Name: 用核磁共振波谱探索精氨酸甲基组 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: 探索利用核磁共振波谱技术定量分析精氨酸甲基化水平的方法，适用于细胞、组织和生物体液等多种生物样本。该方案为癌症研究和患者风险评估提供了可靠的生物标志物检测手段。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作得到了奥地利科学基金（FWF）项目 P28854、I3792、doc.funds BioMolStruct DOC 130、DK-MCD W1226 BioTechMed-Graz（旗舰项目 DYNIMO）、奥地利研究促进署（FFG）项目 864690 和 870454、格拉茨综合代谢研究中心、奥地利2016/2017年基础设施计划、施蒂利亚州政府（Zukunftsfonds）以及福建医科大学高层次人才启动基金（XRCZX2021020）的资助。我们感谢医学研究中心提供细胞培养设施的使用权限。F.Z. 在格拉茨医科大学分子医学博士项目框架内接受了培训。Q.Z. 在格拉茨医科大学代谢与心血管疾病博士项目框架内接受了培训。

本研究以酵母蛋白水解物作为样品。整个实验流程详见图1。
1. 材料与试剂的准备
<ol>
	<li>甲醇/水：将两份99%的甲醇（MeOH）与一份H2O混合，配制成甲醇/水溶液（记为MeOH/H2O）。将纯甲醇和MeOH/H2O储存于-20 °C，以减少醇类挥发并提高样品稳定性。</li>
	<li>盐酸（HCl）：用浓盐酸（12.0 mol/L 或 37%）稀释配制9 mol/L和0.1 mol/L的HCl溶液。较高浓度（9 mol/L）的溶液用于蛋白质水解，较低浓度（0.1 mol/L）的溶液用于固相萃取。 
	警告：操作应在通风橱内进行。</li>
	<li>配制固相萃取用的洗脱替代溶液，其中含10%饱和氨水溶液（储备液：30% w/w 氨水）、50%甲醇和40%水（v/v）。</li>
	<li>NMR缓冲液：将5.56 g磷酸氢二钠（Na2HPO4，0.08 mol/L）、0.4 g三甲基硅丙酸-2,2,3,3-d4钠盐（TSP，5 mmol/L）和0.04%（w/v）叠氮化钠（NaN3）溶于500 mL重水（D2O）中，并用HCl或NaOH调节pH至7.4（见材料表）。每次配制新批次缓冲液后，均需通过核磁共振波谱法检测其纯度。 
	注意：任何杂质（如乙醇）的含量应尽可能低。</li>
	<li>在研磨管中装入氧化锆珠（2 mL管体配1.4 mm珠子适用于大多数应用，但也有其他规格可选）（见材料表）。可手动装入约10–20颗珠子，或直接购买预装珠子的研磨管。</li>
	<li>准备好10–1,000 µL量程的移液器及配套吸头。 
	&#8203;注意：实验全程使用高纯度水，记为H2O，其电阻率≥18.2 MΩ·cm-1，相当于双蒸水。</li>
</ol>
2. 样本采集与保存
<ol>
	<li>使用液氮将液体样本（血清/血浆、细胞培养上清液等）迅速冷冻，并在使用前于 -80 °C 保存。</li>
	<li>按以下说明准备固体材料。
	<ol>
		<li>从细胞培养物中收集细胞（3-5 × 10⁶ 个细胞），可通过以下方式：对于贴壁细胞，用预冷的磷酸盐缓冲液洗涤后刮取并离心；对于悬浮培养的细胞，则直接离心收集。</li>
		<li>移除细胞上清液（可保留用于后续分析，可直接连续测定，见步骤6，或在可溶性蛋白沉淀后测定，见步骤3.1），然后用液氮迅速冷冻细胞沉淀，并于 -80 °C 保存。进一步处理见步骤3.2。</li>
		<li>根据研究目的保存和收集组织样本。对于高度均一的组织（如肝脏或肌肉），可分析其任意部分。例如，在小鼠脑组织中，可测定全脑或脑切片的整体精氨酸甲基化水平。 
		&#8203;注意：适宜处理的组织重量为 30–60 mg。建议将整个脑组织冷冻并研磨成粉，再分装使用。或者，也可使用特定脑区（如额叶、小脑、枕叶区域，或一个半脑，重量约 250 mg）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 样品初步处理
注意：操作需在冰上进行，并保持甲醇（MeOH）低温。样品也必须置于冰上，以防止蛋白质降解。
<ol>
	<li>对于液体样品，向 200 µL 样品中加入 400 µL 冰冷的甲醇。继续进行步骤 3.3。 
	注意：若样品量较少，可相应调整体积；NMR 的灵敏度通常足以检测较小样品量，但需单独测试确认。</li>
	<li>对于固体材料，准备足够数量的 1.5 mL 离心管用于裂解液（用于匀浆后离心）。
	<ol>
		<li>小心但彻底地将细胞沉淀重悬于 600 µL 甲醇/水（MeOH/H2O）中，并将全部液相转移至匀浆管中。</li>
		<li>将组织放入匀浆管中（可直接称重至管中），并加入 600 µL 甲醇/水（MeOH/H2O）（适用于 30–60 mg 组织；若重量差异较大，需相应调整）。</li>
		<li>将离心管放入组织匀浆器中（参见 材料表），对细胞沉淀或软组织以剧烈振荡模式匀浆一次，每次 20 秒；对较硬组织则匀浆两次，每次 20 秒（必要时可延长），两次之间间隔 5 分钟。</li>
		<li>匀浆完成后，立即将样品重新置于冰上，并将全部裂解液转移至新的 1.5 mL 离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 -20 °C 下保存样品至少 30 分钟（最长可达数天），然后进行后续处理。</li>
	<li>在 4 °C 下以 10,000 × g 离心 30 分钟。在此期间，准备足够数量的 1.5 mL 离心管以收集上清液。 
	注意：该上清液（在 图 1 中标记为 &#34;(1)&#34;）可弃去，或进行冻干处理，或直接用于 NMR 分析（步骤 6），也可进行其他分析。</li>
	<li>在本方案中，甲醇沉淀物（即分别在步骤 3.1 或 3.2.2 后获得的沉淀）将用于进一步分析，其中包含核酸和脂质、精氨酸甲基化蛋白等组分。可继续进行蛋白质水解，或将沉淀在 -20 °C 下保存数天。</li>
</ol>
4. 蛋白质水解
<ol>
	<li>向每个样品中加入 500 µL 的 9 mol/L HCl。然后用剪刀剪去每个管子的管盖，并将其放入玻璃培养管中（图 2A）。小心但紧密地盖上红色管盖（从而检查密封性）。 
	注意：使用前务必检查每个密封件（红色螺旋盖内的灰色聚四氟乙烯垫片）是否拧紧，并定期用水清洗。</li>
	<li>完成后，将管子放入部分装有沙子的烧杯中（以改善热传导），并在干燥箱中于 110 °C 水解约 16 小时。</li>
	<li>水解结束后，使样品冷却至室温（约 1 小时）。</li>
	<li>随后，在高真空（低于 100 Pa）条件下使用离心式冻干机过夜冻干。</li>
	<li>将冻干后形成的沉淀物（若已完全干燥；若未完全干燥，则继续冻干）溶解于 1 mL 的 0.1 mol/L HCl 中，并向每根管中加入 50 µL 氯仿（CHCl3）；使用 1,000 µL 移液器充分溶解沉淀物，同时混合液体，然后将全部液体转移至新管中。 
	警告：操作时应始终使用小量液体，以尽量减少大量蒸发</li>
	<li>然后在室温下以 8,000 x g 离心 10 分钟。</li>
	<li>用移液器小心吸取双相液体的上层水溶性组分（图 2B，密度较低的组分），并转移至新管中。手动固相萃取（第 5.2 节）使用 1.5 mL 管，机器人固相萃取（第 5.3 节及 图 2D）使用玻璃小瓶。避免将 CHCl3 及其内容物溅出（图 2C）。</li>
</ol>
5. 固相萃取（SPE）
<ol>
	<li>首次使用前，用1 mL洗脱液（步骤1.3）清洗固相萃取（SPE）小柱两次，每次在室温下以800 × g 离心1分钟（置于15 mL离心管中）。每个小柱可重复使用10–20次。</li>
	<li>手动SPE
	<ol>
		<li>每次运行前，使用1 mL纯甲醇和2次各1 mL的磷酸盐缓冲液（PBS）对SPE小柱（见材料表）进行预处理，每次加液后均在室温下以800 × g 离心1分钟（置于15 mL离心管中）。</li>
		<li>随后，将样品（来自步骤4.7）加载至SPE小柱上，并在室温下以600 × g 离心2分钟。</li>
		<li>接着，按以下步骤进行洗涤：
		<ol>
			<li>加入3次各1 mL的H2O（每次加水后均在室温下以800 × g 离心1分钟）。</li>
			<li>加入5次各1 mL的0.1 mol/L HCl（每次加酸后均在室温下以800 × g 离心1分钟）。</li>
			<li>加入2次各1 mL的MeOH（每次加甲醇后均在室温下以800 × g 离心1分钟）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>然后，用3次各1 mL的洗脱液将精氨酸及其衍生物洗脱至同一个15 mL离心管中（每次加液后在室温下以800 × g 离心1分钟）。 
		注意：洗脱液既用于洗脱精氨酸及其衍生物，也用于清洗小柱（所有物质要么在洗脱前被去除，要么在洗脱液的碱性pH条件下不被保留）。尽管如此，为避免长期使用导致的污染，应限制重复使用次数（见步骤5.1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>自动化SPE 
	注意：此处使用一台液体处理机器人（主要部件包括移液针、针清洗站、试剂供给系统以及样品和洗脱液存放位，见材料表），并配备SPE小柱支架。对于其他仪器，请确保配备上述全部组件。
	<ol>
		<li>直接将上清液（来自步骤4.7）加入带聚四氟乙烯（PTFE）密封垫的玻璃小瓶中（图2D），并准备好足量试剂（每种100 mL，即洗脱液、99%甲醇、PBS、H2O和0.1 mol/L HCl），以及用于洗脱和机器人针头清洗的5 mL离心管（通常使用H2O作为针头清洗液）。</li>
		<li>在机器人软件中创建一个应用程序或方法，严格按照手动SPE的步骤（步骤5.2）进行设置。 
		注意：不同厂商的仪器细节差异较大，因此请参考相应机器人的软件手册进行编程。液体处理机器人通常通过施加气压而非离心力来操作SPE小柱，这是主要区别。若该方案为首次建立并运行，应加入对照样品（如已知浓度的L-精氨酸），以验证流程的最优化。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 核磁共振前的最终准备
<ol>
	<li>将样品冷冻干燥过夜至完全干燥，以去除氨和 H2O。</li>
	<li>将每个样品溶解于 500 µL 的核磁共振缓冲液（步骤 1.4）中，并转移至核磁共振管中。重要的是，所有样品管中的体积必须一致，且样品必须均匀（无残留物和脂质，这些物质容易聚集）。 
	注意：核磁共振波谱的详细内容超出了本方法综述的范围，更详细的描述可参见其他文献27。此处仅说明主要要求和步骤。精氨酸及其代谢物的定量在 600 MHz 核磁共振波谱仪上进行（见材料表）。原则上，任何其他核磁共振波谱仪或磁场强度均可使用，前提是能够以足够的灵敏度检测到精氨酸和甲基化精氨酸的核磁共振信号，且无信号重叠。任何配备 z 轴梯度并能记录1H 谱的探头均可使用，前提是脉冲序列已正确设置。</li>
	<li>使用 CPMG（Carr-Purcell-Meiboom-Gill）脉冲序列33,34（cpmgpr1d，扫描次数 512，自由感应衰减信号点数 73728，600 MHz 核磁共振仪上的谱宽为 11904.76 Hz，循环延迟 4 s），并采用预饱和法抑制水信号，记录一维谱。</li>
	<li>在这些实验中，通过虚拟去耦消除1H 标量耦合，以减少信号重叠。针对特定问题和/或复杂样品或基质，可额外记录其他谱图，例如1H-13C 异核单量子相干（HSQC）谱27。 
	注意：对于更复杂的基质，若甲基化精氨酸的1H 核磁共振信号可能与其他代谢物（如赖氨酸）的1H 核磁共振信号部分重叠，则需要进行1H 同核 J 分辨谱（JRES）35。</li>
	<li>通过积分已知浓度标准品的相应峰强度进行绝对定量，例如 100 µmol/精氨酸。 
	注意：常规情况下，ADMA、SDMA 和 MMA（见材料表）以相对于精氨酸的比值形式报告。这种方法具有显著优势，即无需进行单独的归一化处理（如细胞数量、组织质量或蛋白质浓度）。在此情况下，精氨酸作为内标，相对定量已足以获得具有生物学意义的信息。</li>
	<li>为区分 SDMA 和 MMA，需再次将样品冷冻干燥以去除 D2O（如果此前已用核磁共振缓冲液重悬），然后用氘代二甲基亚砜（d6-DMSO）替代，从而实现甲基共振峰的分辨27。因此，使用巴斯德移液管从核磁共振管中吸出样品，冷冻干燥后溶解于 500 µL 的 d6-DMSO 中。</li>
</ol>

<ol><li>Guccione, E., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation%2C+functions+and+clinical+relevance+of+arginine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The regulation, functions and clinical relevance of arginine methylation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 642-657 (2019).</li>
<li>Bedford, M. T., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methylation+in+mammals%3A+who%2C+what%2C+and+why%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why.</a> Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Lin, W. J., Gary, J. D., Yang, M. C., Clarke, S., Herschman, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+immediate-early+TIS21+protein+and+the+leukemia-associated+BTG1+protein+interact+with+a+protein-arginine+N-methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The mammalian immediate-early TIS21 protein and the leukemia-associated BTG1 protein interact with a protein-arginine N-methyltransferase.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (25), 15034-15044 (1996).</li>
<li>Bachand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methyltransferases%3A+from+unicellular+eukaryotes+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methyltransferases: from unicellular eukaryotes to humans.</a> Eukaryotic Cell. 6 (6), 889-898 (2007).</li>
<li>Wang, Y. C., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionarily+conserved+protein+arginine+methyltransferases+in+non-mammalian+animal+systems%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Evolutionarily conserved protein arginine methyltransferases in non-mammalian animal systems.</a> FEBS Journal. 279 (6), 932-945 (2012).</li>
<li>Ahmad, A., Cao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+PRMTs+broaden+the+scope+of+arginine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Plant PRMTs broaden the scope of arginine methylation.</a> Journal of Genetics and Genomics. 39 (5), 195-208 (2012).</li>
<li>Fisk, J. C., Read, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methylation+in+parasitic+protozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methylation in parasitic protozoa.</a> Eukaryotic Cell. 10 (8), 1013-1022 (2011).</li>
<li>Hofweber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+Separation+of+FUS+Is+Suppressed+by+Its+Nuclear+Import+Receptor+and+Arginine+Methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phase Separation of FUS Is Suppressed by Its Nuclear Import Receptor and Arginine Methylation.</a> Cell. 173 (3), 706-719 (2018).</li>
<li>Chong, P. A., Vernon, R. M., Forman-Kay, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RGG%2FRG+Motif+Regions+in+RNA+Binding+and+Phase+Separation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">RGG/RG Motif Regions in RNA Binding and Phase Separation.</a> Journal of Molecular Biology. 430 (23), 4650-4665 (2018).</li>
<li>Nott, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+transition+of+a+disordered+nuage+protein+generates+environmentally+responsive+membraneless+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Phase transition of a disordered nuage protein generates environmentally responsive membraneless organelles.</a> Molecular Cell. 57 (5), 936-947 (2015).</li>
<li>Fong, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+targeting+of+RNA+splicing+catalysis+through+inhibition+of+protein+arginine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Therapeutic targeting of RNA splicing catalysis through inhibition of protein arginine methylation.</a> Cancer Cell. 36 (2), 194-209 (2019).</li>
<li>Yang, Y., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methyltransferases+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methyltransferases and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 13 (1), 37-50 (2013).</li>
<li>Wang, S. M., Dowhan, D. H., Muscat, G. E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+arginine+methylation+in+breast+cancer%3A+emerging+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Epigenetic arginine methylation in breast cancer: emerging therapeutic strategies.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 62 (3), 223-237 (2019).</li>
<li>Gulla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methyltransferase+5+has+prognostic+relevance+and+is+a+druggable+target+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methyltransferase 5 has prognostic relevance and is a druggable target in multiple myeloma.</a> Leukemia. 32 (4), 996-1002 (2018).</li>
<li>Wang, Z., Tang, W. H., Cho, L., Brennan, D. M., Hazen, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+metabolomic+evaluation+of+arginine+methylation+and+cardiovascular+risks%3A+potential+mechanisms+beyond+nitric+oxide+synthase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Targeted metabolomic evaluation of arginine methylation and cardiovascular risks: potential mechanisms beyond nitric oxide synthase inhibition.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (9), 1383-1391 (2009).</li>
<li>Friesen, W. J., Massenet, S., Paushkin, S., Wyce, A., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMN%2C+the+product+of+the+spinal+muscular+atrophy+gene%2C+binds+preferentially+to+dimethylarginine-containing+protein+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">SMN, the product of the spinal muscular atrophy gene, binds preferentially to dimethylarginine-containing protein targets.</a> Molecular Cell. 7 (5), 1111-1117 (2001).</li>
<li>Lee, J. H., Park, G. H., Lee, Y. K., Park, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+arginine+methylation+of+organ+proteins+during+the+development+of+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Research+and+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Changes in the arginine methylation of organ proteins during the development of diabetes mellitus.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 94 (1), 111-118 (2011).</li>
<li>Bulau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+methylarginine+metabolism+in+the+cardiovascular+system+identifies+the+lung+as+a+major+source+of+ADMA%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Analysis of methylarginine metabolism in the cardiovascular system identifies the lung as a major source of ADMA.</a> American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 292 (1), 18-24 (2007).</li>
<li>Zakrzewicz, D., Eickelberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+arginine+methylation+to+ADMA%3A+a+novel+mechanism+with+therapeutic+potential+in+chronic+lung+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pulmonary+Medicine%22%5BJournal%5D)">From arginine methylation to ADMA: a novel mechanism with therapeutic potential in chronic lung diseases.</a> BMC Pulmonary Medicine. 9, 5(2009).</li>
<li>Fulton, M. D., Brown, T., Zheng, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biological+axis+of+protein+arginine+methylation+and+asymmetric+dimethylarginine%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">The biological axis of protein arginine methylation and asymmetric dimethylarginine.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), (2019).</li>
<li>Aliferis, K. A., Chrysayi-Tokousbalides, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+in+pesticide+research+and+development%3A+review+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Metabolomics in pesticide research and development: review and future perspectives.</a> Metabolomics. 7 (1), 35-53 (2011).</li>
<li>Chiang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRMT5+Is+a+Critical+Regulator+of+Breast+Cancer+Stem+Cell+Function+via+Histone+Methylation+and+FOXP1+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">PRMT5 Is a Critical Regulator of Breast Cancer Stem Cell Function via Histone Methylation and FOXP1 Expression.</a> Cell Reports. 21 (12), 3498-3513 (2017).</li>
<li>Blanc, R. S., Vogel, G., Chen, T., Crist, C., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRMT7+preserves+satellite+cell+regenerative+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">PRMT7 preserves satellite cell regenerative capacity.</a> Cell Reports. 14 (6), 1528-1539 (2016).</li>
<li>Lim, Y., Lee, E., Lee, J., Oh, S., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+asymmetric+arginine+methylation+during+replicative+and+H2O2-induced+premature+senescence+in+WI-38+human+diploid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of asymmetric arginine methylation during replicative and H2O2-induced premature senescence in WI-38 human diploid fibroblasts.</a> Journal of Biochemistry. 144 (4), 523-529 (2008).</li>
<li>Bhatter, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+methylation+augments+Sbp1+function+in+translation+repression+and+decapping%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Arginine methylation augments Sbp1 function in translation repression and decapping.</a> FEBS Journal. 286 (23), 4693-4708 (2019).</li>
<li>Lee, Y. H., Stallcup, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minireview%3A+protein+arginine+methylation+of+nonhistone+proteins+in+transcriptional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Minireview: protein arginine methylation of nonhistone proteins in transcriptional regulation.</a> Molecular Endocrinology. 23 (4), 425-433 (2009).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+arginine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports+Methods%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein arginine methylation.</a> Cell Reports Methods. 1 (2), (2021).</li>
<li>Zinellu, A., Sotgia, S., Scanu, B., Deiana, L., Carru, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+protein-incorporated+methylated+arginine+reference+values+in+healthy+subjects+whole+blood+and+evaluation+of+factors+affecting+protein+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of protein-incorporated methylated arginine reference values in healthy subjects whole blood and evaluation of factors affecting protein methylation.</a> Clinical Biochemistry. 41 (14-15), 1218-1223 (2008).</li>
<li>Weiss, M., Manneberg, M., Juranville, J. F., Lahm, H. W., Fountoulakis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+hydrolysis+method+on+the+determination+of+the+amino+acid+composition+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Effect of the hydrolysis method on the determination of the amino acid composition of proteins.</a> Journal of Chromatography A. 795 (2), 263-275 (1998).</li>
<li>Davids, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+determination+of+asymmetric+and+symmetric+dimethylarginine%2C+L-monomethylarginine%2C+L-arginine%2C+and+L-homoarginine+in+biological+samples+using+stable+isotope+dilution+liquid+chromatography+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%3A+Analytical+Technologies+in+the+Biomedical+and+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Simultaneous determination of asymmetric and symmetric dimethylarginine, L-monomethylarginine, L-arginine, and L-homoarginine in biological samples using stable isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 900, 38-47 (2012).</li>
<li>Stryeck, S., Birner-Gruenberger, R., Madl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+metabolomics+as+emerging+tool+to+study+autophagy+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell%22%5BJournal%5D)">Integrative metabolomics as emerging tool to study autophagy regulation.</a> Microbial Cell. 4 (8), 240-258 (2017).</li>
<li>Vignoli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+metabolomics+by+1D+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">High-throughput metabolomics by 1D NMR.</a> Angewandte Chemie International Edition. 58 (4), 968-994 (2019).</li>
<li>Carr, H. Y., Purcell, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+diffusion+on+free+precession+in+nuclear+magnetic+resonance+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review%22%5BJournal%5D)">Effects of diffusion on free precession in nuclear magnetic resonance experiments.</a> Physical Review. 94 (3), 630-638 (1954).</li>
<li>Meiboom, S., Gill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+spin-echo+method+for+measuring+nuclear+relaxation+times%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation times.</a> Review of Scientific Instruments. 29 (8), 688-691 (1958).</li>
<li>Nagayama, K., Wuthrich, K., Bachmann, P., Ernst, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+J-resolved+1H+n.m.r.+spectroscopy+for+studies+of+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional J-resolved 1H n.m.r. spectroscopy for studies of biological macromolecules.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 78 (1), 99-105 (1977).</li>
<li>Stryeck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+concentrations+of+Citrate%2C+Tyrosine%2C+2-+and+3-+Hydroxybutyrate+are+associated+with+increased+3-month+mortality+in+acute+heart+failure+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Serum concentrations of Citrate, Tyrosine, 2- and 3- Hydroxybutyrate are associated with increased 3-month mortality in acute heart failure patients.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6743(2019).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+landscape+of+metabolic+dysregulation+during+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific landscape of metabolic dysregulation during ageing.</a> Biomolecules. 11 (2), (2021).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+human+hepatocellular+tumors+undergo+a+global+metabolic+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Growing human hepatocellular tumors undergo a global metabolic reprogramming.</a> Cancers. 13 (8), (2021).</li>
<li>Pahlich, S., Zakaryan, R. P., Gehring, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methylation%3A+Cellular+functions+and+methods+of+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methylation: Cellular functions and methods of analysis.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1764 (12), 1890-1903 (2006).</li>
<li>Habisch, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroectodermally+converted+human+mesenchymal+stromal+cells+provide+cytoprotective+effects+on+neural+stem+cells+and+inhibit+their+glial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Neuroectodermally converted human mesenchymal stromal cells provide cytoprotective effects on neural stem cells and inhibit their glial differentiation.</a> Cytotherapy. 12 (4), 491-504 (2010).</li>
<li>Ibanez, G., McBean, J. L., Astudillo, Y. M., Luo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-coupled+ultrasensitive+luminescence+assay+for+protein+methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An enzyme-coupled ultrasensitive luminescence assay for protein methyltransferases.</a> Analytical Biochemistry. 401 (2), 203-210 (2010).</li>
<li>Hevel, J. M., Price, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+direct+measurement+of+methyltransferase+activity+in+about+30min%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid and direct measurement of methyltransferase activity in about 30min.</a> Methods. 175, 3-9 (2020).</li>
<li>Altincekic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+detection+of+arginine+methylation+in+highly+repetitive+protein+motifs+of+low+sequence+complexity+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Site-specific detection of arginine methylation in highly repetitive protein motifs of low sequence complexity by NMR.</a> Journal of the American Chemical Society. 142 (16), 7647-7654 (2020).</li>
<li>Kaneb, H. M., Dion, P. A., Rouleau, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FUS+about+arginine+methylation+in+ALS+and+FTLD%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The FUS about arginine methylation in ALS and FTLD.</a> The EMBO Journal. 31 (22), 4249-4251 (2012).</li>
</ol>

作者声明无竞争利益。

以下部分主要关注该方法本身；精氨酸甲基化的生物学意义已在引言部分进行描述。
首先，不同硬度的组织可能需要调整样品裂解条件：来自细胞培养物（包括细菌、酵母等）以及脑、幼嫩肝脏、平滑肌等组织的细胞可迅速实现匀浆化。对于硬度较高的组织（包括老年个体的肝脏、动脉、骨骼等），匀浆需进行两次（参见步骤 3.2.3）。然而，即使存在部分不溶性残留物，也不应重复进行更多次匀浆。此时应将样品在 10,000 × g 条件下离心 10 分钟，并收集上清液用于后续分析（以最小化样品降解）。
在每个样品需要冷冻的步骤（最初加入甲醇后，以及分别在步骤 3.3、3.4 或 3.5）或冻干后（步骤 4.4 和 6.1），样品可在进一步处理前保存数天。此外，步骤 3.4 中的上清液（均质化后；在图 1中标识为 &#34;(1)&#34;）也可保存以用于进一步分析，例如测定除甲基化精氨酸以外的其他代谢物36,<su...

近二十年来，精氨酸残基的甲基化被确认为蛋白质重要的翻译后修饰之一，影响着转录调控、信号转导等多种基本生物学过程1。参与调控精氨酸甲基化的主要蛋白是蛋白精氨酸甲基转移酶（PRMTs）2。精氨酸的主要甲基化产物包括ω-(NG,NG)-不对称二甲基精氨酸（ADMA）、ω-(NG,N'G)-对称二甲基精氨酸（SDMA）以及ω-NG-单甲基精氨酸（MMA）2。
PRMTs 利用 S-腺苷-L-甲硫氨酸将甲基转移至蛋白质结合精氨酸的末端胍基（具有两个等价的氨基）上1。可区分两种主要酶：I 型和 II 型酶均可催化第一步甲基化反应生成单甲基精氨酸（MMA），该产物因此失去其对称性。在此之后，I 型酶（如 PRMT1、2、3、4、6、8）以 MMA 为底物生成非对称二甲基精氨酸（ADMA），而 II 型酶（主要是 PRMT5 和 PRMT9）则生成对称二甲基精氨酸（SDMA）。PRMT1 是首个从哺乳动物细胞中分离得到的蛋白质精氨酸甲基转移酶3。然而，PRMTs 在进化上高度保守4，存在于其他动物中，如非哺乳类脊椎动物、无脊椎脊索动物、棘皮动物、节肢动物和线虫刺胞动物5、植物6以及原生生物（包括酵母等真菌）7。在许多情况下，敲除某一 PRMT 会导致细胞无法存活，表明甲基化精氨酸在转录、翻译、信号转导、细胞凋亡以及液-液相分离（即无膜细胞器的形成，例如核仁）等基本细胞过程中发挥着关键作用，而这些过程通常涉及富含精氨酸的结构域8,9,10。反过来，这影响了生理状态和疾病进程，包括癌症11,12,13、多发性骨髓瘤14、心血管疾病15、病毒感染致病机制、脊髓性肌萎缩症16、糖尿病17以及衰老1。血液中 ADMA 水平升高（例如，由于蛋白质降解来自肺部18）被认为与内皮功能障碍、慢性肺部疾病19以及其他心血管疾病综合征20相关。PRMTs 的过表达已被发现可加速肿瘤发生，并与不良预后相关21,22。此外，PRMT6 和 PRMT7 的缺失会引发细胞衰老表型23。在 WI-38 成纤维细胞衰老过程中，已发现 ADMA 和 PRMT1 水平显著下降24。
目前研究中的难点在于，要理解甲基化在（病理）生理过程中的作用，关键在于识别并定量蛋白质精氨酸甲基化。现有的大多数方法依赖抗体来检测甲基化的精氨酸。然而，这些抗体仍具有特定的上下文依赖性，可能无法识别精氨酸甲基化蛋白的不同基序25,26。在本方案中，前述所有精氨酸衍生物均可通过核磁共振（NMR）波谱法进行可靠定量，即无论是单独存在、组合存在，还是在大多数情况下存在于复杂的生物基质中，如真核细胞（例如来源于酵母、小鼠或人类）和组织27，以及血清28。对于蛋白质及这些复杂基质，需先进行蛋白质水解29，以生成游离的（修饰的）氨基酸，例如精氨酸、MMA、SDMA 和 ADMA。固相萃取（SPE）30可用于富集目标化合物。最后，1H-NMR 波谱法可实现对精氨酸及其所有主要甲基化衍生物的并行检测。NMR 波谱法具有真正的定量性、高度可重复性以及技术稳健性等优势31,32。最终的 NMR 测量可在收集并制备大量样品后统一进行。本方案主要聚焦于样品制备，因为该步骤无需专用的 NMR 波谱仪，可在大多数生物化学实验室中完成。同时，本文也提供了一些关于应进行哪些 NMR 波谱测量的建议。

<table><tbody><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Greiner Bio One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>3-(三甲基硅基)丙酸-2,2,3,3-d4 钠盐（TSP）</td><td>Alfa Aesar</td><td>A1448</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 圆底离心管</td><td>Greiner Bio One</td><td>115101</td><td></td></tr><tr><td>32% 氨水溶液</td><td>Roth</td><td>A990.1</td><td></td></tr><tr><td>Bruker 600 MHz 核磁共振波谱仪，配备 TXI 探头</td><td>Bruker</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>冷冻离心机，例如 5430 R</td><td>Eppendorf</td><td>5428000010</td><td></td></tr><tr><td>氯仿 &amp;ge;99% p.a.</td><td>Roth</td><td>3313.1</td><td></td></tr><tr><td>Cryocool</td><td>Thermo Scientific</td><td>SCC1</td><td>SpeedVac 系统用导热流体</td></tr><tr><td>重水（D&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-10-PK</td><td></td></tr><tr><td>六氘代二甲基亚砜（d6-DMSO）</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-6-1000</td><td></td></tr><tr><td>干燥室</td><td>Binder</td><td>9090-0018</td><td></td></tr><tr><td>DURAN 培养管，13 × 100 mm，GL 14，9 mL</td><td>VWR International</td><td>212-0375</td><td></td></tr><tr><td>Edwards 深度真空油泵 RV5</td><td>Thermo Scientific</td><td>16234611</td><td>SpeedVac 系统组成部分</td></tr><tr><td>Eppendorf 1.5 mL 离心管</td><td>Greiner Bio One</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>Gilson 移液机器人 GX-241 Aspec</td><td>Gilson Inc.</td><td>26150008</td><td></td></tr><tr><td>L-精氨酸</td><td>AppliChem</td><td>A3675</td><td></td></tr><tr><td>甲醇 &amp;ge;99%</td><td>Roth</td><td>8388.4</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q 超纯水系统</td><td>Millipore</td><td>ZIQ7000T0</td><td></td></tr><tr><td>Oasis MCX 1 cc/30 mg，1 mL 固相萃取小柱</td><td>Waters</td><td>186000252</td><td>https://www.waters.com/waters/en_US/Waters-Oasis-Sample-Extraction-SPE-Products/</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Lonza</td><td>LONBE17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24 组织匀浆仪</td><td>Bertin Instruments</td><td>P000669-PR240-A</td><td>https://www.bertin-instruments.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys24-tissue-homogenizer/</td></tr><tr><td>Precellys 匀浆管（研磨管）</td><td>VWR International</td><td>432-0351</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 1.4 mm 氧化锆珠</td><td>VWR International</td><td>432-0356</td><td></td></tr><tr><td>Reacti-Therm/ReactiVap 加热、搅拌与蒸发模块</td><td>Thermo Scientific</td><td>TS-18820</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/TS-18820</td></tr><tr><td>适用于 1.5 mL 离心管的转子，FA-45-30-11</td><td>Eppendorf</td><td>5427753001</td><td></td></tr><tr><td>Savant 冷冻捕集阱</td><td>Thermo Scientific</td><td>15996161</td><td>SpeedVac 系统组成部分</td></tr><tr><td>Savant SpeedVac 真空浓缩仪 SPD210</td><td>Thermo Scientific</td><td>15906181</td><td>SpeedVac 系统组成部分；配备适用于 1.5 mL 离心管的转子</td></tr><tr><td>带 PTFE 密封垫的螺口玻璃瓶盖，DN9</td><td>Dr. R. Forche Chromatographie</td><td>CT11B3011</td><td></td></tr><tr><td>海沙</td><td>Roth</td><td>8441.3</td><td></td></tr><tr><td>短螺纹玻璃小瓶，1.5 mL，ND9</td><td>Dr. R. Forche Chromatographie</td><td>VT1100309</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠（NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;）</td><td>Roth</td><td>K305.1</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>VWR</td><td>BDH7363-4</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠（Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>VWR</td><td>80731-078</td><td></td></tr><tr><td>TopSpin 4.0（软件）</td><td>Bruker</td><td>-</td><td>https://www.bruker.com</td></tr><tr><td>&amp;omega;-NG-不对称二甲基精氨酸（ADMA）</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-208093</td><td></td></tr><tr><td>&amp;omega;-NG-单甲基精氨酸（MMA）</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-200739A</td><td></td></tr><tr><td>&amp;omega;-NG-NG'-对称二甲基精氨酸（SDMA）</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-202235A</td><td></td></tr></tbody></table>

利用核磁共振波谱技术探索精氨酸甲基化修饰组

Exploring the Arginine Methylome by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

许多蛋白质中的结合态精氨酸常发生甲基化修饰，通过改变蛋白质的理化性质及其与其他分子（包括其他蛋白质或核酸）的相互作用，从而调控其功能。本文介绍了一种易于实施的实验方案，用于定量检测精氨酸及其甲基化衍生物，包括非对称性二甲基精氨酸和对称性二甲基精氨酸（分别为ADMA和SDMA）以及单甲基精氨酸（MMA）。在从生物体液、组织或细胞裂解液中分离蛋白质后，本方案描述了一种简单的组织匀浆、蛋白质沉淀及蛋白质水解方法。由于水解产物中含有大量其他成分，如其他氨基酸、脂质和核酸，因此必须采用固相萃取（SPE）进行纯化。SPE可手动操作，使用离心机完成，也可借助移液机器人自动进行。本方案对ADMA的检测灵敏度约为100 nmol/L。由于SPE存在饱和效应，精氨酸的检测上限为3 mmol/L。综上所述，该方案提供了一种从生物样本制备到基于核磁共振（NMR）检测的稳健方法，并为研究精氨酸甲基化组时的成功操作提供了有价值的提示和注意事项。

在本实验室中，通常使用二维 J 分辨（JRES）虚拟去耦核磁共振谱的 1H 一维投影图进行峰归属和定量分析36。图3 展示了采用本固相萃取（SPE）方案纯化的酵母蛋白水解物的代表性 JRES 谱图。尽管两种物质浓度差异很大，仍可在细胞基质中实现分离和定量。根据特定甲基（-CH3）或亚甲基（-CH2-）基团在相应化学位移处的质子数目，1H-NMR 谱法可实现精确定量。如方案中所述（步骤0），相对于精氨酸，对甲基化精氨酸衍生物进行相对定量，足以用于观察生物学过程，例如在基因敲低/过表达、营养成分变化或抑制剂处理等调控条件下，精氨酸甲基化水平的变化。
如先前研究所示27，L-精氨酸和ADMA可通过其在3.25 ppm和3.02 ppm处不同的特征化学位移得以良好区分。SDMA和MMA的甲基质子在D2O（步骤1.4中所述的NMR...

本实验方案描述了通过1H-NMR波谱法对游离及蛋白结合的精氨酸和甲基化精氨酸进行制备与定量检测的方法。

蛋白质结合的精氨酸在多种蛋白质中常发生甲基化，通过改变其理化性质及相互作用来调控蛋白质功能……

该方案可实现对精氨酸甲基化水平及其动态变化的定量分析。这种修饰具有重要的调控作用，并可作为疾病的生物标志物。该方法的优势在于，它提供了一种简单的操作流程，适用于几乎无限多种样本类型，包括细胞、培养基、组织和生物体液。精氨酸甲基化在许多人类癌症中水平升高，目前针对精氨酸甲基转移酶的首批抑制剂已进入临床试验阶段。该方法可能有助于患者的分层和风险评估。本实验操作将由我实验室的研究技术人员 Hansjorg Habisch 进行演示。对于液体样品，向200微升样品中加入400微升预冷甲醇，随后在-20摄氏度下孵育30分钟。在4摄氏度下以10,000 G离心30分钟。转移上清液，并将沉淀收集至1.5毫升离心管中。对于固体样品，向含有30至60毫克组织或细胞沉淀的匀浆管中加入600微升66%甲醇水溶液。软组织以匀浆器匀浆一次，每次20秒；硬组织匀浆两次，每次20秒，中间间隔5分钟。立即将样品置于冰上，并将全部裂解液转移至新的1.5毫升离心管中，随后进行孵育。然后，在 4 摄氏度条件下，以 10,000 G 离心 30 分钟。在 1.5 毫升离心管中收集上清液，并使用该上清液进行蛋白质水解。剪去每个离心管的管盖。 然后向每个样品中加入 500 µL 9 M 盐酸。最后将离心管放入玻璃试管中，用盖子 tightly 封闭，确保密封良好，并将这些试管放入部分装有沙子的玻璃烧杯中。在干燥箱中于110摄氏度下将样品水解16小时。冷却样品后，使用高真空离心机过夜冷冻干燥。次日，将完全干燥的沉淀物溶于1毫升0.1摩尔盐酸中。向每个管中加入 50 微升氯仿，使用 1,000 微升移液器充分溶解沉淀。将全部液体转移至新管中，离心样品 10 分钟。小心收集两相液体的上层相至新管中。手动固相萃取使用塑料管，机器人固相萃取使用玻璃管。对于手动固相萃取，每次运行前需对萃取柱进行预处理，随后离心一分钟。然后将样品加载到固相萃取柱上，并在室温下以600 ×g离心两分钟。用1毫升水洗涤小柱三次，每次洗涤后以800 ×g在室温下离心1分钟。然后用1毫升0.1摩尔盐酸洗涤五次，每次洗涤后以800 ×g在室温下离心1分钟。再用1毫升甲醇洗涤两次，每次洗涤后离心1分钟。通过加入1毫升3倍替换溶液，将精氨酸及其衍生物洗脱至一个15毫升离心管中，并以每分钟一次的速率离心两次。对于机器人固相萃取，将收集洗脱液的离心管以及含有双相液体上层相的玻璃管分别放置于机器人的相应位置。在软件中使用基于手动固相萃取所述步骤的应用程序或方法。将样品冷冻干燥过夜，以彻底去除氨和水。将每份样品溶解于500 µL NMR缓冲液中，直至形成均匀溶液。然后将等量的均匀样品转移至每根NMR管中。此处展示了使用固相萃取（SPE）方法纯化的酵母蛋白水解物的J-RES谱图。在百万分之3.25和3.02处的特征化学位移可区分L-精氨酸和不对称二甲基精氨酸（ADMA）。这两种物质可在细胞基质中实现分离与定量。根据特定甲基或亚甲基基团在相应化学位移处的质子数量，氢核磁共振波谱可实现精确定量。采用该方法，可通过二甲基精氨酸（SDMA）在2.76 ppm和单甲基精氨酸（MMA）在2.74 ppm处的特征化学位移，将两者的氢核磁共振信号区分开并分别定量。执行本方案时，应使用移液器小心收集含有水溶性组分的两相液体的上层相，并转移至新管中。手动固相萃取使用 1.5 毫升离心管，机器人固相萃取使用玻璃小瓶。避免氯仿及其内容物溢出。含有精氨酸及甲基化精氨酸类物质的洗脱液采用核磁共振波谱法进行分析。这可以得到这些物质的绝对含量。目前，我们的技术已广泛应用于大量基础研究项目中，旨在解析精氨酸甲基化在病理生理过程中的作用。此外，我们正在评估蛋白质精氨酸甲基化在多种人类疾病中作为生物标志物候选物的潜力。

exploring-arginine-methylome-nuclear-magnetic-resonance

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

用核磁共振波谱探索精氨酸甲基组

两种用于指定还原性α-和ε-二甲胺核磁共振信号的方法 13C-甲基化 N-末端赖氨酸的描述。一种方法利用还原性甲基化反应的pH诱导选择性，另一种方法使用氨肽酶选择性去除...

用于鉴定还原甲基化蛋白质N端二甲基胺13C标记核磁共振信号的方法

蛋白质精氨酸甲基化，由一类酶催化 即， 蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMTs）是指在蛋白质中精氨酸残基上通过酶促反应添加一个或多个甲基基团的过程。 体外...

体外 甲基化实验用于研究蛋白质精氨酸甲基化

通过SPOT方法合成的多肽阵列可用于分析蛋白质赖氨酸甲基转移酶（PKMTs）的底物特异性，并确定PKMTs的底物谱，从而理解其生物学功能。本实验方案描述了如何合成多肽阵列，使用PKMTs进行甲基化反应，并对结果进行分析。...

利用SPOT肽阵列分析蛋白质赖氨酸甲基转移酶的特异性

DNA甲基化能够维持基因表达的稳定水平，同时也能在多种刺激条件下介导基因表达的动态变化。本文详细介绍了用于研究DNA甲基化在特定基因上的变化及其对基因表达影响的技术方法。...

关联星形胶质细胞 KCNJ10（Kir4.1）基因特异性 DNA 甲基化变化与其表达及转录活性

本方案描述了含有不同同位素标记的姐妹组蛋白的核小体的重建方法。同时，在使用预先修饰的组蛋白拷贝后，可生成不对称翻译后修饰的核小体。这些样品可直接用于高分辨率核磁共振（NMR）波谱技术，同时研究姐妹组蛋白上的修饰串扰机制。...

用同位素标记不同的姐妹组蛋白重建核小体

蛋白质精氨酸（R）甲基化是一种广泛存在的翻译后修饰，可调控多种生物通路。当与修饰肽富集的生物化学方法相结合时，质谱技术是全局分析R-甲基化蛋白质组的最佳手段。本文描述了在人类细胞中高置信度鉴定全局R-甲基化的实验流程。...

一种基于质谱的蛋白质组学方法用于全局且高置信度的蛋白质精氨酸甲基化分析

这些方案提供了在细胞中评估蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMT）家族各个成员酶活性的方法学。文中详细描述了利用内源性和外源性生物标志物、识别甲基化精氨酸的抗体以及抑制剂工具化合物来评估PRMT活性的具体操作指南。...

研究细胞中蛋白质精氨酸甲基转移酶1-9活性的定量方法

本文介绍了一种实验方案，详细阐述了用于表征溶液中蛋白质-聚糖相互作用的一系列核磁共振（NMR）实验的样品制备、数据采集、处理与分析方法。文中概述了目前常用的基于配体和基于蛋白质的研究方法，这些方法无疑将推动结构糖生物学和分子识别研究领域的发展。...

解析糖-蛋白质相互作用：核磁共振（NMR）大显身手

本文介绍了一种利用点杂交法对整体m⁶A水平进行半定量检测的实验方案。首先提取总RNA，经变性后点样于尼龙膜上，使用抗m⁶A抗体进行杂交，再通过化学发光法显影。利用ImageJ软件进行灰度分析，量化信号强度，从而反映相对甲基化水平，为相关研究提供一种可重复的实验流程。...

检测RNA整体N6-甲基腺苷修饰水平的点杂交实验

动态核极化结合后续样品溶解技术已实现对生物系统中代谢过程的实时研究。超极化[1-13C]丙酮酸用于研究前列腺癌细胞系中的乳酸脱氢酶活性 体外.

超极化13C代谢磁共振波谱与成像

探索利用核磁共振波谱技术定量分析精氨酸甲基化水平的方法，适用于细胞、组织和生物体液等多种生物样本。该方案为癌症研究和患者风险评估提供了可靠的生物标志物检测手段。

利用核磁共振波谱技术探索精氨酸甲基化修饰组

探索更多视频