Name: 化学制图方法研究锥虫感染 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-21T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: 学习化学制图方法构建锥虫感染期间代谢物与寄生虫分布的三维模型，利用LCMS级溶剂提取代谢物并通过SketchUp和MeshLab软件进行数据可视化。该技术有助于深入理解宿主与病原体在代谢水平上的相互作用机制。

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劳拉-伊莎贝尔·麦克卡尔（Laura-Isobel McCall）博士担任研究员&#160;感谢伯勒斯威康基金会（Burroughs Wellcome Fund）授予的传染病发病机制奖。作者还希望感谢美国国立卫生研究院（NIH）资助号R21AI148886、俄克拉荷马呼吸与传染病中心（Oklahoma Center for Respiratory and Infectious Diseases, OCRID）在NIH资助号P20GM103648支持下提供的试点资助，以及俄克拉荷马大学（University of Oklahoma）提供的启动资金（资助对象：LIM）。本内容的准确性由作者全权负责，不代表资助方的官方观点。作者同时感谢本实验方案中所使用工具的开发者。所有相关文献已在适用处予以引用。

无利益冲突需要申报。

了解锥虫动质体感染对于指导新药开发和治疗策略至关重要。这种化学图谱方法能够独特地提供有关代谢与锥虫动质体疾病发病机制之间关系的可操作见解，从而满足这一转化医学需求。
在代谢物提取和质谱分析过程中，建议仅使用液相色谱-质谱级溶剂，以减少背景污染。应尽可能避免聚合物污染35，此类污染通常来源于石蜡膜和/或其他塑料材料36,37,38,。尤其禁止使用石蜡膜。这些因素至关重要，因为液相色谱-质谱数据的质量取决于样品制备和代谢物提取过程中所用材料。在生成“ili图”之前，应确保数据质量。此外，生成这些全面的空间代谢组学图谱需要收集所有相邻的组织样本，并对所有采集的样本进行代谢物提取，以避免图谱中出现空白区域。因此，应充分考虑并妥善规划样本采集流程、代谢物提取与液相色谱-质谱分析的物流安排以及相关成本。
本方案可通过多种方式修改以满足用户需求。例如，代谢物提取过程中所用溶剂的极性和溶解性将影响可检测到的代谢物种类39。为了在非靶向化学图谱分析中最大程度地检测到多样化的代谢物特征，建议结合使用多种提取步骤和溶剂。例如，本方法采用二氯甲烷、甲醇和水作为提取溶剂，因为它们能够准确检测非极性和极性分子20,40。然而，这些溶剂并非适用于所有质谱实验，研究人员应根据项目目标选择合适的提取溶剂。同样，也可采用不同的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）条件，例如用正相色谱替代反相色谱。在反相数据采集过程中，也可使用其他类型的色谱柱替代C8色谱柱，但从经验上看，C8色谱柱对组织脂质的耐受性更强，且堵塞频率较低。从概念上讲，这些方案也可应用于其他质谱方法，如气相色谱-质谱联用技术（gas chromatography-mass spectrometry）等。
另一种方法是质谱成像。事实上，与质谱成像方法不同，液相色谱-质谱联用技术本身并不保留空间信息10。化学制图方法通过在项目设计初期、样本元数据记录以及数据处理步骤中纳入采样位置，弥补了这一不足。与质谱成像相比，这种化学制图方法的一个优势在于能够提供高置信度的代谢物注释（符合代谢组学标准倡议的1级或2级注释置信度41），而质谱成像的大多数应用仅依赖精确质量进行注释。质谱成像能够实现精细的空间映射，有时甚至达到单细胞水平，例如42,43。相比之下，化学制图方法能够在无需高度专业化的全动物冷冻切片技术的情况下，实现大范围跨器官的代谢物分布图谱绘制。化学制图可为当前正在发展的多种空间转录组学方法提供互补证据，例如44，其优势在于聚焦于最接近表型的“组学”层面45。用于寄生虫负荷定量的其他方法包括在样本采集时测量生物发光信号6。此外，也可采集细小组织片段，用于共聚焦显微镜或电子显微镜观察，以评估局部寄生虫负荷及组织损伤情况。本方案及先前研究中用于细胞因子定量的水相匀浆液13，也可用于定量基于蛋白质的组织损伤标志物。
获取适用于绘制LC-MS数据结果的3D模型也有多种方法。除本文建议的方法外，还可从多个在线供应商处购买预制好的模型。请确保其使用条款与预期用途相符，特别是涉及发表时。大型器官的模型可根据扫描仪说明，使用3D扫描仪从头生成。存在诸如MATLAB等替代工具可用于化学图谱的3D模型构建与可视化46，但这些工具主要在'ili16开发之前实现。MATLAB是一套数据处理与编程工具集，广泛应用于多个领域。然而，MATLAB既非免费软件，也非开源软件，且需要熟悉其操作界面，尤其考虑到MATLAB并非专为质谱数据处理而设计。本方法的替代方案，即SketchUp、Meshlab和'ili，均为免费获取、易于使用，并在化学图谱应用方面提供与MATLAB类似的功能。
该方法在样品制备和代谢物提取方面具有较强的稳健性。通常最需要进行故障排查的环节是液相色谱-质谱（LC-MS）数据采集步骤，但这超出了本文的范围。读者可参考有关LC-MS数据采集故障排查的优秀文献20,47。同样，代谢物注释的复杂性也不在本方法聚焦于三维模型构建的讨论范围内。有关该主题的有用参考文献包括24,25,48,49。
尽管该方法能有效探索疾病发病机制，但此方法存在一些局限性，其中部分局限性在任何代谢组学实验中均较为常见。其一为液相色谱-质谱（LC-MS）特征峰的注释率较低50，这取决于参考谱图数据库的可获得性与质量。另一局限性在于，由于RNA保存试剂（如RNAlater）与LC-MS/MS分析不兼容，本方案无法保存mRNA。然而，所获得的蛋白质质量足以满足下游分析需求，因此可替代基于mRNA的分析方法。
一种化学图谱方法可直接反映细菌、病毒或寄生虫感染在器官系统中的发展过程以及局部疾病的发生机制。通过分析这些区域性的子样本并构建三维模型，最终能够揭示代谢物在三维空间中的功能，从而阐明分子生物学中此前未被认识的空间维度。例如，利用本方案，可将代谢物的定位与Trypanosoma cruzi寄生虫载量进行比较。结果阐明了病原体与宿主组织之间的关系，同时揭示了恰加斯病（Chagas disease）症状进展过程中的代谢动态6。化学图谱方法还已被应用于多个研究领域，例如人类居住环境的相互作用51,52,53、人体皮肤46和肺部54等器官系统的化学组成，以及植物代谢与环境之间的相互作用55。未来的研究可进一步拓展至评估局部疾病的耐受性与恢复力，或在锥虫感染模型之外，研究局部代谢物水平、病原体趋向性与疾病趋向性之间的关系。该方法还具有广泛的应用前景，可用于扩展当前的药代动力学研究方案，以评估局部组织药物浓度与药物代谢之间的关系，以及整体代谢背景、组织损伤和病原体清除之间的关联。总体而言，化学图谱技术使得研究人员能够在多种样本类型中独特地探索代谢物的分布情况，其应用&#160;包括疾病发病机制、人类健康、人与环境的相互作用以及微生物动态等。

Leishmania 属、非洲锥虫（Trypanosoma brucei）和美洲锥虫（Trypanosoma cruzi）均属于锥虫科寄生虫。Leishmania 原虫引起利什曼病，其临床表现包括可自愈或局限于皮肤的皮肤利什曼病、累及口腔、鼻腔和咽喉黏膜组织并造成损害的黏膜皮肤利什曼病，以及具有内脏嗜性的内脏利什曼病，后者可导致发热和肝脾肿大1,2。T. brucei 引起人类非洲锥虫病（HAT），也称为昏睡病，主要见于非洲国家3。在寄生虫定位于血液和淋巴系统的血淋巴期，患者临床表现包括肝脾肿大、发热、头痛、肌肉骨骼疼痛、淋巴结病和贫血；随后进入脑膜脑炎期，寄生虫侵入中枢神经系统，导致睡眠障碍、行为改变，最终发展为致命性昏迷4。T. cruzi 引起恰加斯病，流行于美洲地区。感染者通常经历一个初始的急性期，此期常无症状，但寄生虫具有广泛的组织嗜性。约有10%–30%的感染者在感染数十年后进入慢性期，表现为食管扩张、结肠扩张以及心血管并发症5,6。
代谢组学研究小分子物质（50–1,500 Da），包括来自初级或次级代谢的生物化合物，以及外源性化合物，如药物或食物来源的分子。在宿主-病原体相互作用的研究背景下，代谢组学可用于探索感染对宿主代谢物环境的影响，这对于评估病原体对宿主的作用至关重要。此外，它还可用于评估病原体对宿主营养和免疫环境的适应性7,8,9。质谱（MS）和核磁共振（NMR）波谱法是代谢组学中常用的工具，用于鉴定、定量和表征代谢物。这种&#34;组学&#34;方法也可应用于生物标志物的发现和药物开发10,11。
鉴于锥虫科寄生虫具有特定的组织嗜性，空间代谢组学分析可为理解其所致疾病的发病机制提供重要见解。通过绘制代谢物的空间分布图谱，研究人员揭示了慢性 Trypanosoma cruzi 感染在小鼠心脏组织中以及急性和长期 Trypanosoma cruzi 感染在小鼠胃肠道中局部影响的代谢物6,12,13。具体而言，三维化学图谱显示，在慢性 Trypanosoma cruzi 感染小鼠的心脏组织中，寄生虫的持续存在与代谢改变之间存在脱节现象。代谢紊乱最显著的区域位于心脏的下部和心尖段，这与恰加斯病的症状部位（心尖部动脉瘤）相吻合。在特定心脏部位受感染影响并与疾病严重程度相关的代谢物家族包括酰基肉碱和甘油磷酰胆碱12,13,14。在胃肠道中，持续的代谢改变与恰加斯病症状部位（食管和结肠）一致；相比之下，在无恰加斯病症状表现的部位（如小肠），代谢状态则恢复至正常水平。胃肠道中受感染局部影响的代谢物包括酰基肉碱、甘油磷酰胆碱、犬尿氨酸、色氨酸和胆酸。此外，这些分析还揭示了一种新的恰加斯病代谢耐受机制6。将这些方法应用于皮肤利什曼病的研究发现，病灶部位存在显著的代谢紊乱，同时在病灶邻近的宏观上看似健康的组织中也观察到特定的代谢变化。例如，病灶部位谷氨酰胺水平降低，而质荷比（m/z）为 200–299、400–499、500–599 和 600–699 范围内的甘油磷酰胆碱显著升高。PC (O-34:1) 仅在病灶邻近区域升高15。
本论文的目的是展示生成代谢物分布三维模型（&#34;化学图谱&#34;）所需的关键步骤，并将其应用于锥虫动质体寄生虫感染模型（图1）。该方法建立在代谢组学及代谢组学数据处理领域的多项关键进展基础之上，特别是开发了“ili”软件，可便捷地将代谢组学数据映射到三维模型上16。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意品牌，视供应情况而定</td></tr><tr><td>1 L 玻璃瓶，耐热玻璃材质</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意品牌，视供应情况而定</td></tr><tr><td>1 L 量筒，耐热玻璃材质</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意品牌，视供应情况而定</td></tr><tr><td>2 mL SafeLock 离心管</td><td>VWR</td><td>20901-540</td><td>根据可用的组织匀浆器选择合适的管型</td></tr><tr><td>3D 模型（根据实验步骤从头生成，或购买获得）</td><td>NA</td><td>NA</td><td>根据所研究系统的需要选择</td></tr><tr><td>5 mm 不锈钢研磨珠</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Fisher</td><td>3252449</td><td></td></tr><tr><td>AATTCCTCCAAGCAGCGGATA 引物</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意品牌，视供应情况而定；发表于 Piron, M. 等人。用于血液样本中 &lt;i&gt; Trypanosoma cruzi &lt;/i&gt; 检测的实时 PCR 检测方法的开发。Acta tropica. 103 (3), 195&amp;ndash;200 (2007)。</td></tr><tr><td>分析天平</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意品牌，视供应情况而定</td></tr><tr><td>ASTCGGCTGATCGTTTTCGA 引物</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意品牌，视供应情况而定；发表于 Piron, M. 等人。用于血液样本中 &lt;i&gt; Trypanosoma cruzi &lt;/i&gt; 检测的实时 PCR 检测方法的开发。Acta tropica. 103 (3), 195&amp;ndash;200 (2007)。</td></tr><tr><td>台式离心机，配备微量离心转子、Falcon 管及 96 孔板转子</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意品牌，视供应情况而定</td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td>NA</td><td>NA</td><td>II 级，A2 型；任意品牌，视供应情况而定</td></tr><tr><td>CAGCAAGCATCTATGCACTTAG&lt;br/&gt; ACCCC 引物</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意品牌，视供应情况而定；发表于 Cummings, K.L., Tarleton, R.L. 利用实时 PCR 快速定量宿主组织中的 &lt;i&gt; Trypanosoma cruzi &lt;/i&gt;。Molecular and biochemical parasitology. 129 (1), 53&amp;ndash;59 (2003)。</td></tr><tr><td>相机</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意品牌，视供应情况而定。本实验方案使用手机摄像头即可满足要求</td></tr><tr><td>化学发光成像系统</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意系统，视供应情况而定</td></tr><tr><td>棉球</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意品牌，视供应情况而定</td></tr><tr><td>防冻手套</td><td>VWR</td><td>97008-208</td><td>可替换为任意品牌，视供应情况而定</td></tr><tr><td>解剖剪刀</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意品牌，视供应情况而定</td></tr><tr><td>干冰</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意品牌，视供应情况而定</td></tr><tr><td>加长型镊子</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意品牌，视供应情况而定</td></tr><tr><td>易燃品专用冰箱</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意品牌，视供应情况而定</td></tr><tr><td>用于微量离心管的冷冻储存盒</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意品牌，视供应情况而定</td></tr><tr><td>通风橱</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意品牌，视供应情况而定</td></tr><tr><td>高分辨质谱仪</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意品牌，视供应情况而定，例如 ThermoFisher Q-Exactive Plus（货号 0726030）</td></tr><tr><td>冰桶</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意品牌，视供应情况而定</td></tr><tr><td>ili 软件</td><td>ili.embl.de</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Covetrus</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>大号密封盒</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意品牌，视供应情况而定；尺寸需足够容纳小鼠和棉球</td></tr><tr><td>LC-MS 级乙腈</td><td>Fisher Optima</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS 级二氯甲烷</td><td>Fisher Optima</td><td>D151-4</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS 级甲酸</td><td>Fisher Optima</td><td>A11750</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS 级甲醇</td><td>Fisher Optima</td><td>A456-4</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS 级水</td><td>Fisher Optima</td><td>W64</td><td></td></tr><tr><td>液相色谱柱</td><td>Phenomenex</td><td>00B-4499-AN</td><td>可根据目标代谢物更换为其他品牌和型号</td></tr><tr><td>液相色谱柱保护柱</td><td>Phenomenex</td><td>AJ0-8784</td><td>可根据目标代谢物更换为其他品牌和型号</td></tr><tr><td>液相色谱柱保护柱套</td><td>Phenomenex</td><td>AJ0-9000</td><td>可根据目标代谢物更换为其他品牌和型号</td></tr><tr><td>液氮</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意品牌，视供应情况而定</td></tr><tr><td>荧光素</td><td>Goldbio</td><td>LUCK-1G</td><td></td></tr><tr><td>MeshLab 软件</td><td>https://www.meshlab.net/</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Meshmixer 软件</td><td>https://www.meshmixer.com/</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>质谱校准物</td><td>NA</td><td>NA</td><td>根据可用仪器选择合适的校准物</td></tr><tr><td>质谱数据处理软件</td><td>NA</td><td>NA</td><td>有多种可选方案；作者推荐使用 MZmine</td></tr><tr><td>MSConvert 软件</td><td>http://proteowizard.sourceforge.net/</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-ONE-W</td><td>其他型号的 Nanodrop 同样适用</td></tr><tr><td>p1000 移液器吸头</td><td>NA</td><td>NA</td><td>选择与可用移液器匹配的合适品牌</td></tr><tr><td>p1000 移液器</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意品牌，视供应情况而定</td></tr><tr><td>p20 移液器吸头</td><td>NA</td><td>NA</td><td>选择与可用移液器匹配的合适品牌</td></tr><tr><td>p20 移液器</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意品牌，视供应情况而定</td></tr><tr><td>p200 移液器吸头</td><td>NA</td><td>NA</td><td>选择与可用移液器匹配的合适品牌</td></tr><tr><td>p200 移液器</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意品牌，视供应情况而定</td></tr><tr><td>个人防护装备（手套、实验服、护目镜/安全眼镜；面罩）</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意品牌，视供应情况而定</td></tr><tr><td>Q-Plex 小鼠细胞因子筛查试剂盒（16 重）</td><td>Quansys biosciences</td><td>110949MS</td><td>可替换为其他基于蛋白的细胞因子检测方法，如其他商业化的细胞因子 ELISA 试剂盒</td></tr><tr><td>Quick-DNA Miniprep Plus 试剂盒（200 次）</td><td>Zymo</td><td>D4069</td><td>可替换为任意品牌的哺乳动物 DNA 提取试剂盒，视供应情况而定</td></tr><tr><td>实时荧光定量 PCR 仪</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意品牌，视供应情况而定</td></tr><tr><td>盐瓶或茶叶过滤器</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意品牌；用于盛放浸有异氟烷的棉球，防止其与小鼠皮肤直接接触</td></tr><tr><td>SketchUp 软件</td><td>https://www.sketchup.com/</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>标本镊</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意品牌，视供应情况而定</td></tr><tr><td>真空离心浓缩仪，配备微量离心管和 96 孔板转子</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意品牌，视供应情况而定</td></tr><tr><td>电子表格软件</td><td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel</td><td>NA</td><td>可根据需要替换为其他电子表格管理软件</td></tr><tr><td>磺胺氯哒嗪</td><td>Sigma</td><td>S9882-100G</td><td></td></tr><tr><td>磺胺二甲氧嘧啶</td><td>Sigma</td><td>S7007-10G</td><td></td></tr><tr><td>Sybr Green qPCR 反应混合液</td><td>Fisher</td><td>A25780</td><td>可根据需要替换为其他 Sybr Green qPCR 反应混合液</td></tr><tr><td>TCCCTCTCATCAGTTCTAT&lt;br/&gt; GGCCCA 引物</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意品牌，视供应情况而定；发表于 Cummings, K.L., Tarleton, R.L. 利用实时 PCR 快速定量宿主组织中的 &lt;i&gt; Trypanosoma cruzi &lt;/i&gt;。Molecular and biochemical parasitology. 129 (1), 53&amp;ndash;59 (2003)。</td></tr><tr><td>组织匀浆器</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意品牌，视供应情况而定；例如 Qiagen TissueLyser II（货号 85300），配备 TissueLyser 适配器组（2 x 24）（货号 69982）</td></tr><tr><td>组织样本</td><td>NA</td><td>NA</td><td>来自合适的感染模型</td></tr><tr><td>TissueLyser 单珠分配器</td><td>Qiagen</td><td>69965</td><td></td></tr><tr><td>超高效液相色谱仪（UHPLC）</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意品牌，视供应情况而定，例如 ThermoFisher Vanquish（货号 IQLAAAGABHFAPUMBHV）</td></tr><tr><td>超低温冰箱（-80°C）</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意品牌，视供应情况而定</td></tr><tr><td>超声波清洗仪</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意系统，视供应情况而定</td></tr><tr><td>湿冰</td><td>NA</td><td>NA</td><td>任意品牌，视供应情况而定</td></tr><tr><td>无区域密封膜</td><td>VWR</td><td>&amp;nbsp;490007-390</td><td></td></tr></tbody></table>

研究锥虫感染的化学图谱学方法

Chemical Cartography Approaches to Study Trypanosomatid Infection

病原体趋向性与疾病趋向性是指病原体选择性定植或损伤的组织部位，从而导致局部化的疾病症状。感染人类的锥虫科寄生虫包括引起恰加斯病的Trypanosoma cruzi、引起昏睡病的Trypanosoma brucei&#160;，以及引起利什曼病的Leishmania物种。这些寄生虫共同影响全球约2000万人。这些寄生虫表现出特定的趋向性：T. cruzi主要靶向心脏、食管和结肠；T. brucei则累及脂肪组织、胰腺、皮肤、循环系统和中枢神经系统；皮肤型Leishmania菌株主要感染皮肤，而内脏型Leishmania菌株则主要侵犯肝脏、脾脏和骨髓。因此，从空间视角研究锥虫科疾病发病机制至关重要。化学图谱技术通过液相色谱-质谱法（LC-MS）对小分子丰度进行检测，并结合微生物学和免疫学参数，生成三维可视化图像。本实验方案展示了如何应用化学图谱技术研究锥虫科寄生虫感染过程中的致病机制，具体步骤包括系统性的组织取样与代谢物提取、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）数据采集，最终生成代谢物分布的三维图谱。该方法可用于多个研究方向，例如T. cruzi、T. brucei或Leishmania在组织定植过程中的营养需求、感染部位的免疫代谢调控，以及局部组织代谢紊乱与临床疾病症状之间的关系，从而全面揭示锥虫科疾病的发病机制。

获得的代谢物特征数量取决于所分析的组织类型及数据处理参数。例如，本方案已用于分析空间影响 T. cruzi 感染对小鼠模型胃肠道代谢组的影响 T. cruzi 感染。在先前的研究中，雄性C3H/HeJ小鼠通过腹腔注射1,000 CL + luc T. cruzi 寄生虫32,6动物在感染后12天或89天被实施安乐死，并按照本方案所述方法对胃肠道13个连续节段进行化学图谱分析。该分析生成了一个包含5,502个特征的特征表，并通过本方案所述步骤将其可视化为三维图像。该方法能够可视化单个动物体内寄生虫负荷较高部位的代谢物特征（如犬尿氨酸）。 图 2B 与寄生虫负荷相比， 图 2A），以及在组织区域间分布存在差异的代谢物（谷氨酰胺， 图2C）以及在小肠和大肠中含量相近的代谢物特征（LPE 16:0 图 2D）。选择犬尿氨酸进行可视化，是因为其与炎症存在已知关联，且已有文献报道犬尿氨酸衍生的代谢物具有调控作用 T. cruzi 加载33基于随机森林的机器学习模型此前已揭示犬尿氨酸水平与感染状态之间存在关联6谷氨酰胺被选为可视化对象，依据是先前发表的研究证明了其与特定关系之间的关联 体外 谷氨酰胺可用性与 T. cruzi 药物敏感性34. 使用逻辑回归确认了差异分布，p &lt; 0.05。通过目视检查数据，选择在不同组织位点间水平相近的代谢物特征，确定LPE 16:0。
<img alt="LC-MS分析流程图；组织匀浆、DNA提取、代谢物处理步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63255/63255fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：实验方案概览。 该示意图使用BioRender.com绘制。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63255/63255fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="肠道代谢物分布；对数尺度热图，寄生虫负荷至 LPE 16:0，示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63255/63255fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：化学空间分布分析。雄性 C3H/HeJ 小鼠通过腹腔注射接种 1,000 个 CL+luc T. cruzi 寄生虫32。动物在感染后第 12 天或第 89 天被实施安乐死，系统性采集胃肠道组织并进行切片（步骤 1）6。按照步骤 2 提取代谢物，并通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行分析。使用 SketchUp 软件生成三维模型（步骤 5），数据按步骤 6 进行三维可视化展示。（A）某一只特定小鼠在感染后第 12 天的寄生虫分布情况。（B）同一只小鼠在感染后第 12 天的犬尿氨酸代谢物分布情况。（C）感染小鼠在感染后第 89 天谷氨酰胺分布的平均值。（D）在与（A）和（B）相同的小鼠中，小肠和结肠内保留时间为 2.929 分钟、质荷比 m/z 454.292 的物质水平相当，该物质被注释为 2-十六酰基-甘油-3-磷酸乙醇胺（LPE 16:0）。样品与数据来源见文献6。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63255/63255fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

本方案描述了在锥虫感染期间生成代谢物分布三维模型的步骤，包括样品采集、代谢物提取、液相色谱-串联质谱数据采集概述、三维模型构建以及最终的数据可视化。

病原体趋向性与疾病趋向性是指病原体选择性定植或损伤的组织部位，从而导致局部化的疾病症状。

该方案可用于构建代谢物和寄生虫分布的三维模型，有助于理解局部组织代谢紊乱、寄生虫分布与临床疾病症状之间的关系。该方法的主要优势在于能够实现活体尺度下跨器官的代谢物分布与病原体分布的对应映射，并支持其统计学分析。理论上，化学图谱技术可通过直接检测与发病机制相关的代谢物以及治疗效果的影响，来探究疾病在宿主中的发生发展及其影响。首先称重并标记试管，然后系统地对组织进行切片，每管放置一个切片。称量含有组织样本的离心管以确定样本重量，并记录重量。为进行基于水的组织样本匀浆，向含有组织样本的 2 毫升微量离心管中加入一颗 5 毫米不锈钢珠。制备一根含有液相色谱-质谱级水的空白管。加入预冷的液相色谱-质谱级水，将体积补足至每50毫克样品500微升，然后在25赫兹条件下均质化样品3分钟。样品应充分均质。取均质化后体积的十分之一用于DNA提取及其他分析。向匀浆液中加入预冷的液相色谱-质谱级甲醇，甲醇中添加有4 µM的磺胺氯哒嗪。在组织匀浆机中以25赫兹频率匀浆3分钟，随后离心10分钟。将等体积的上清液收集至96孔板中，并在收集上清液期间将沉淀物置于冰上保存。使用最大转速且不加热，将水相提取上清液完全干燥。通过加入1,000微升预冷的二氯甲烷-甲醇混合液进行有机相提取，该混合液中添加有每50毫克固体残留样品加入两微摩尔的磺胺氯哒嗪。在25赫兹条件下均质化样品5分钟，随后离心10分钟。取等体积上清液加入96孔板中。拍摄目标器官的图像。在SketchUp软件中，点击文件，然后选择导入，以导入目标器官的图片。单击线条工具并选择手绘模式。使用铅笔工具描出并绘制出目标器官的轮廓。选择推/拉工具，向上拉动阴影区域，将图形从二维转换为三维。单击“文件”→“导出”，然后选择“3D 模型”，以 dae 格式导出文件。为提高模型的真实感，选择“文件”菜单，单击“导入网格”，将模型导入 MeshLab 软件中。在顶部菜单中选择“线框”，然后选择“滤镜”，单击“重新网格化、简化与重建”，再选择“细分曲面中点”。保持所有参数为默认值，并连续选择“应用”两次。点击“文件”，然后选择“另存为网格”，在“文件类型”下拉菜单中选择 SDL 文件格式，以 sdl 格式导出模型。保存文件后，在下一个弹出菜单中选择“确定”。打开 Meshmixer 软件，导入上一步生成的 sdl 文件。使用雕刻工具、画笔、龙形雕刻画笔和膨胀工具，将需要圆润化的模型表面拉出。当模型达到理想外观后，点击文件（File）并选择导出（Export），以 sdl 格式保存。根据需要命名文件，选择 SDL 二进制格式并保存。在 MeshLab 软件中打开该 3D 模型。在打开后的处理弹窗中点击“确定”。通过选择“拾取点”工具，然后在3D模型表面以规则间隔右键单击，获取每个采样点的X、Y和Z坐标。当所有目标坐标选取完毕后，点击表单弹出窗口中最上方的“保存”按钮。在电子表格软件中打开上一步生成的pp文件。通过点击“数据”选项卡中的“分列”，然后选择“分隔符号”，点击“下一步”，选择“空格”作为分隔符，最后点击“完成”来调整数据显示。随后，通过选择“开始”选项卡中的“查找和选择”功能，点击“替换”，将非数值内容清除，使电子表格单元格中仅保留数值。在“查找内容”框中输入 Y 等于 coat，将“替换为”框留空，然后点击“全部替换”，再点击“确定”。依次对 X 等于 coat、Z 等于 coat 以及 coat 斜杠大于 进行相同操作。在电子表格软件的表格中，每一行对应一个位置，每一列对应一项数据。在后续的电子表格列中粘贴相应的元数据和代谢物特征丰度。在半径列中，输入要在模型上可视化的采样点的期望尺寸。通过实验确定半径的数值，并将文件保存为 CSV 格式。进入 ELI Plot 软件，选择“Surface”，然后将生成的 3D 模型拖放到浏览器窗口中。将生成的特征表拖放到同一个浏览器窗口中。使用右下角的图例将所需的数据列投影到 3D 模型上。依次选择每个数据列，以评估该代谢物特征在3D模型上的分布情况。该分析生成了一个包含5,502个特征的表格，并实现了其在3D模型中的可视化。该方法能够可视化单个动物体内寄生虫负荷较高区域富集的代谢物特征、在不同组织区域间分布存在差异的代谢物，以及在小肠和大肠中含量水平相近的代谢物特征。必须注意仅使用液相色谱-质谱（LCMS）级溶剂，并收集所有邻近组织，提取所采集样本的全部代谢物，以避免空间分布图中出现数据空白。该技术可用于研究锥虫科寄生虫在组织定植过程中的营养需求，通过比较感染后三维代谢物分布图，进而理解疾病发病机制。

chemical-cartography-approaches-to-study-trypanosomatid-infection

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

化学制图方法研究锥虫感染

本文描述了利用一种生物发光的非洲锥虫株系来追踪晚期感染，并展示了如何 体内...

利用生物发光成像检测非洲锥虫病晚期感染

利用磁激活细胞分选与流式细胞术检测Trypanosoma brucei变异表面糖蛋白的转换

在本方案中，使用荧光标记的 T. cruzi 被注入透明的斑马鱼幼鱼体内，并观察了寄生虫的运动性 体内...

建立幼体斑马鱼作为研究动物模型 克氏锥虫 运动性 在体 内

的 克氏锥虫 恰加斯病的病原体可引起长期无症状感染，随后突然发展为临床上可识别的病理状态。以下研究方案描述了一项短期的基于家庭的流行病学研究，旨在揭示 T. cruzi...

雄性和雌性美洲锥虫向未感染配偶的性传播

这种从血液中分离锥虫的方法依赖于锥虫表面电荷的负电性低于哺乳动物血细胞。将感染的血液置于阴离子交换柱上进行处理。该方法是非洲锥虫病最适宜的诊断手段，可提供纯净的寄生虫，用于免疫学、生物学、生物化学、药物学和分子生物学研究。...

利用阴离子交换剂（二乙氨基乙基-纤维素柱）从血液中纯化细胞外锥虫（包括非洲锥虫）

本实验方案描述了光片荧光显微镜结合自动化软件辅助的方法，用于在完整且已透明化的器官和组织中可视化并精确定量增殖态与休眠态的Trypanosoma...

完整透明器官中克氏锥虫感染细胞、休眠型无鞭毛体及T细胞的定量三维成像

本研究展示了一种详细的三相超结构扩展显微镜操作方案 体外 生活史阶段 克氏锥虫，恰加斯病的病原体。我们包含了细胞骨架蛋白和全蛋白质组标记的优化技术。...

体外生命周期三个阶段的克氏锥虫超微结构膨胀显微技术

利用低代码人工智能平台，通过简单步骤实现了对全球医学血液寄生虫的自动筛查。采用混合深度学习模型中的目标检测与分类方法，提高了血涂片的前瞻性诊断能力。主动监测与训练有素的模型相结合，有助于识别锥虫传播的热点区域。...

利用混合深度学习模型实现锥虫寄生虫的高效自动识别

我们描述了一种研究非洲锥虫血液形态中糖酵体的pH值如何响应环境刺激的方法。该方法结合了一种对pH敏感的可遗传蛋白传感器和流式细胞术，可用于测量pH动态变化，既可进行时间过程检测，也可用于高通量筛选。...

测量活体中动态的糖体pH变化 布氏锥虫

本方案详细描述了在Trypanosoma...

揭示用于药物疗效研究的恰加斯病小鼠模型体内生物发光成像

学习化学制图方法构建锥虫感染期间代谢物与寄生虫分布的三维模型，利用LCMS级溶剂提取代谢物并通过SketchUp和MeshLab软件进行数据可视化。该技术有助于深入理解宿主与病原体在代谢水平上的相互作用机制。

研究锥虫感染的化学图谱学方法

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