光控发酵用于微生物化学品与蛋白质生产

与传统的诱导方法相比，光遗传学已被用于提高多种化学品和蛋白质的产量。通过本方案，其他研究人员可在自身工艺中引入光控手段以实现优化。光遗传学控制具有非侵入性、高度可调性和可逆性。

这些特性有助于简化微生物过程的优化，甚至开辟了独特的机会，例如三相发酵和多色控制。对于任何新化合物，其最佳光照条件可能各不相同。因此，若使用本方案中的参数观察到产量较低时，应测试不同的光照条件。

首先获取一株具有组氨酸营养型（HIS3 oxytrophy）的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株，该标记是OptoINVRT质粒所必需的。若目标是调控酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）内源基因，则需在开始前确保该基因的内源拷贝已被敲除。开始构建菌株时，线性化含有OptoINVRT7回路的质粒，例如EZL439。

若使用含有在光照下抑制PIGA启动子、在黑暗中激活该启动子元件的EZL439，需在PmeI限制性位点处进行线性化。采用标准的乙酸锂转化方法，将质粒整合至HIS3营养缺陷型菌株中。转化完成后，以150 × g离心细胞1分钟。

在 200 微升新鲜的 SC-HIS 培养基中轻柔重悬细胞。将全部细胞体积接种至 SC-HIS 琼脂平板上，在 30 °C 下培养两到三天，直至菌落出现。使用标准的醋酸锂转化方法制备感受态细胞。

将含有目的基因的质粒转化至细胞中，这些基因需位于PIGA1M或PIGA1S启动子的下游以实现光遗传学控制。转化后，以150 ×g离心培养物1分钟，轻轻重悬细胞沉淀于200 µL新鲜的SC缺失培养基中。若为整合至Delta位点，则将全部细胞悬液涂布于酵母提取物蛋白胨葡萄糖琼脂平板；若为转化含有筛选标记的质粒，则涂布于SC缺失平板。

在持续蓝光照射下，将细胞于 30 °C 培养 16 小时，以保持光遗传学控制的基因处于抑制状态。使用波长为 465 纳米的任意光源，并将 LED 面板放置在培养板上方约 40 厘米处，使光照强度约为 80 至 110 µmol/(m²·s)。使用量子计测量光照强度。

若需整合到Delta位点，将平板复制到含有400至1,200微克/毫升Zeocin浓度梯度的酵母提取物蛋白胨葡萄糖平板上，以筛选不同拷贝数的整合子。将复制平板在30°C下于持续或脉冲蓝光条件下培养两至三天，直至菌落出现。进行初步筛选时，从每个平板中选取八个菌落，分别接种于24孔板的各个孔中，每孔含1毫升添加2%葡萄糖的SC-HIS培养基。

在30 °C、200 转/分钟振荡条件下，于持续蓝光照射下过夜培养细胞。次日，将每种培养物用含2%葡萄糖的新鲜SC-HIS培养基稀释，使在600 纳米处的光密度值达到0.01至0.3，然后在30 °C、200 转/分钟振荡条件下，于持续或脉冲光照下继续培养，直至光密度达到2至9。随后，用铝箔包裹培养板，关闭光源面板，并在30 °C、200 转/分钟振荡条件下避光孵育4小时。

将24孔板中的培养物在234 ×g下离心5分钟，并用1毫升含2%葡萄糖的新鲜合成完全缺失培养基重悬细胞。使用无菌微孔板封膜密封孔板，以防止目标产物蒸发。将密封后的孔板置于30 °C、200 rpm条件下避光振荡发酵48小时。

为了收集发酵产物，将培养板在234 ×g 条件下离心5分钟，并将800 µL上清液转移至1.5 mL微量离心管中。根据目标化合物的不同，采用高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法或其他分析方法进行检测，样品前处理技术应根据所用仪器选择最适宜的方法。从每块平板上挑选八个菌落，用于接种含有2%葡萄糖的1 mL SC-HIS培养基，分别接种于24孔板的独立孔中。

将细胞在黑暗条件下于30 °C、200转/分钟振荡培养过夜。次日早晨，用含2%葡萄糖的新鲜SC-HIS培养基将每种培养物稀释至0.1的光密度。用铝箔纸包裹培养板以避免光照，并将培养物在黑暗条件下于30 °C、200转/分钟振荡培养，直至光密度达到3。

然后，在30°C、200转/分钟振荡条件下，将培养板置于脉冲光下孵育12小时。在234 ×g下离心培养物5分钟，并用含2%葡萄糖的新鲜SC-HIS培养基重新悬浮。使用无菌微孔板封板膜密封培养板，以防止目标产物蒸发。

将密封的培养板在30摄氏度、200转/分钟的摇床条件下光照发酵48小时。在完成光遗传发酵后，使用两种电路在诱导时的不同细胞密度范围内检测了化学品的产量。OptoINVRT7电路在诱导细胞密度最适值为7.0和8.75时，乳酸和异丁醇的产量显著高于OptoINVRT1和OptoINVRT2电路。

使用OptoAMP电路的发酵实验分为三个阶段进行研究，各阶段由不同的光照占空比定义。乳酸生产可通过脉冲式生长阶段以及完全光照的诱导和生产阶段进行优化。异丁醇生产则通过脉冲式生长阶段、完全光照的诱导阶段以及脉冲式生产阶段实现优化。

相比之下，柚皮素的生物合成通过采用脉冲式生长、完全光照诱导和黑暗生产阶段的策略实现了最佳优化。OptoLAC系统已在大肠杆菌（E. coli）中用于生产转录因子FDER，其滴度达到或超过了使用化学诱导剂IPDG所获得的水平。OptoLAC电路已被应用于甲羟戊酸的生产，其产量超过了使用IPDG诱导所达到的滴度。

在生物反应器水平上进行甲羟戊酸的生产，展示了光遗传调控在细菌中进行化学品和蛋白质生产方面的可扩展性和可调性，超越了微孔板水平的应用。必须确保光照强度处于光照步骤所需的适当范围内，并避免需要黑暗条件的步骤受到光污染。该技术为实现酵母中异丁醇的最高滴度、利用光稳定共培养体系的种群，甚至通过合成的光控细胞器调控代谢通量铺平了道路。