Name: 6-羟基多巴胺诱导的基于斑马鱼的成人帕金森病模型的运动评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: 了解利用6-羟基多巴胺诱导斑马鱼帕金森病模型的运动评估方法。通过脑室内注射和视频追踪技术，研究多巴胺能神经元损伤后的运动功能障碍与神经再生机制，为帕金森病治疗提供重要见解。

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本工作由马来西亚高等教育部通过基础研究拨款计划 [600-IRMI/FRGS 5/3 (033/2019)] 资助。

本研究已获得玛拉工艺大学（UiTM）动物研究伦理委员会（CARE）的批准[参考编号：UiTM CARE 346/2021，日期为2021年5月7日]。
注意：采用已发表的标准饲养和维持6-羟基多巴胺（6-OHDA）损毁成年斑马鱼帕金森病（PD）模型的实验方案22,25,26。实验使用5个月以上、体长标准化为3.2–3.7 cm的成年雄性斑马鱼（Danio rerio）进行。
1. 斑马鱼的维持及脑室内微注射前准备
<ol>
	<li>将鱼类饲养在充气水箱中，温度控制在 28 ± 1.0 °C。斑马鱼的饲养与维护全程使用添加商业海盐（1 g/L）的蒸馏水27。</li>
	<li>每 45 L 水箱最多饲养 25 条鱼，或每 1.8 L 水饲养 1 条鱼，并维持 14 小时光照与 10 小时黑暗的光周期。每天至少喂食两次，饲料为颗粒饲料并补充冻干蠕虫。</li>
	<li>通过将 2.5 g 三卡因甲磺酸盐（MS-222）和 5 g 碳酸氢钠溶解于 250 mL 蒸馏水中，配制浓缩储备液。取 2 mL 储备液稀释至 200 mL，制备工作用麻醉溶液。</li>
	<li>配制 99.96 mM 的 6-OHDA 溶液：先将 0.2 mg 抗坏血酸溶解于 1 mL 0.9% w/v 无菌过滤的 NaCl 溶液中。加入粉末状 25 mg 6-OHDA 前，先用 0.2 微米滤膜过滤该溶液。每次注射前新鲜配制，并避光保存于 4 °C。 
	警告：操作化学品时应穿戴适当的个人防护装备（如手套、实验服和口罩），并遵守良好的实验室操作规范。所有化学品操作均应在生物安全柜内进行。</li>
</ol>
2. 斑马鱼的麻醉与脑室内注射
<ol>
	<li>将斑马鱼禁食 24 小时，以避免在麻醉过程中发生反流。将鱼浸入含有 0.01% w/v MS-222 溶液的容器中约 1 分钟，或直至所有可见的肌肉运动停止，以实现麻醉。</li>
	<li>将麻醉后的鱼置于体视显微镜下浸湿的海绵上，并定期润湿鱼体。</li>
	<li>根据额缝（MS）、冠状缝（CS）和矢状缝（SS）的交汇位置确定注射位点，该位置对应于斑马鱼脑部的额骨与顶骨连接处。</li>
	<li>使用锋利的 27 G 针头在斑马鱼颅骨的特定解剖位置钻出面积为 1.0 mm2 的小孔（图 1A、B）。</li>
	<li>以 60° 角缓慢下降微量注射器，直至其深入斑马鱼颅骨颅顶下方 1,200 µm 处（图 1C）。按下 Z 限位键以固定位置。</li>
	<li>设定初始注射压力为 4000 hPa，补偿压力为 10 hPa，注射持续时间为 0.3 秒。每次后续注射时逐步降低注射强度。</li>
	<li>注射 0.5 µL 浓度为 99.96 mM 的神经毒素 6-OHDA（假手术对照组注射 0.9% w/v 生理盐水），并让微量注射针停留 20 秒。在整个注射过程中持续用蒸馏水润湿鱼体，防止其干燥。</li>
	<li>缓慢拔出微量注射针，并将鱼置于流动的蒸馏水中复苏。将鱼放入独立的恢复缸中，并移除可能干扰恢复过程的任何干扰因素。</li>
	<li>在下一次注射前冲洗微量注射针，以清除堵塞物，并确保注射强度足以准确释放 0.5 µL 的 6-OHDA 溶液。</li>
</ol>
<img alt="用于昆虫神经研究的微毛细管技术示意图；解剖切面及插入角度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63355/63355fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：神经毒素6-OHDA的注射位点。（A）微毛细管进入点由额缝（MS）、冠状缝（CS）和矢状缝（SS）的交点引导，该交点连接斑马鱼脑的额骨与顶骨（平面视图）。（B）斑马鱼颅骨与脑的示意图（平面视图）显示了微毛细管垂直置于缰核（Hab）上方，并在两半球交界处进入。（C）斑马鱼脑的示意图（矢状切面）显示了注射角度与穿刺深度。黑点代表损伤部位，位于靶区腹侧间脑的上方。缩写：6-OHDA：6-羟基多巴胺，CS：冠状缝，Dn：间脑，Hab：缰核，Hyp：下丘脑，MS：额缝，OB：嗅球，POA：前视区，PT：后结节，SS：矢状缝，Tec：视顶盖，Tel：端脑。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63355/63355fig01largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
3. 运动功能评估
注意：对斑马鱼的运动功能评估（n = 每组六条；假手术组 vs 损伤组）均单独进行 通过 采用既定方案的敞箱实验28,29 在6-OHDA损毁后第3天和第30天。
<ol>
	<li>视频记录
	<ol>
		<li>将实验水箱（长 20 cm，宽 11.5 cm，高 13 cm）放置在抬高的平台上，水箱壁覆盖白色纸张（图 2A）。</li>
		<li>使用光源从底部照明。向水箱中加入蒸馏水（注水至 80%–90% 满），并将温度维持在 28 ± 1.0 °C。使用温度计测量温度，并通过商用 aquarium 加热器进行调节。</li>
		<li>经过至少 2 分钟的适应后，使用摄像机从俯视角度记录鱼类在实验区域二维（2D）平面上的游泳行为，持续 5 分钟（图 2B）。为避免早期和后期记录批次之间游泳行为不一致，适应时间不得超过 10 分钟30。</li>
		<li>使用视频追踪软件结合开放水箱方案分析视频，获取每条鱼的移动距离（cm）和平均速度（cm/s）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="鱼类运动研究实验装置示意图：摄像机、水箱、光源平台。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63355/63355fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：用于评估斑马鱼运动行为的开放式水箱实验装置。（A）实验水箱（正面视图）放置在抬高的平台上，平台从下方照明。水箱的四壁覆盖白色纸张，录像从轴向拍摄。水温使用温度计测量，并通过商用 aquarium 加热器调节至 28 ± 1.0 °C。（B）使用该装置拍摄的视频录像截图（俯视图）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63355/63355fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<ol start="2">
	<li>数据分析
	<ol>
		<li>双击图标以打开视频追踪软件。点击文件选项卡，选择创建新的空白实验。这将允许用户根据研究目的自定义实验参数。</li>
		<li>点击协议选项卡，选择视频源，然后点击添加新的视频源。点击可用的下拉列表，选择视频文件选项。此时将弹出文件浏览窗口，从中可选择感兴趣的视频记录。</li>
		<li>点击装置子选项卡，选择矩形图标以设置实验装置。拖动矩形图标覆盖整个实验区域。根据实际情况设置标尺，并在标尺长度部分输入所用标尺测量值的数值。本实验在开放水箱测试中使用了10 mm的标尺。</li>
		<li>通过选择动物颜色比装置背景深来设定动物颜色。追踪设置中的其他可用选项保持默认预设。</li>
		<li>在区域子选项卡中，点击先前绘制的装置区域。该区域被设为标准区域，在所有测试中位置保持一致。</li>
		<li>在测试计划和测试数据报告中选择以下选项：测试持续时间、总移动距离和平均速度。列表中其他可用测试为可选项目，取决于研究人员的具体研究兴趣。</li>
		<li>在实验选项卡中，通过在名称部分输入组名以及在动物数量部分输入每组动物数量，按测试分组分配动物。</li>
		<li>切换到测试选项卡以运行实验。点击开始测试图标，并等待所有视频完成分析。</li>
		<li>在结果选项卡中，点击查看报告图标，以文本报告形式查看运动数据。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本研究成功实现了基于已建立的6-羟基多巴胺（6-OHDA）诱导的成年斑马鱼帕金森病（PD）模型的运动功能评估。整个实验包括三个主要步骤：脑室内微注射前的准备工作、斑马鱼脑室内微注射以及运动行为评估。为了确保成年斑马鱼在脑室内微注射后能够健康恢复，并获得良好的实验结果，本研究针对每个步骤推荐了一些最佳操作规范。
脑室注射前准备：动物选择最好在实验前一天完成。需确定斑马鱼的性别并测量其体长。选择体长标准化为3.2–3.7 cm的成年雄性斑马鱼，将其放入单独的实验鱼缸中。此外，鱼类应在实验前禁食24小时，以避免麻醉期间发生反流33。实验前应准备好一个鱼缸（四壁用白纸包裹），并设置好静水装置，以减少外界环境带来的应激，促进斑马鱼的术后恢复。所有化学试剂均需在每次实验开始前新鲜配制，因其可能随时间迅速降解，并在室温下变得不稳定34,35。
6-OHDA微量注射：在整个操作过...

帕金森病（PD）是一种以肌肉僵直、静止性震颤和运动迟缓为显著特征的疾病，是全球增长速度最快的神经系统疾病1,2。PD 的风险和患病率随年龄迅速增加，尤其在50岁及以上的人群中更为明显3。迄今为止，帕金森病的病因和发病机制仍不明确，这常常导致早发性 PD 难以被诊断。目前，PD 患者体内多巴胺缺乏以及多巴胺能神经元（DpN）的丢失被认为与运动症状的出现密切相关4。基于这一关系，已开发出多种治疗方法，旨在直接替代多巴胺（例如左旋多巴）或补偿 DpN 的丢失（例如深部脑刺激）。尽管这些治疗可缓解症状，但并不能改变疾病的进行性恶化过程5。鉴于这一重大局限，细胞替代疗法被提出作为潜在解决方案。然而，由于移植物制备、细胞生长控制以及表型不稳定性等方面的挑战，该疗法的效果尚不一致。此外，细胞替代疗法不仅曾引发伦理争议，还存在诱发脑肿瘤和不良免疫反应的风险6,7。
现有治疗策略的局限性使得多巴胺能神经元（DpN）再生作为帕金森病（PD）潜在治疗方法受到更多关注。DpN再生或神经再生已成为PD管理中颇具前景的突破之一，不仅因其可能成为一种新的治疗手段，也因其有助于理解疾病机制8,9。该策略旨在通过已有前体细胞的分化、迁移并整合至受损神经环路中，从而恢复神经元功能10。为了进一步探索神经再生，已开展多种体内（in vivo）研究。研究发现，哺乳动物、两栖动物和爬行动物等脊椎动物在脑损伤后能够生成新的脑细胞11,12。在脊椎动物中，哺乳动物因其与人类具有较高的遗传相似性而更受青睐。然而，哺乳动物中枢神经系统（CNS）的修复能力有限，且在脑损伤后成年期仍维持较低水平13。总体而言，由于哺乳动物产生的神经元数量较少，不足以恢复PD中观察到的受损神经环路，因此并不适合作为研究神经再生的动物模型。因此，以辐鳍鱼类（teleost）为基础的模型，尤其是斑马鱼（zebrafish），因其具有高增殖率、持续自我更新能力以及与人类高度相似的脑结构而备受推崇14,15。
斑马鱼最常被用于研究帕金森病（PD）中的运动障碍16。基于斑马鱼的PD模型通常由神经毒素诱导，包括1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）和6-羟基多巴胺（6-OHDA）17。尽管MPTP能有效诱导多巴胺能神经元（DpN）的特异性丢失并降低多巴胺水平，但其模型并不能很好地模拟PD的真实状况，因为DpN的损失不仅局限于中枢神经系统（CNS）18。6-OHDA难以穿过血脑屏障，因此当采用颅内给药而非肌肉注射时，其对脑内细胞和功能变化的影响受到限制19。外周给予6-OHDA会导致整个神经系统中多巴胺水平的全局性下降20。而将6-OHDA注入脑脊液中则会引起中枢神经系统内广泛DpN的消融21，这与PD中DpN特异性地在人脑黑质区域丢失的情况不符。相反，脑室内（ICV）注射6-OHDA可特异性地诱导斑马鱼脑腹侧Dn区DpN的显著消融，该区域与人类黑质高度相似22。有趣的是，已有研究报道在6-OHDA诱导损伤后30天，DpN出现恢复，且这些神经元可在个体生命周期中持续存活23,24。通过使用6-OHDA诱导的成年斑马鱼PD模型，利用运动行为评估（包括移动距离（cm）和平均速度（cm/s））证实了DpN的功能恢复22。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-羟基多巴胺（6-OHDA）</td><td>Sigma-Aldrich, Missouri, USA</td><td>162957</td><td></td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Thermo Fisher Scientific, California, USA</td><td>FKC#A/8882/53</td><td></td></tr><tr><td>一次性巴斯德吸管，3 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific, California, USA</td><td>FB55348</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管，0.2 mL</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>30124332</td><td></td></tr><tr><td>锥形瓶，100 mL</td><td>Evergreen Engineering &amp;amp; Resources, Semenyih, Malaysia</td><td>SumYau0200</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma-Aldrich, Missouri, USA</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich, Missouri, USA</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>106404</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Nikon, Tokyo, Japan</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>三卡因甲磺酸盐（MS-222）</td><td>Sigma-Aldrich, Missouri, USA</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ANY-maze 软件</td><td>Stoelting Co., Illinois, USA</td><td>-</td><td>版本 7.0；视频追踪软件</td></tr><tr><td>Cubis II 微型实验室天平</td><td>Sartorius, G&amp;ouml;ttingen, Germany</td><td>SE 2</td><td></td></tr><tr><td>FemtoJet IV 微注射仪</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>5192000035</td><td></td></tr><tr><td>Femtotip II，无菌注射毛细管</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>5242957000</td><td></td></tr><tr><td>InjectMan 4 显微操作器</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>5192000027</td><td></td></tr><tr><td>LED 便携式灯</td><td>MR. DIY, Selangor, Malaysia</td><td>9023251</td><td>20 mAh</td></tr><tr><td>PELCO Pro Superalloy，偏移型，细尖</td><td>Ted Pella, California, USA</td><td>5367-12NM</td><td></td></tr><tr><td>Shanda 水族箱加热器</td><td>Yek Fong Aquarium, Selangor, Malaysia</td><td>SDH-228</td><td></td></tr><tr><td>温度计</td><td>Sera Precision, Heinsberg, Germany</td><td>52525</td><td></td></tr><tr><td>摄像机</td><td>Nikon, Tokyo, Japan</td><td>D3100</td><td></td></tr></tbody></table>

6-羟基多巴胺诱导的成年斑马鱼帕金森病模型的运动功能评估

Locomotor Assessment of 6-Hydroxydopamine-induced Adult Zebrafish-based Parkinson's Disease Model

目前治疗手段在延缓帕金森病（PD）多巴胺能神经元丢失方面存在局限性，因此亟需能够恢复这些神经元的替代疗法。当前大量研究致力于利用临床前 体内 模型更深入地理解神经再生过程。然而，哺乳动物的这种自我修复再生能力效率较低。因此，斑马鱼等非哺乳动物因其具备持续自我更新的能力，并且大脑结构与人类高度同源，已成为理想的神经再生研究模型。作为阐明 体内 神经再生相关细胞事件的一部分，我们建立了基于6-羟基多巴胺（6-OHDA）诱导的成年斑马鱼PD模型。该模型通过优化的脑室内（ICV）微量注射99.96&#160;mM 6-OHDA，特异性消融斑马鱼脑腹侧间脑（Dn）中的多巴胺能神经元（DpN）。免疫荧光结果显示，在损伤后第3天，DpN消融超过85%，而在损伤后30天，损伤部位的DpN完全恢复。本研究通过开放场实验评估了损伤后斑马鱼游泳行为的障碍及其后续恢复情况，并量化了两个参数：移动距离（cm）和平均速度（cm/s）。通过视频追踪软件分析每组个体鱼（n = 6）的录像记录来评估运动能力。结果表明，与假手术组相比，损伤组斑马鱼在损伤后第3天的速度（cm/s）和移动距离（cm）显著降低（p &#60; 0.0001）。损伤组斑马鱼在损伤后30天游泳行为完全恢复。本研究结果表明，6-OHDA诱导的成年斑马鱼是一种具有可重复性的优良模型，有助于开展帕金森病神经再生机制的研究。未来关于神经再生机制以及调控该过程的内在和外在因素的研究，可能为开发针对帕金森病的新型细胞替代治疗策略提供重要启示。

本实验评估了成年斑马鱼在脑室内微量注射6-OHDA后游泳行为的变化。选择6-OHDA作为神经毒素的原因在于其无法穿过血脑屏障，从而可在目标区域——间脑腹侧区（Dn）特异性地靶向消融DpN16。该区域的DpN亚群在解剖结构上与人类黑质致密部的DpN亚群具有相似性31。
根据我们之前的研究22，通过检测成年斑马鱼DpN标志物——酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase, TH）的免疫组织化学染色，证实了6-OHDA脑室内微量注射对成年斑马鱼DpN的细胞效应。主要关注的脑区为Dn，由终脑前部（preoptic area, POA）、后结节区（posterior tuberculum, PT）和下丘脑（hypothalamus, Hyp）组成。研究发现，99.96 mM的6-OHDA处理可使成年斑马鱼存活率达到100%，且Dn区域TH免疫阳性（TH-ir）神经元数量最少。此外，在损伤后第3天，Dn中超过85%（p &...

本实验方案描述了在腹侧间脑（Dn）区域对成年斑马鱼进行脑室内（ICV）注射神经毒素6-羟基多巴胺（6-OHDA），并利用敞口水箱实验评估损毁后游泳行为的损伤及后续恢复情况，同时结合视频追踪软件进行分析。

目前治疗手段在延缓帕金森病（PD）多巴胺能神经元丢失方面的局限性，促使人们需要寻找能够……的替代疗法

该方案通过在腹侧间脑内进行脑室内注射神经毒素6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine），显著展示了斑马鱼运动功能的损伤及其后续恢复过程。该技术利用极为简单的装置，揭示了与6-OHDA损伤的成年斑马鱼腹侧间脑中多巴胺能神经元特异性消融相对应的功能性变化。未来关于神经再生机制以及调控该过程的内在与外在因素的研究，可能为针对帕金森病的细胞替代治疗策略提供重要见解。将鱼类饲养在充气的蒸馏矿化水水族箱中，每升水中加入1克市售海盐，温度控制在28±1°C。每45升水箱最多饲养25条鱼，并维持14小时光照与10小时黑暗的光周期。每天至少喂食两次颗粒饲料，并补充冷冻干燥的蠕虫。通过将2.5克三卡因甲磺酸盐和5克碳酸氢钠溶解于250毫升蒸馏水中，制备三卡因甲磺酸盐储备液。取2毫升储备液稀释至200毫升，制得工作用麻醉溶液。新鲜配制99.96毫摩尔的6-羟基多巴胺溶液：先将0.2毫克抗坏血酸溶解于1毫升0.9%（质量/体积）无菌过滤的氯化钠溶液中。使用0.2微米滤器过滤溶液。然后将25毫克粉末状6-羟基多巴胺加入溶液中。将麻醉后的鱼置于一块浸过水的海绵上，放在体视显微镜下，并定期润湿鱼体。根据额缝、冠状缝和矢状缝的交点位置确定注射位点，该交点连接斑马鱼脑的顶骨与额骨。然后使用锋利的27号针头制作一个1平方毫米的小孔。以60度角将微毛细管注射器缓缓下降，直至其深入斑马鱼颅骨颅顶下方1200微米处。按下 Z 限位以固定位置。将初始注射压力设置为 4,000 百帕。注射持续时间为 2.3 秒。补偿压力至10百帕。逐次降低注射强度。向假手术对照组注射0.5微升99.96毫摩尔的神经毒素6-羟基多巴胺或0.9%（质量/体积）的生理盐水，然后让微毛细管静置20秒。在整个操作过程中持续用蒸馏水润湿鱼体，以防止干燥。缓慢移除微毛细管，并在流动的蒸馏水中复苏鱼体。将鱼放入独立的恢复缸中，并移除可能干扰恢复过程的任何干扰因素。在下一次注射前冲洗微毛细管，以清除堵塞，并确保注射强度足以注入所需体积的0.5微升6-羟基多巴胺。在注射6-羟基多巴胺后的第3天和第30天，通过敞口容器实验对斑马鱼进行单独的运动行为评估。将实验用鱼缸置于抬高的平台上，鱼缸四周用白色纸张包裹。使用光源从底部照亮容器。将容器注入80%至90%的蒸馏水，并将温度维持在28±1°C。使用温度计测量温度，并通过市售水族加热器进行调节。经过至少两分钟的适应后，使用摄像机从预设视角记录鱼类在实验区域二维平面上的游泳行为，持续五分钟。为避免不同批次记录之间的不一致，适应时间不得超过十分钟。使用视频追踪软件并采用开放水箱方案分析视频，以获取每条鱼的移动距离和平均速度。本实验评估了成年斑马鱼在脑室内微量注射6-羟基多巴胺后游泳行为的变化。主要关注的脑区为间脑腹侧区，包括终脑前区、后结节和下丘脑。在损伤后第三天，间脑腹侧区中超过85%的

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