigma-Aldrich</td><td>239216</td><td></td></tr><tr><td>涂布棒（cell spreaders）</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-11</td><td></td></tr><tr><td>纱布</td><td>Lions Services, Inc</td><td>8305-01-125-0725</td><td></td></tr><tr><td>透明塑料培养皿</td><td>Visions Wave</td><td>999RP6CLSS</td><td>直径约 15 cm</td></tr><tr><td>用于蘑菇袋夹具的透明乙烯基软管</td><td>Shroom Supply</td><td></td><td>小袋用 6&quot;，中袋用 8&quot;，大袋用 10&quot;</td></tr><tr><td>棉球</td><td>Fisherbrand</td><td>22-456-885</td><td>无菌</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Fisher Chemical</td><td>A4094</td><td>100%，使用时与水混合配制成 70%</td></tr><tr><td>荧光灯管</td><td>MaxLume</td><td>Model T5</td><td>色温 2800 K，长度 24'' 或 48''</td></tr><tr><td>颗粒状琼脂</td><td>VWR International</td><td>90000-786</td><td></td></tr><tr><td>手持式喷雾瓶</td><td>Ability One</td><td>24122002</td><td>容量约 0.95 L</td></tr><tr><td>血细胞计数板（hemacytometer）</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-55A</td><td>双室血细胞计数板</td></tr><tr><td>实验托盘</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-236-2A</td><td></td></tr><tr><td>大号可密封塑料袋</td><td>Ziploc</td><td>430805</td><td>38 cm × 38 cm</td></tr><tr><td>喷雾器 / 浇水壶</td><td>Bar5F</td><td>B10H22</td><td></td></tr><tr><td>蘑菇袋夹具</td><td>Shroom Supply</td><td></td><td>小袋用 6&quot;，中袋用 8&quot;，大袋用 10&quot;</td></tr><tr><td>腈类手套</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-130-1597D</td><td></td></tr><tr><td>有机黑麦粒</td><td>Shroom Supply</td><td></td><td>0.5 加仑或 25 磅装袋</td></tr><tr><td>P1000 移液器及吸头</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-388-100</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（Petri dishes）</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875713</td><td>圆形，直径 100 mm，高 15 mm</td></tr><tr><td>种植基质</td><td>Jolly Gardener</td><td>Pro-Line C/B</td><td></td></tr><tr><td>塑料水壶</td><td>BrandTech</td><td>UX0600850</td><td>1 L 或更大</td></tr><tr><td>塑料种植盆</td><td>Neo/SCI</td><td>01-1177</td><td>直径约 15 cm，高约 10 cm</td></tr><tr><td>塑料耐高压灭菌容器</td><td>Thermo Scientific</td><td>UX0601022</td><td>3 L</td></tr><tr><td>四分之一强度马铃薯葡萄糖琼脂培养基</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX1420028</td><td>使用粉末并结合 QPDA 配方使用</td></tr><tr><td>科学天平（以克为单位称量）</td><td>Ohaus</td><td>30208458</td><td>任何可精确称量 200 g 的精密天平均可使用</td></tr><tr><td>4 号软木塞钻孔器</td><td>Cole-Parmer</td><td>NC9585352</td><td></td></tr><tr><td>小型蘑菇培养袋</td><td>Shroom Supply</td><td></td><td>带 0.5 微米过滤膜，也有中号和大号规格</td></tr><tr><td>园艺铲</td><td>Walmart</td><td>563876946</td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯育苗盘（6 × 12 孔）</td><td>Speedling</td><td>Model TR72A</td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯育苗盘（8 × 16 孔）</td><td>Speedling</td><td>Model TR128A</td><td></td></tr><tr><td>注射器（5 或 10 mL）</td><td>fisher Scientific</td><td>14-829-19C</td><td></td></tr><tr><td>计时器</td><td>Walmart</td><td>TM-01</td><td></td></tr><tr><td>100% 原味 V8 蔬菜汁</td><td>Walmart</td><td>564638212</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-418</td><td></td></tr><tr><td>西瓜种子 - 黑钻（Black Diamond）</td><td>Willhite Seed Inc</td><td>17</td><td></td></tr><tr><td>西瓜种子 - 卡尔霍恩灰（Calhoun Gray）</td><td>Holmes Seed Company</td><td>4440</td><td></td></tr><tr><td>西瓜种子 - 查尔斯顿灰（Charleston Gray）</td><td>Bonnie Plants</td><td>7.15339E+11</td><td></td></tr><tr><td>西瓜种子 - PI 296341-FR</td><td>联系作者</td><td>联系作者</td><td></td></tr><tr><td>小麦粒（Maxie 品种）（可选）</td><td>Alachua County Feed &amp;amp; Seed</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

三种用于鉴定未知小种的接种技术对比 fusarium oxysporum 小种 niveum 分离株

A Contrast of Three Inoculation Techniques used to Determine the Race of Unknown Fusarium oxysporum f.sp. niveum Isolates

由尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. niveum，简称 Fon）引起的西瓜枯萎病（Citrullus lanatus）近年来在美国东南部，尤其是佛罗里达州，重新成为西瓜生产的主要限制因素。实施综合病虫害管理策略（如种植特定生理小种抗性品种）需要了解田间病原菌的多样性及其种群密度。尽管在开发用于鉴定病原菌分离物的分子诊断工具方面已取得一定进展，但生理小种的鉴定通常仍需依赖生物测定方法。
通过根部浸蘸接种法、带菌种子接种法以及改良托盘浸蘸法，对四种西瓜鉴别寄主（Black Diamond、Charleston Grey、Calhoun Grey、Plant Introduction 296341-FR）进行生理小种分型。接种后五周，根据病害发生率计算结果，确定分离物的生理小种类型。若某一特定品种的植株发病比例低于33%，则归类为抗病；若发病比例高于33%，则视为感病。本文描述了三种用于确定生理小种的接种方法：根部浸蘸法、带菌种子法和改良托盘浸蘸法，其具体应用根据实验设计而有所不同。

这些实验有助于确定常见栽培品种的相对抗性（表1）。随后可利用这些信息，根据当地Fon菌群的分布情况制定相应的管理建议。换句话说，如果已知某商业种植田中存在0群或1群尖孢镰刀菌，农民可选择种植“抗性”品种，例如Calhoun Gray、Sunsugar或同类品种。采用所有方法进行的生物测定结果表明，当幼苗接种1群菌株后，Black Diamond和Charleston Grey品种死亡或表现出严重症状，而Calhoun Grey和PI品种则表现出抗性（表2和图8A）。
所有方法均表明，当幼苗接种3号生理小种菌株时，几乎所有品种的植株均死亡或表现出严重症状（图8B）。这些结果表明，利用两种接种方法进行的生物测定能够成功区分尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fon）的不同生理小种。对于所有方法而言，病害植株的表现应一致，唯一的差异在于品种在空间上的分组方式：在根部浸蘸法和改良干浸法中，不同品种按培养皿的列进行排列；...

防控西瓜枯萎病需要了解病原菌的生理小种组成。本文介绍了根浸法、带菌种子播种法和改良盘浸法三种接种方法，以验证其在尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. niveum，Fon）生理小种鉴定中的有效性。

三种用于鉴定未知小种的接种技术对比 Fusarium oxysporum 小种 niveum 分离株

西瓜（Citrullus lanatus）枯萎病，由尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. niveum，Fon）引起，近年来重新成为西瓜生产中的主要限制因素。

该方案可帮助西瓜研究领域的相关人员评估尖孢镰刀菌，从而确定存在的病原菌群体，并有效进行防控。尖孢镰刀菌的生理小种鉴定过程复杂且耗时，而本方案提供了三种可行的生理小种鉴定生物测定方法，用户可根据自身的实验条件选择最合适的方法。这三种方法均有助于植物健康从业者诊断特定分离株所引起的尖孢镰刀菌枯萎病的潜在严重程度。这些信息有助于做出科学且有效的综合病害管理决策。开始种植准备时，将种植基质填入8x16孔育苗盘中，并轻压以压实土壤。然后将种子尖端朝上播种，深度与其长度相等。播种后，用浮石粉覆盖含有埋藏种子的培养基，厚度为 0.3175 至 0.635 厘米，然后喷雾润湿培养基，避免产生积水或水洼。之后，在种子萌发前的五天内，每隔 180 分钟喷雾 20 秒，以保持培养基湿润。萌发后，每天浇水一次。播种后第五天，将含有优选的尖孢镰刀菌（fusarium oxysporum）菌株、直径为1至1.25厘米的浸润滤纸片，放置于一块澄清的V8汁培养基和1/4浓度的马铃薯葡萄糖琼脂（QPDA）培养基平板上，在28°C培养箱中培养8天。第八天时，将V8和QPDA平板转移至生物安全柜中，用无菌细胞刮铲在培养基表面刮取分生孢子，收集液体分生孢子悬液至无菌的50毫升离心管中。随后，定量测定孢子浓度，并通过将约100万个孢子的计算体积转移至新的无菌离心管中，再用无菌去离子水定容至30毫升，制备最终的接种液。为接种做准备，将已用10%次氯酸钠溶液消毒并充分冲洗过的6x12孔聚苯乙烯泡沫板放置妥当，用于盛放接种后的植株。接种前数小时，充分浇灌植株。浇水后两小时，将植株从8x16孔聚苯乙烯泡沫板中取出，并冲洗其根部。然后，将冲洗后的植株暂时存放于装有自来水的洁净容器中，直至使用，注意保持不同品种彼此分离。随后，将幼苗每六个个体分为一组，并将各组幼苗用湿润的纸巾包裹后置于实验托盘上。在6×12孔聚苯乙烯泡沫育苗盘的每个孔底部放入25至30立方厘米的土壤，并用喷瓶向土壤喷水，直至其明显湿润。首先取健康对照，将同一品种的六株无损伤幼苗放入含有接种物的50毫升离心管中。接种时，将幼苗管涡旋振荡30秒，使根部完全浸入接种液中。随后，将每株幼苗分别放入6×12孔聚苯乙烯泡沫育苗盘的每个孔中，同一品种的植株置于育苗盘的同一列内。用培养基覆盖组培苗并轻轻压实。使用注射器吸取20毫升水润湿组培苗，注意避免溅洒。当所有组培苗均移栽完成后，将其置于密闭的黑暗环境中过夜，平均温度保持在27°C。为了使籽粒感染，需先制备接种体：将尖孢镰刀菌西瓜专化型（fusarium oxysporum niveum）菌株在QPDA平板上分离并培养，直至菌丝生长覆盖平板约一半面积。制备籽粒时，向装有200克籽粒的1升玻璃锥形瓶中加入无菌自来水，水量需完全浸没籽粒，并高出籽粒至少5厘米。将锥形瓶中的籽粒在24°C条件下浸泡2小时后，倒掉瓶中水分，用包裹了纱布的一团棉絮塞住瓶口，再用铝箔纸包裹瓶口进行封盖。将锥形瓶放入高压灭菌锅中，采用重力循环模式灭菌一小时，干燥五分钟，然后让锥形瓶冷却至室温。将谷物转移至带有过滤膜的蘑菇培养袋中。排出袋内空气，然后将多余的塑料部分折叠包裹起来。将袋子放入一个耐高压的塑料容器中，并用铝箔包裹容器，然后使用与之前相同的设置再次进行高压灭菌。高压灭菌后，将真菌在袋中的籽粒上培养三周。使用无菌的4号打孔器从培养皿上活跃生长区域切取直径为6毫米的琼脂块。采用严格的无菌技术展开袋子，放入五个琼脂小块。使用无菌的50毫升量筒量取35毫升无菌自来水，并加入袋中。用培养土填满一个塑料盆，然后将定量的培养土加入含有14粒带菌麦粒的大型塑料袋中。在袋内制造一个空气垫，然后通过多次倒置袋子来混合籽粒与土壤，之后将袋口密封。完成后，用带菌土壤混合物填充经过表面灭菌的花盆。对每种剩余的西瓜品种重复此过程，每种待测菌株共制备四个装满带菌土壤的花盆。接下来，将六粒西瓜种子播种在花盆中，种子的顶端朝上。使用喷雾瓶将表层0.3至0.6厘米的土壤喷湿，然后在每个花盆的底部和顶部各放置一个透明塑料皿。用经蒸汽巴氏消毒的沙子、泥炭和蛭石按4:1:1的比例混合后填满48孔育苗穴盘，并轻压穴盘以压实基质。然后，将插入物放入塑料托盘中，并按照前述方法播种。在种植前7天，用浸润的滤纸接种5块QPDA平板，置于培养环境中，在14小时光照/10小时黑暗的光周期下培养8天。第7天时，将两个1平方厘米的琼脂块转移至每个含有100毫升马铃薯葡萄糖培养基的250毫升锥形瓶中，并将锥形瓶置于台式摇床中振荡培养。接种当天，通过四层无菌纱布过滤接种液，收集孢子，以确定三角瓶中微分生孢子的浓度。播种后14天，将带有幼苗的细胞插件转移至网状托盘中，然后将装有幼苗的网状托盘放入盛有7升接种悬浮液的塑料箱中。接种液静置15分钟后，将含有已接种幼苗的细胞插件转移至无孔托盘中，并将无孔托盘置于温室苗床上，随后根据需要进行浇水。保持光照和环境条件与根部浸染生物测定中先前所述一致。根据所采用的方法，通过观察并计算枯萎和植株死亡的发生率开始进行病情评级，并拍摄数码图像以记录病害发展进程。在改良的托盘浸染方法中，接种2号生理小种分离物的Black Diamond和Charleston Gray品种表现出严重症状并死亡。相比之下，野生西瓜（Citrullus amarus）PI 品种表现出抗性。在根部浸染法中，接种 0 小种分离物的幼苗大多存活，而接种 3 小种分离物的幼苗几乎全部死亡。在带菌种粒法中，种植于接种 2 小种土壤中的 Sugar Baby 和 Charleston Gray 品种已开始出现萎蔫和死亡，而 Citrullus amarus PI 植株仍保持健康状态。务必正确播种并妥善养护植物，检测病原菌分离物的活性，掌握每种接种方法的独特技术，并在评估病害症状时保持一致性。通过这些方法获得的结果，研究人员可借助测序和比较基因组学分析，探究不同分离物之间差异性基因表达的潜在遗传决定因素。利用这些方法，研究人员已能够评估不同毒力表型在不同地区的流行情况，并将这些表型与可观察的遗传元件进行比较。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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本文介绍了一种利用针头注射法将专性寄生真菌病原体Ustilago maydis接种于玉米和类蜀黍植物的方法。针头注射接种法可将真菌病原体精确地递送至植物叶片之间，病原菌在此处通过形成附着胞侵入植物体内。该方法效率高，能够实现U.

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从热带土壤样品中分离昆虫病原真菌菌落 Tenebrio 诱饵， 大蜡螟 诱饵，以及选择性人工培养基，即.添加氯霉素、噻苯咪唑和环己酰亚胺的酵母提取物增强马铃薯葡萄糖琼脂（CTC...

土壤样品中昆虫病原真菌分离方法的比较

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接种策略以感染植物根部的土传微生物

本实验方案旨在提供收集、固定和保存菌异养植物样品的详细步骤，并应用多种显微技术（如扫描电镜、透射电镜、光学显微镜、共聚焦显微镜和荧光显微镜），以研究菌根真菌在植物组织及经菌根真菌接种萌发的种子中的定殖情况。...

用于解读菌根异养植物组织中真菌定植及种子共生萌发的显微技术

本文旨在提供详细的实验方案，用于分离植物相关内生真菌、长期保存分离物、形态学表征，以及提取总DNA，以用于后续的分子鉴定和宏基因组分析。...

分离、鉴定及全基因组DNA提取以鉴定菌根异养植物中的内生真菌

本方案介绍了一种结合重组酶聚合酶扩增与CRISPR/Cas12a检测技术的方法，用于检测侵入性植物病原菌Fusarium oxysporum f. sp. cubense...

联合重组酶聚合酶扩增与CRISPR/Cas12a检测法用于检测 Fusarium oxysporum 专化型 cubense 热带4号小种

了解三种接种技术用于鉴定尖孢镰刀菌西瓜专化型生理小种的方法。根浸法、带菌种子法和改良托盘浸渍法均可有效诊断枯萎病严重程度，为西瓜种植者提供实用的病害管理方案。

三种用于鉴定未知小种的接种技术对比 Fusarium oxysporum 小种 niveum 分离株

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