Name: 微流体声导术，使用适配子亲和磁珠对革兰氏阴性菌进行流式分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: 了解微流体声导术技术，利用适配子亲和磁珠实现革兰氏阴性菌的高效分离。该方法适用于医学和环境样本，具有高通量、非接触式分离的优势，为细菌检测提供可靠方案。

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本工作由韩国政府（科学技术信息通信部）资助的韩国国家研究基金会（NRF）项目支持。（项目编号：NRF-2021R1A2C1011380）

1. 微流控声泳芯片设计
注意：图1 展示了通过声泳法从微通道中分离和收集目标微珠的示意图。微流控声泳芯片使用CAD程序设计。
<ol>
	<li>设计一种微流控声泳芯片，该芯片使用适配体修饰的微珠与对应于细菌尺寸的链霉亲和素包被的聚苯乙烯（PS）微珠的混合物，以研究该装置的分离性能。</li>
	<li>设计一种微流控声泳芯片，在将PS样品混合物注入样品入口后，能够将PS微珠收集至目标出口，其余组分则通过废液出口排出（参见图2和Table 1）。 
	注：为此目的，声流控芯片设计包含两个用于注入样品和缓冲液的入口、一个主通道以及附着的压电换能器（PZT），以实现微珠在通道中心的聚焦排列，同时设有两个出口用于收集目标样本并排出废液（图3A）</li>
	<li>设计一种微流控声泳芯片，使微珠、缓冲液、细菌和适配体共同流经主通道，并通过PZT诱导的片上声泳效应使微珠在通道中心对齐（图3B、C）</li>
</ol>
2. 微流控声泳芯片的制备
注意：按照以下顺序组装四层结构：硼硅酸盐玻璃-硅层、硅层、硼硅酸盐玻璃层和PZT层，如图3A、B所示。
<ol>
	<li>使用喷砂法17在硼硅酸盐玻璃（最上层）的入口和出口处制备直径为 2 mm 的孔，用于连接聚醚醚酮（PEEK）管。硼硅酸盐玻璃的尺寸为 20 × 80 × 0.5 mm3。</li>
	<li>准备一层厚度为 200 µm 的硅通道层，该层通过光刻胶和深反应离子刻蚀（RIE）获得的硅图案形成横截面积为 0.2 × 0.2 mm2 的微通道18。在反应离子刻蚀过程中，为样品和缓冲液入口通道以及收集和废液出口通道钻出直径为 1 mm 的孔。 
	注意：此处离子刻蚀采用 RIE 工艺来形成微通道。在硅片上涂覆呈通道形状的光刻胶以制备硅通道层。将涂有光刻胶的硅片置于等离子体中进行刻蚀，等离子体通过向氟气施加 13.56 MHz 的频率产生18。</li>
	<li>将步骤 2.2 中制备的硅层（20 × 80 × 0.5 mm3）上下各贴合一层相同尺寸（20 × 80 × 0.5 mm3）的硼硅酸盐玻璃层，并在 1,000 V 和 400 °C 条件下通过阳极键合工艺与步骤 2.1 中的硼硅酸盐玻璃层结合，形成芯片结构19。</li>
	<li>使用氰基丙烯酸酯胶粘剂（10 µL 或更少）将压电陶瓷（PZT，20 × 40 mm2）沿微流控通道方向粘附至硼硅酸盐玻璃层上。 
	&#8203;注意：使用棉签将胶粘剂以极薄的一层涂布于通道区域，以尽量减少高度变化。图 3C 为该装置的照片。</li>
</ol>
3. 细菌菌株与培养
注意：请参考表2选择并培养革兰氏阴性（GN）和革兰氏阳性（GP）细菌用于实验。培养方法参见步骤3.1–3.4。所有细菌均需在有氧条件下培养，直至在600 nm处的吸光度达到0.4（OD600）。
<ol>
	<li>对于革兰氏阴性菌（GN细菌），例如 大肠杆菌 DH5α, 大肠杆菌 KCTC2571 Sphingomonas insulae，以及 Pseudomonas pictorum&#160;以及革兰氏阳性菌（GP细菌），例如&#160;表皮葡萄球菌&#160;和&#160;Staphylococcus pasteuri在LB培养基中，37 °C、220 rpm条件下振荡培养16小时。</li>
	<li>对于 肠杆菌属 （GN）和 巨大芽孢杆菌 （GP；KCTC 1021），在37 °C、220 rpm条件下于营养肉汤培养基中培养16 h。</li>
	<li>对于 Enterococcus thailandicus （GP），在37 °C、220 rpm条件下于脱脂乳、罗戈萨和夏普（MRS）培养基中孵育16小时。</li>
	<li>对于 Listeria grayi （GP），在37 °C、220 rpm条件下于脑心浸液培养基中孵育16小时。</li>
	<li>离心机（9056 × g） g在室温（RT）下将培养的细菌处理1分钟，然后用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次。</li>
	<li>将所选的革兰氏阴性（GN）和革兰氏阳性（GP）细菌重悬于PBS缓冲液中，以备分析。</li>
</ol>
4. 微珠及适配体在微珠上的固定
<ol>
	<li>使用前将链霉亲和素包被的微珠（10 µm）混合物（材料表）重新悬浮（通过涡旋混合20秒）。</li>
	<li>将适配体在95 °C下变性3分钟，然后在0 °C下复性2分钟，以进行制备。</li>
	<li>将250 µL重悬的链霉亲和素包被微珠混合物转移至1.5 mL离心管中，用Tris-HCl缓冲液（50 mM Tris，pH 7.4，1 mM MgCl2，5 mM KCl，100 mM NaCl）在室温下洗涤。然后向管中加入100 µL生物素标记的DNA适配体。</li>
	<li>在室温下旋转孵育（25 rpm）30分钟。</li>
	<li>离心（9056 × g）后，在室温下用200 µL Tris-HCl缓冲液洗涤管壁两次。</li>
	<li>向洗涤后的样品管中加入10 µL BSA（100 mg/mL），在室温下旋转（25 rpm）孵育30分钟。</li>
	<li>最后，通过离心（9056 × g）在室温下用Tris-HCl缓冲液洗涤适配体修饰的微珠两次。</li>
</ol>
5. 声泳装置的设置与操作
<ol>
	<li>将PEEK管连接至两个用于注入样品和缓冲液的入口，以及两个用于收集和排放废液的出口（图4）。</li>
	<li>使用10 mL注射器手动将无气泡的去离子水注入微流控声泳通道中。</li>
	<li>准备一个具有两个或更多输出通道的精密压力控制器以控制流体流动。然后，分别将样品和缓冲液注入带有两个孔的瓶盖的样品瓶和缓冲液瓶中，并连接至芯片入口。 
	注意：具有两个或以上输出通道的精密压力控制器可用多个精密压力控制器替代。在缓冲液入口处，通过流量控制器注入能够产生层流的缓冲液，以防止样品注入过程中样品向通道中心移动。</li>
	<li>设备准备完成后，使用精密压力控制装置在样品入口施加2 kPa压力，在缓冲液入口施加4 kPa压力，以注入样品和缓冲液。 
	注意：此时，为了实现平稳的层流，缓冲液的注入压力应高于样品的注入压力。流速由固定在连接至入口通道的吸液装置上的流量控制器控制。</li>
	<li>通过显微镜观察，同时利用PZT调节使某一微珠聚焦并移动至微流控通道的中心位置。 
	注意：微珠尺寸越大，对声波波形的影响越显著，因此更容易与波节对齐。函数发生器配合放大器向PZT供电，在微通道内产生正弦波。由于微通道上下部分由玻璃制成，产生的正弦波会被反射，从而形成波节7。</li>
	<li>使用单通道函数发生器产生3.66 MHz的共振频率，并通过功率放大器将信号放大16 dB（约9倍）（图4）。 
	注意：驱动器的共振频率必须与通道尺寸匹配；由于通道为方形结构，PZT需在精确频率下工作以形成单一波节。</li>
	<li>使用荧光显微镜和以1,200 fps运行的高速相机观察声流控芯片上的分离与富集过程。</li>
	<li>通过检查荧光显微镜相机拍摄的与细菌结合的微珠图像，以及从收集口和废液口排出的样品中的细菌图像，定量分析革兰氏阴性菌（GN细菌）和革兰氏阳性菌（GP细菌）的存在与否。 
	注意：含有缓冲液、细菌和适配体的微珠流经主通道，微珠在PZT诱导的芯片内声泳作用下被集中至通道中央。最终，结合了GN细菌的微珠从收集出口被收集，未被捕获的细菌则通过废液出口排出。</li>
</ol>

<ol><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustofluidic+separation+of+cells+and+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Microsystem+%26+Nanoengineering%22%5BJournal%5D)">Acoustofluidic separation of cells and particles.</a> Microsystem & Nanoengineering. 5 (1), 1-18 (2019).</li>
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<li>Kim, U., Soh, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+sorting+of+multiple+bacterial+targets+using+integrated+Dielectrophoretic-Magnetic+Activated+Cell+Sorter%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Simultaneous sorting of multiple bacterial targets using integrated Dielectrophoretic-Magnetic Activated Cell Sorter.</a> Lab on a Chip. 9 (16), 2313-2318 (2009).</li>
<li>Cai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluidic+device+for+immunomagnetic+separation+of+foodborne+bacteria+using+self-assembled+magnetic+nanoparticle+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">A fluidic device for immunomagnetic separation of foodborne bacteria using self-assembled magnetic nanoparticle chains.</a> Micromachines. 9 (12), 624(2018).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

我们开发了一种基于连续运行方法的声悬浮微流控装置，可根据革兰氏阴性菌（GN细菌）的尺寸、类型以及适配体修饰的微珠，实现从培养样品中高速捕获和转移细菌。该装置采用长方形微通道，相较于以往报道的二维声泳技术20,21,22,23,24,25,26，具有更简化的结构设计和更高的成本效益。该装置在最高达10倍剂量浓度条件下，回收率可达&#62;98%。本研究在细菌分离方面表现出高于现有无标记方法20,21,22<...

除了基于介电转移、磁泳、微珠提取、过滤、离心微流控、惯性效应以及表面声波的方法外，微流控平台也正在被开发用于从医学和环境样本中分离细菌1,2。&#160;对致病菌的检测通常采用聚合酶链式反应（PCR）进行，但该方法通常耗时较长、操作繁琐且复杂3,4。微流控声泳系统为解决这些问题提供了替代方案，具有适中的通量和非接触式细胞分离的优势5,6,7。声泳是一种利用声波引起物质移动现象来分离或富集微珠的技术。当声波进入微通道时，微珠会根据其尺寸、密度等特性被分选，同时细胞也可依据悬浮介质的生化和电学特性实现分离7,8。因此，近年来已有大量关于声泳的研究被积极展开9,10,11，并且最近已提出一种基于驻波表面声波微流控中边界驱动声流所诱导的声泳运动的三维数值模拟方法12。
多个研究领域正在探索如何替代抗体2,3。适配体是一种具有高选择性和特异性的靶向分子，目前已有大量相关研究2,9,10,13。与抗体相比，适配体具有分子量小、生物稳定性好、成本低和可重复性高等优势，现正被广泛应用于诊断和治疗领域的研究中2,3,14。
本文介绍了一种微流控声泳技术方案，可用于利用适配体修饰的微珠快速、高效地从培养基中分离革兰氏阴性（GN）细菌。该系统通过单一压电驱动，同时激发长方形微通道内两个正交的共振模式，产生二维（2D）声驻波，使结合了适配体的微珠在波节和波腹位置排列并聚焦，从而提高分离效率2,11,15,16&#160;。在入口和出口处均设有分叉通道，可实现分离、纯化和浓缩的同步进行。
该方案可有助于细菌性传染病的早期诊断领域，以及通过实时水质监测对致病性细菌感染作出快速、选择性和高灵敏度的响应。

<table><tbody><tr><td>1 &amp;micro;m 聚苯乙烯微珠</td><td>Bang Laboratories</td><td>PS04001</td><td>细胞尺寸微珠</td></tr><tr><td>10 &amp;micro;m 链霉亲和素包被微珠</td><td>Bang Laboratories</td><td>CP01007</td><td>适配体亲和微珠</td></tr><tr><td>4英寸硅片/SU-8模具</td><td>4science</td><td>29-03573-01</td><td>芯片组件</td></tr><tr><td>适配体</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>GN3-6'</td><td>用于细菌偶联的RNA</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃</td><td>Schott</td><td>BOROFLOAT 33</td><td>芯片组件</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Daihan</td><td>CF-10</td><td>洗涤颗粒</td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯胶水</td><td>3M</td><td>AD100</td><td>将PZT粘附至微芯片</td></tr><tr><td>大肠杆菌 DH5&amp;alpha;</td><td>KCTC</td><td>KCTC2571</td><td>目标细菌</td></tr><tr><td>函数发生器</td><td>GW Instek</td><td>AFG-2225</td><td>生成频率</td></tr><tr><td>高速相机</td><td>Photron</td><td>FASTCAM Mini</td><td>分离过程观察</td></tr><tr><td>加热板</td><td>As one</td><td>HI-1000</td><td>用于液态PDMS固化的加热板</td></tr><tr><td>KOVAX-SYRINGE 10 mL 注射器</td><td>Koreavaccine</td><td>22G-10ML</td><td>用无气泡去离子水填充微流控声泳通道</td></tr><tr><td>液态聚二甲基硅氧烷（PDMS）</td><td>Dow Corning Inc.</td><td>Sylgard 184</td><td>芯片组件</td></tr><tr><td>LB肉汤（Miller培养基）</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td>细胞培养（Luria-Bertani培养基）</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Olympus Corp.</td><td>IX-81</td><td>分离过程观察</td></tr><tr><td>PBS缓冲液</td><td>Capricorn scientific</td><td>PBS-1A</td><td>洗涤细菌</td></tr><tr><td>PEEK管</td><td>Saint-Gobain Ppl Corp.</td><td>AAD04103</td><td>注入或收集颗粒</td></tr><tr><td>压电换能器</td><td>Fuji Ceramics</td><td>C-213</td><td>在通道中产生特定波形</td></tr><tr><td>功率放大器</td><td>Amplifier Research</td><td>75A250A</td><td>放大频率</td></tr><tr><td>压力控制器/&amp;mu;flucon</td><td>AMED</td><td>AMED-&amp;mu;flucon</td><td>气压/流量控制装置</td></tr><tr><td>Tris-HCl缓冲液</td><td>invitrogen</td><td>15567027</td><td>洗涤颗粒</td></tr><tr><td>管式旋转仪</td><td>SeouLin Bioscience</td><td>SLRM-3</td><td>修饰适配体与微珠</td></tr></tbody></table>

基于适配体亲和微珠的微流控声泳技术用于革兰氏阴性菌的流通式分离

Microfluidic Acoustophoresis for Flowthrough Separation of Gram-Negative Bacteria using Aptamer Affinity Beads

本文介绍了一种利用微流控声泳技术及适配体修饰的微珠，用于从培养基中快速、高效分离革兰氏阴性菌的微流控声泳芯片的制备与操作方法。该方法通过结合长方形微通道结构，提高了分离效率。在该系统中，样品和缓冲液通过流量控制器注入入口端口。为实现微珠的居中定位和样品分离，通过信号发生器和功率放大器向压电换能器施加交流电，从而在微通道内产生声辐射力。芯片在入口和出口处均设有分叉通道，可同时实现分离、纯化和浓缩。该装置的回收率超过&gt;98%，纯度可达10倍浓度剂量下的97.8%。本研究展示的回收率和纯度均高于现有细菌分离方法，表明该装置能够高效分离细菌。

图5 显示了微珠流动图像随压电陶瓷（PZT）电压（关闭、0.1 V、0.5 V、5 V）变化的情况。在本研究介绍的声泳芯片中，随着PZT电压的增加，10 µm大小微珠在通道中心的富集程度也随之增加。在PZT电压为5 V时，大部分10 µm大小的微珠均集中于通道中央。通过该结果，在单通道函数发生器中产生了3.66 MHz的共振频率，并使用功率放大器将信号放大了16 dB（约9倍）。
表3显示了将1 µm（细胞大小）和10 µm（适配体结合微珠）的混合微珠注入本研究所用的声流控芯片后，芯片在不同出口流速（400、450 和 475 µL/min）下的分离性能评估结果。回收率是指在出口收集到的10 µm微珠数量与注入的总微珠数量之比，分别为98% ± 2.2%、98% ± 2.5% 和 90% ± 9.8%。纯度是指收集到的微珠中10 µm微珠所占的比例，分别为97.1% ± 3.6%、97.6% ± 2.4% 和 99.4% ± 0.6%。这表明该装置对尺寸为10 µm的微珠具有较高的分离效率...

本文介绍了利用微流控声泳技术以及适配体修饰的微珠，制备和操作微流控声泳芯片的方法，该芯片可用于从培养基中快速、高效地分离革兰氏阴性菌。

本文描述了利用微流控声致泳技术制造和操作微流控声致泳芯片的方法及……

本方案介绍了我们的微流控声泳技术，该技术可用于利用适配体修饰的微珠从培养基中快速、高效地分离革兰氏阴性菌。微流控声泳系统能够以合理的通量实现非接触式的细胞分离，从而分离革兰氏阴性菌。该技术可进一步优化，用于从医学和环境样本中分离细菌。首先，设计一种微流控声泳芯片，当将聚苯乙烯（PS）样品混合物注入样品入口后，该芯片可将PS微球收集至目标出口，其余组分则被弃去。制备芯片时，将硅层上下两层与硼硅酸盐玻璃键合，并通过阳极键合工艺添加第三层硼硅酸盐玻璃层，施加1000伏电压和400摄氏度条件。使用少于10微升的氰基丙烯酸酯粘合剂将PZT沿微流控通道固定在硼硅酸盐玻璃层上。将革兰氏阴性菌（GN）和革兰氏阳性菌（GP）接种于Luria-Bertani培养基中，在37°C、220转/分钟条件下培养16小时。将培养后的细菌在室温下以9,056 ×g离心1分钟。然后用1× PBS缓冲液洗涤两次。通过将所选的革兰氏阴性（GN）和革兰氏阳性（GP）细菌重悬于结合缓冲液中，制备用于分析的细菌悬液。使用前将10微米的链霉亲和素包被磁珠混合物充分重悬。将混合物涡旋振荡20秒。通过在95摄氏度下变性3分钟，然后在0摄氏度下复性2分钟，制备适配体。取250微升重悬的链霉亲和素包被的微珠混合液转移至1.5毫升离心管中，并向管中加入100微升生物素标记的DNA适配体。将混合物在室温下孵育30分钟，同时以每分钟25转的速度旋转。在室温下以9,056 RCF离心反应混合物40秒。然后用200微升Tris-HCl缓冲液洗涤管壁两次。向洗涤后的样品管中加入 10 微升浓度为 100 毫克/毫升的 BSA，于室温下旋转孵育 30 分钟，转速为每分钟 25 转。最后，用 Tris-HCl 缓冲液洗涤经适配体修饰的微珠两次，每次在室温下以 9,056 RCF 离心 40 秒。将 PEEK 管连接至两个用于注入样品和缓冲液的进样口，以及两个用于收集流出液和排放废液的出样口。使用一个10毫升的注射器，将无气泡的去离子水注入微流控声泳通道中。准备一个具有两个或更多输出通道的精密压力控制器，以控制液体流动。设备准备就绪后，使用精密压力控制装置，在样品入口施加2千帕的压力，在缓冲液入口施加4千帕的压力，从而注入样品和缓冲液。使用显微镜聚焦于微流控通道中的微珠，并利用压电陶瓷（PZT）将其移动至通道中心。通过单通道信号发生器产生 3.66 兆赫兹的共振频率，并使用功率放大器将典型信号放大 16 分贝。使用荧光显微镜和以每秒 1,200 帧运行的高速相机，观察声流控芯片上的分离与富集过程。本研究中介绍的声泳芯片证实，随着PZT电压的增加，10微米大小微珠的中心浓度也随之增加。当PZT电压为5伏时，大部分10微米大小的微珠被富集在中心区域。出口处收集到的微珠数量与注入的10微米大小微珠总数之比称为回收率。收集到的10微米大小微珠数量与收集到的微珠总数之比称为纯度。结果表明，该装置对尺寸为10微米的微珠具有较高的分离效率。使用配备高速相机的显微镜测量了每种经适配体修饰的微珠上结合的革兰氏阴性菌（GN）和革兰氏阳性菌（GP）的数量。所有五种革兰氏阴性菌均与磁珠结合，而革兰氏阳性菌与所测试物质的结合量显著较少。革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌之间的信号强度存在显著差异。用于固定PZT的粘合剂应尽可能少使用，以确保波纹度的准确性，且PZT与微通道应保持平行。该设备可用于在细菌感染性疾病的早期诊断阶段检测活菌或细菌来源的生物标志物。

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来源：Choi, H. J., et al. 利用适配体亲和微珠通过微流控声泳实现革兰氏阴性菌的流通分离。J. Vis. Exp.

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