使用透射电子显微镜定量骨骼肌纤维中的亚细胞糖原分布
2022年2月7日
改进的固定后程序增加了组织中糖原颗粒的对比度。本文提供了一个分步方案，描述了如何处理组织，进行成像，并使用立体学方法获得骨骼肌中纤维类型特异性亚细胞糖原分布的无偏和定量数据。
单细胞和亚细胞组织中糖原含量的测量很重要，因为在大多数细胞类型中，单细胞对不断变化的生理条件和疾病的适应方式不同。因此，这种技术的主要优点是透射电子显微镜的分辨率非常高。这提高了具有局部亚细胞结构的可能性，并且在此技术中的这种含量中，糖原染色是无抗体的，这一点很重要。
因此，我们没有任何具体问题需要担心。为了获得更好的糖原对比度，只需使用1.5%亚铁氰化钾代替亚铁氰化钾。通过在2毫升微量离心管中0.1摩尔二甲羟丁酸钠缓冲液中加入2.5%戊二醛来制备1.6毫升初级固定溶液。
将其储存在5摄氏度下，最多14天。从肌肉活检或整个肌肉中分离出一个小样本，该标本在任何方向上的最大直径为一毫米，并且纵向长于横截面。将试样放入含有冷初级固定溶液的管中。
将其储存在5摄氏度下24小时。然后在0.1摩尔二甲酸钠缓冲液中洗涤标本四次。使用转印移液器，从试管中取出用过的缓冲液，使试样保持原样不变，然后加入新鲜的缓冲液。
用1%四氧化锇和1.5%亚铁氰化钾在0.1摩尔二甲苯二酸钠缓冲液中以4摄氏度后固定标本120分钟。在室温下用双蒸馏水冲洗试样两次。通过在室温下浸没在一系列分级乙醇中脱水。
使用上述体积比在室温下用环氧丙烷和环氧二烯树脂级分级混合物浸润试样。第二天，将试样嵌入模具中100%新鲜的epossidic树脂中，并在60摄氏度下聚合48小时。将标本块安装在超薄切片机支架上。
用剃须刀片修剪表面上的块状物以达到组织水平。将金刚石刀安装在样品前面，并将样品表面平行于刀对齐。用金刚石刀制作一微米厚的半薄切片，以检查样品的方向。
用甲苯胺蓝染色半薄切片，以便用光学显微镜观察。然后进一步修剪块以减少感兴趣的区域，以获得适当的超薄部分。用第二把金刚石刀切割 60 至 70 纳米厚度的超薄切片。
使用完美的循环在一个完整的铜网格上收集一到两个部分。为了对比切片，将网格浸入醋酸铀酰溶液中20分钟，并在双蒸馏水中洗涤网格，然后将网格浸入柠檬酸铅中15分钟，并在双蒸馏水中重新洗涤网格。打开透射电子显微镜计算机和图像记录软件，使用数字慢扫描CCD相机和相关成像软件记录数字图像。
在显微镜载物台中插入具有多个切片的网格后，首先以低放大倍率筛选网格，以选择最优质的切片并确定肌肉纤维的方向。下一个焦点，图像在放大倍率高于30， 000时，光束以该部分的外围光纤为中心，并以所需的放大倍率记录一秒钟曝光时间的图像。确保图像以随机的机器人系统顺序分布在光纤的长度和宽度上，以获得无偏的结果并重复成像，直到对6到10根光纤进行成像。
通过单击文件，然后单击打开将图像导入图像 J。通过单击"分析"，然后设置比例，将全局比例设置为与图像的原始大小匹配。要放大100%，请单击图像，转到缩放并单击。
使用工具菜单中的直线工具测量肌原纤维空间每个图像一个Z盘的厚度，并计算6到10根纤维中每根纤维的平均Z盘厚度。使用分段线工具测量在构体下区域正下方可见的最外层肌原纤维的长度。要插入网格，请单击"分析"，选择工具，然后选择"网格"。
现在将每个点的面积设置为32， 400纳米。在 12 个十字击中穹窿下糖原的 12 个附属构象图像中，计算可用长度内的命中次数。通过单击分析插入网格，然后选择工具，然后选择网格并将每个点的面积设置为 160， 000 平方米。
计算第 12 个肌原纤维图像中十字击中肌内间隙的命中次数。然后，要插入网格，请单击"分析"，选择工具，然后选择"网格"。现在将每个点的面积设置为3， 600平方米。
在第12个肌原纤维图像中，交叉击中肌原的命中次数。通过单击分析插入网格，然后选择工具，然后选择网格并将每个点的面积设置为 32， 400 纳米。在第12个肌原纤维图像中，交叉击中肌原的命中次数。
使用32， 400平方米的网格随机选择糖原颗粒，从左上方开始，必要时向左移动。使用直线工具，为12个图像中的每张图像测量每个池中随机选择的五个糖原颗粒的直径，以获得每根光纤每个池的平均60个颗粒。该图显示了三个糖原池的正常值。
可以观察到，肌原间糖原值的分布接近正常，而肌原和构肌下糖原均显示出偏斜分布，纤维有时具有过量的糖原。在所有步骤中，使用亚铁氰化钾非常重要。糖原的分析可以与线粒体和脂滴的分析相结合，这可以提高我们对其他关键代谢成分如何与糖原和肌肉健康相关的理解。
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概述
本研究提出了一种改进的后固定程序，该程序可增强组织中糖原颗粒的对比度。该协议详细说明了组织处理、成像技术和定量分析骨骼肌中糖原分布的立体学方法。
研究的主要组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 组织学
背景
- 测量糖原含量对于理解细胞对生理变化的反应至关重要。
- 单个细胞对条件和疾病表现出不同的适应性。
- 高分辨率成像对于观察亚细胞结构至关重要。
- 该技术通过使用无抗体糖原染色避免了特异性问题。
研究目的
- 改善组织样本中糖原颗粒的对比度。
- 提供成像和分析的详细协议。
- 获得骨骼肌中糖原分布的无偏数据。
使用的方法
- 使用高铁氰化钾的改进后固定程序。
- 使用戊二醛和甲基硫氰酸钠缓冲液制备固定液。
- 透射电子显微镜用于高分辨率成像。
- 立体学方法用于定量分析。
主要结果
- 实现了糖原颗粒对比度的增强。
- 协议允许对亚细胞结构进行精确成像。
- 展示了糖原分布的无偏量化。
- 该技术适用于各种组织类型。
结论
- 改进的程序显著提高了糖原的可视化。
- 提供了研究骨骼肌中糖原的可靠方法。
- 促进了对细胞适应性的更好理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
This TEM-based glycogen quantification method enables high-resolution subcellular analysis critical for de-risking metabolic target hypotheses in skeletal muscle. By resolving glycogen distribution across distinct subcellular compartments, it provides mechanistic insights that improve predictive confidence in preclinical models of metabolic disease. The approach supports early discovery workflows requiring subcellular phenotyping and biomarker alignment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of glycogen storage patterns to clarify metabolic pathway involvement in disease models.
- Operational Value: Provides subcellular resolution to distinguish artifactual from biologically relevant glycogen accumulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative ultrastructural data (volume fraction, particle diameter) for assay standardization across subcellular glycogen pools.
- Operational Value: Supports development of reproducible, antibody-free staining protocols compatible with high-throughput EM imaging.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links subcellular glycogen distribution to mitochondrial and lipid droplet morphology for integrated metabolic phenotyping.
- Operational Value: Enables cross-comparison of glycogen dynamics in disease-relevant skeletal muscle models prior to preclinical advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows where subcellular metabolic phenotyping informs target validation and lead identification decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing non-uniform glycogen storage that challenges homogeneous assumptions in metabolic modeling.
- Screening: Delivers quantitative glycogen readouts (volume fraction, particle size) enabling comparison across genetic or pharmacological conditions.
- Analytics: Employs stereological grid-based counting to generate unbiased, statistically robust estimates of glycogen distribution.
- Translational Research: Connects glycogen ultrastructure to organelle morphology, supporting biomarker alignment in metabolic disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized TEM workflow for subcellular glycogen quantification applicable across multiple skeletal muscle studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by resolving glycogen heterogeneity at the subcellular level.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized fixation, staining, and stereological analysis protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing subcellular metabolic context that complements bulk biochemical assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on subcellular glycogen phenotypes in disease models.
Implementation Considerations
- Expertise in TEM sample preparation, ultramicrotomy, and stereological analysis is required.
- Access to transmission electron microscopy with digital imaging capabilities and image analysis software (e.g., ImageJ) is essential.
- Standardization across teams requires adherence to fixed staining concentrations (e.g., potassium ferrocyanide 1.5%) and grid-based counting parameters.
- Adaptation to other muscle fiber types or tissue systems may require optimization of sectioning and staining protocols.
- Methodological limitations include sampling bias if fiber orientation or section distribution is not randomized, as noted in the protocol.
