微流体声导术，使用适配子亲和磁珠对革兰氏阴性菌进行流式分离

该协议描述了我们的微流体声电渗疗法技术，该技术可用于使用适配体修饰的微珠从培养基中快速有效地分离革兰氏阴性细菌。微流体声电渗疗法系统能够以合理的通量和非接触式细胞分离进行革兰氏阴性细菌分离。可以优化微流体声电渗疗法，以从医学和环境样本中分离细菌。

首先，设计一个微流体声电渗疗法芯片，该芯片在目标出口收集PS磁珠，并在将PS样品混合物注入样品入口后丢弃其余珠子。准备一个芯片，将硅层上方和下方的层粘合到硼硅酸盐玻璃上。第三层硼硅酸盐玻璃层使用阳极氧化，添加 1000 伏和 400 摄氏度。

使用少于 10 微升的氰基丙烯酸酯粘合剂沿微流体通道将 PZT 连接到硼硅酸盐玻璃层上。将 GN 和 GP 细菌接种在 Luria-Bertani 培养基中，并在 37 摄氏度和每分钟 220 转下孵育 16 小时。在室温下将培养的细菌在9， 056 RCF下离心一分钟。

然后用1X PBS缓冲液洗涤两次。通过将选定的GN和GP细菌重悬于结合缓冲液中来制备它们进行分析。使用前重悬10微米链霉亲和素包被的微珠混合物。

将混合物涡旋20秒。通过在 95 摄氏度下变性三分钟，然后在零摄氏度下重新折叠两分钟来制备适配体。将250微升重悬的链霉亲和素包被微珠混合物转移到1.5毫升管中，并向管中加入100微升生物素化DNA适配体。

将混合物在室温下孵育30分钟，同时以每分钟25转的速度旋转。将反应混合物在室温下以9， 056 RCF离心40秒。然后用200微升Tris-HCl缓冲液洗涤试管两次。

向洗涤的样品管中加入10微升每毫升100毫克BSA，并在室温下孵育30分钟，同时以每分钟25转的速度旋转。最后，通过在室温下以9， 056 RCF离心40秒，在Tris-HCl缓冲液中洗涤核酸适配体修饰的微珠两次。将PEEK管连接到两个入口，用于注入两个样品和缓冲液，以及两个用于收集和排出废物的出口。

使用10毫升注射器，用无气泡软化水填充微流体声电渗疗法通道。准备具有两个或更多输出通道的精密压力控制器来控制流体流量。准备好设备后，使用精密压力控制装置向样品入口施加 2 千帕斯卡的压力，向缓冲液入口施加 4 千帕的压力，从而注入样品和缓冲液。

使用显微镜，聚焦在珠子上，并使用PZT将其移动到微流体通道的中心。使用单通道函数发生器产生 3.66 兆赫兹的谐振频率，并使用功率放大器将典型信号放大 16 分贝。用荧光显微镜和以每秒1， 200帧的速度运行的高速相机观察声流体芯片上的分离和富集过程。

本研究中引入的声电芯片证实，随着PZT电压的增加，10微米尺寸磁珠的中心浓度增加。在 PZT 电压的 5 伏电压下，大部分 10 微米大小的磁珠集中在中心。在出口处收集的磁珠数量与注入的10微米尺寸磁珠总数的比率称为回收率。

10微米大小的珠子数量与收集的珠子总数之比称为纯度。结果表明，该装置对10 μm尺寸的磁珠具有较高的分离效率。使用带有高速相机的显微镜测量与每个适配体修饰微珠结合的GN和GP细菌的数量。

所有五种GN细菌都与磁珠结合，而与测试物质结合的GP细菌明显较少。GN和GP细菌之间的信号强度差异显着。用于连接PZT的粘合剂应尽可能少地使用，以确保波纹精度，并且PZT和微通道应平行。

该设备可用于在细菌感染性疾病早期诊断期间检测活细菌或细菌衍生的生物标志物。