Name: 定量微管分离技术分离小鼠组织中稳定的微管、不稳定的微管和游离微管蛋白 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-17T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: 学习定量微管分离技术，用于区分和量化小鼠组织中稳定微管、不稳定微管及游离微管蛋白。该方法可评估微管结构稳定性，有助于研究阿尔茨海默病和癌症等疾病。

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本研究部分得到了以下资助：科学技术振兴机构（JST）设立的大学奖学金项目，旨在促进科学技术创新（A.HT.；JPMJFS2145）；JST SPRING项目（A.HT.；JPMJSP2129）；日本学术振兴会（JSPS）研究员奖励金（A.HT.；23KJ2078）；日本学术振兴会科研费（B）类别资助（22H02946，TM）；日本文部科学省（MEXT）“创新研究领域”专项资助，课题为&#34;脑蛋白老化与痴呆症控制&#34;（TM；26117004）；以及和田纪念财团上田纪念研究奖学金（TM；202020027）。作者声明无任何竞争性财务利益。

1. 微管蛋白分级分离方法
注意：本研究中进行的所有实验均获得同志社大学动物伦理委员会的批准。实验使用任一性别的 C57BL/6J 小鼠，年龄为 3-4 个月。在本方案中，解剖获得的组织（例如脑、肝或胸腺）立即在冰冻的微管稳定缓冲液（MSB）中进行匀浆，该缓冲液含有紫杉醇（微管稳定剂），其浓度足以防止微管的去聚合以及再聚合。匀浆液通过两步超速离心法分离为三个组分（图 1）。本方案中的所有步骤均在低温环境中连续完成，组织和组分在溶解于十二烷基硫酸钠（SDS）样品缓冲液之前均未冷冻。
<ol>
	<li>MSB 和微量离心管的准备
	<ol>
		<li>制备MSB时，混合以下试剂：0.1 M 2-(N-Morpholino)乙烷磺酸（MES），pH 6.8（KOH 中和），10% 甘油，0.1 mM DTT，1 mM MgSO₄4，1 mM EGTA，0.5% Triton X-100，磷酸酶抑制剂（1 mM NaF，1 mM β-甘油磷酸钠，1 mM Na3VO40.5 µM 毒藻酸，1×蛋白酶抑制剂混合液，以及蛋白酶抑制剂（0.1 mM PMSF，0.1 mM DIFP，1 µg/mL 胃蛋白酶抑制剂，1 µg/mL 抗痛素，10 µg/mL 抑肽酶，10 µg/mL 亮抑酶肽，50 µg/mL TLCK）（参见 材料表）并记为MSB(-)。</li>
		<li>在组织解剖前，加入10 µM 紫杉醇和2 mM GTP（参见 材料表) 加入MSB(-)中，此缓冲液记为MSB(+)。该缓冲液需在使用当天配制，并置于冰上保存。</li>
		<li>准备用于取样的微量离心管。用于匀浆液储存的空2.0 mL微量离心管；用于上清液1（S1）裂解物、沉淀2（P2）样品和沉淀3（P3）样品储存的空1.5 mL微量离心管；装有1 mL预冷磷酸盐缓冲液（PBS）的1.5 mL微量离心管，用于储存分离的组织；装有200 µL 2× SDS上样缓冲液（0.16 M Tris，pH 6.8；20%甘油；2% 2-巯基乙醇；4% SDS）的1.5 mL微量离心管，用于S1样品和上清液3（S3）样品的储存；以及适用于TLA55和TLA120.2离心机转子的离心管（参见 材料表）。标记所有离心管，并将其置于冰上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小鼠组织匀浆化
	<ol>
		<li>准备一个低温操作台用于组织解剖。首先，在容器中装入碎冰，并将两个培养皿置于冰上，其中一个培养皿内面朝上，另一个外面朝上。将其中一个培养皿加入预冷的PBS，用于组织样本的短暂清洗和暂存；将另一个倒置的培养皿内铺上经PBS润湿的滤纸。</li>
		<li>为处死小鼠，先在深度麻醉下使用丁丙诺啡、咪达唑仑和美托咪啶混合麻醉剂进行颈椎脱位。随后立即解剖组织（如脑、肝或胸腺），并在培养皿中用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗。 
		注意：该方法可分析任何类型的软组织，但组织的大小受限于所用匀浆器推荐的体积范围。例如，若使用2 mL体积的匀浆器，建议使用50–100 mg的组织。</li>
		<li>称量用于储存解剖组织的含 PBS 的 1.5 mL 微量离心管后，将组织剪下并放入管内，再次称量每个微量离心管。通过计算加入组织前后离心管的重量差，可得出每份组织的湿重。</li>
		<li>立即在冰预冷的MSB(+)缓冲液中使用预冷的匀浆器对组织进行匀浆（参见 材料表）。MSB(+) 的体积为组织湿重的19倍（µL/mg）。用20次冲程进行匀浆，直至组织碎片消失。 
		注意：例如，100 mg 组织需使用 1,900 µL MSB(+)。由于所添加的 MSB(+) 体积必须根据所分析组织样本的湿重进行调整，因此需要准确称量每一份组织样本。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小鼠组织匀浆的离心
	<ol>
		<li>用巴氏吸管将整个匀浆转移至2 mL微量离心管中，于2,400 × g 在 2 °C 下离心 3 分钟以去除碎片 通过 沉淀</li>
		<li>将全部上清液（S1 组分）转移至新的 1.5 mL 微管中并涡旋振荡。随后，取 200 µL S1 组分加入离心微管中，在 100,000 × g 使用TLA-55转子在2 °C下离心20分钟，以获得相对高分子量的蛋白质沉淀（P2组分）。 
		注意：进行超速离心步骤的样品体积会影响离心半径及分子的沉淀效率。此步骤后应将样品体积保持在 200 µL 或以下，以避免出现不准确的分级分离。</li>
		<li>进一步将所有获得的上清液（S2 组分）在 500,000 × g 使用TLA-120.2转子在2 °C条件下离心60分钟，以分离沉淀中的不溶性蛋白质复合物（P3组分）和上清液中的可溶性蛋白质（S3组分）。</li>
		<li>向 P2 和 P3 组分管中加入 400 µL 1x SDS 上样缓冲液（0.08 M Tris pH 6.8；10% 甘油；1% 2-巯基乙醇；2% SDS），短暂超声处理以溶解沉淀物。将这些组分样品转移至新的 1.5 mL 微量离心管中。</li>
		<li>将总S3组分溶于200 µL的2x SDS样品缓冲液中。</li>
		<li>将剩余的S1组分与等体积的2x SDS上样缓冲液混合，用于制备Western blot的标准曲线。</li>
		<li>将所有样品在100 °C下煮沸3分钟。待样品冷却至室温后，于-20 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>各组分中蛋白质的定量
	<ol>
		<li>通过蛋白质印迹法对 P2、P3 和 S3 组分中的蛋白质进行定量。首先，采用 10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离经适当稀释的 P2、P3 和 S3 组分中的蛋白质，以及来自任意个体的 S1 样品系列稀释液作为标准曲线。随后，将样品电转印至聚偏二氟乙烯膜（见 材料表). 
		&#8203;注意：各组分的稀释比例取决于目标蛋白的浓度及抗体的反应性。（例如，脑组织中的α-微管蛋白、TUBB3、β-微管蛋白和酪氨酸化微管蛋白：S3 = 1/400，P3 = 1/2,000，P2 = 1/2,000，S1 = 1/50,000、1/20,000、1/10,000、1/5,000、1/2,000；脑组织中的乙酰化微管蛋白：S3 = 1/200，P3 = 1/400，P2 = 1/8,000，S1 = 1/100,000、1/40,000、1/20,000、1/10,000、1/4,000；肝脏中的α-微管蛋白：S3 = 1/20，P3 = 1/100，P2 = 1/20，S1 = 1/50,000、1/20,000、1/10,000、1/5,000、1/2,000；胸腺中的α-微管蛋白：S3 = 1/100，P3 = 1/400，P2 = 1/20，S1 = 1/50,000、1/20,000、1/10,000、1/5,000、1/2,000组织浓度稀释）</li>
		<li>用含5%脱脂奶粉的Tris缓冲盐溶液（50 mM Tris-HCl pH 7.6；152 mM NaCl）封闭膜&#160;用含 0.1% Tween 20 的 TBS-T 缓冲液孵育超过 30 分钟。</li>
		<li>将膜浸入含有初级抗体的 TBS-T 中（参见 材料表）超过 2 小时。随后用 TBS-T 缓冲液洗涤膜 3 分钟（重复 3 次）。</li>
		<li>使用HRP标记的二抗对一抗进行标记（参见 材料表在 TBS-T 中孵育超过 1 小时。随后用 TBS-T 洗涤膜 3 分钟，重复 3 次。</li>
		<li>使用增强型化学发光试剂显影膜，然后利用化学发光图像分析仪分析目标条带（参见 材料表).</li>
		<li>使用图像分析软件对蛋白条带强度进行定量分析（参见 材料表并绘制标准曲线，将用于标准曲线的不同稀释倍数的S1样品的稀释单位标在X轴，对应的条带强度标在Y轴。</li>
		<li>读取对应稀释组分样品的蛋白浓度（单位）。将测得的浓度乘以样品的稀释倍数，得到各组分中的蛋白单位。用各组分测得的蛋白单位除以总蛋白单位（P2 + P3 + S3），计算出百分比。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 各组分中微管蛋白特性的评估
注意：该生化方法根据沉降特性可分离出三组微管蛋白复合物。此处，基于复合物的大小及微管蛋白翻译后修饰（PTMs）来鉴定这些组分中获得的微管蛋白复合物状态。本方案所有步骤需在低温环境下连续完成，不得中断，且在组分样品溶解于SDS样品缓冲液之前不得将其冷冻。
<ol>
	<li>滤器截留实验
	<ol>
		<li>使用 300 kDa 超滤离心滤器（参见材料表）对 S2 和 S3 上清液（各 500 µL）进行过滤。在 2 °C 条件下以 14,000 × g 离心，直至全部上清液滤过，滤出的蛋白质收集于接收管中，截留在滤器上的蛋白质则保留在储液管的滤膜上。</li>
		<li>将接收管中的全部滤出液（约 500 µL）转移至新的 1.5 mL 微量离心管中，并加入 500 µL 的 2x SDS 上样缓冲液溶解。</li>
		<li>用移液器将储液管滤膜上的残留物加入 1,000 µL 的 1x SDS 上样缓冲液中溶解，并转移至新的 1.5 mL 微量离心管中。</li>
		<li>将样品在 100 °C 下煮沸 3 分钟。待样品冷却至室温后，于 -20 °C 保存。</li>
		<li>使用 DM1A（抗α-微管蛋白抗体，参见材料表）通过 Western 印迹法检测微管蛋白的含量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>尺寸排阻色谱法
	<ol>
		<li>制备载体缓冲液（0.1 M MES，pH 6.8；10% 甘油；1 mM MgSO4；1 mM EGTA；0.1 mM DTT），并按步骤 1.1.1 所述加入 1/10 浓度的蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物。随后过滤该溶液并置于低温环境中保存。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，于色谱室中准备配备制备型液相色谱系统的凝胶过滤色谱柱&#160;（参见材料表）。</li>
		<li>在上样前，以 1 mL/min 的流速用 180 mL 载体缓冲液冲洗色谱柱，冲洗时间为 3 小时。</li>
		<li>将市售的纯化猪脑微管蛋白（参见材料表）作为对照，或分别将来自小鼠脑组织的 S3 组分（各 500 µL）上样至色谱柱中。</li>
		<li>以 1.0 mL/min 的流速用载体缓冲液进行洗脱，连续收集 120 分钟内的洗脱液，每管 1.5 mL。通过 280 nm 吸光度监测洗脱出的蛋白质。保持最大压力低于 0.3 MPa。</li>
		<li>将收集的各洗脱组分涡旋混匀后，取 50 µL 与 50 µL 的 2x SDS 上样缓冲液在 1.5 mL 微量离心管中混合。所有样品在 100 °C 下煮沸 3 分钟。待冷却至室温后，于 -20 °C 保存。</li>
		<li>使用 DM1A（抗α-微管蛋白抗体）和 KMX-1（抗β-微管蛋白抗体）（参见材料表）通过 Western 印迹法&#160;检测微管蛋白的含量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者声明无利益冲突。

研究生物组织中微管蛋白状态时，最重要的任务是防止在样品制备过程中发生意外的微管（MT）聚合或解聚。从组织取出到匀浆及离心的整个过程中，样品中微管的稳定性受到多种因素影响，包括MSB缓冲液中紫杉醇（Taxol）的浓度、组织量与缓冲液体积的比例以及温度。因此，针对使用20倍体积匀浆液分析小鼠组织的实验方案，每一步的操作条件均经过优化。即使在低温条件下，过高的紫杉醇浓度也可能在体外诱导微管聚合in vitro，甚至在冷藏条件下亦如此25。当分析微管蛋白浓度差异显著的组织，或对实验方案进行重大修改时，操作人员应根据各自实验的具体目标优化各步骤。
在本项研究中，通过在500,000 × g20条件下进行超速离心，从传统的&#34;可溶性组分&#34;中获得了一类新的微管（MTs）群体，称为P3。基于转子K因子、离心力和离心时间等因素的理论计算表明，S3组分中存在的微管蛋白最可能代表6S微管蛋白二聚体。相反，P3组分中的微管蛋白可能对应于长度较P2组分中微管更短的...

微管（MTs）是由α/β-微管蛋白异源二聚体亚基组成的原丝构成的细长管状结构。它们在细胞分裂、细胞运动、形态维持以及细胞内运输等多种细胞过程中发挥着关键作用，是真核细胞骨架的重要组成部分1。微管的负端暴露α-微管蛋白亚基，相对稳定；而正端暴露β-微管蛋白亚基，可发生动态的去聚合与聚合2。在正端持续发生的微管蛋白二聚体的添加与解离过程，称为动态不稳定性，导致微管反复经历恢复（rescue）与灾变（catastrophe）的循环3。微管表现出具有局部动态不稳定性差异的焦点区域，包括稳定区和不稳定区4。
微管（MTs）动态不稳定性&#160;的精确调控对于多种细胞功能至关重要，尤其在具有复杂形态的神经元中尤为关键。微管的可塑性与稳定性在神经细胞的发育及正常功能维持中发挥着重要作用5,6,7。研究发现，微管的动态不稳定性与微管蛋白的多种翻译后修饰（PTMs）相关，例如乙酰化、磷酸化、棕榈酰化、去酪氨酸化、Δ2修饰、多聚谷氨酰胺氧化以及多聚甘氨酰化。此外，微管相关蛋白（MAPs）的结合也是一种重要的调控机制8。除乙酰化外，这些翻译后修饰主要发生在位于微管外表面的微管蛋白羧基末端区域。这些修饰在微管表面形成多样化的化学环境，影响其与微管相关蛋白的相互作用，从而最终调控微管的稳定性9。α-微管蛋白羧基末端存在酪氨酸残基是动态微管的标志，这类微管会迅速被游离的微管蛋白库所替换；相反，羧基末端的去酪氨酸化以及Lys40位点的乙酰化则标志着稳定性较高、动态不稳定性较低的微管9,10。
微管蛋白的翻译后修饰（PTMs）已在实验中被广泛用于评估微管（MTs）的动态性与稳定性5,7,11,12,13,14,15。例如，在细胞培养研究中，微管蛋白可被分为两个组分：游离微管蛋白组分和微管组分。该方法通过细胞透化释放游离微管蛋白，随后固定残留的微管结构15,16,17,18,19。生化方法则利用化学微管稳定剂保护微管免于解聚，从而通过离心实现微管与游离微管蛋白的分离20,21,22。然而，这些方法无法区分稳定微管与较不稳定的（动态的）微管，因此难以对脑等组织中的微管或可溶性微管蛋白进行定量分析。因此，在生理和病理条件下评估生物体内微管的稳定性一直具有挑战性。为克服这一实验局限，我们开发了一种可在小鼠组织中精确分离微管与游离微管蛋白的新技术23。
这种独特的微管（MT）分级分离方法包括在维持组织中微管蛋白状态的条件下进行组织匀浆，以及通过两步离心法分离稳定的微管、不稳定的微管和游离微管蛋白。这一简单的方法可广泛应用于多种研究，包括对活体生物中微管及微管相关蛋白（MAPs）的基础研究、与微管稳定性相关的健康和疾病状态的生理与病理分析，以及靶向微管的药物和其他治疗手段的开发。

<table><tbody><tr><td>500 个装 1.5 mL 离心管</td><td>Beckman Coulter</td><td>357448</td><td></td></tr><tr><td>1A2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9028</td><td>1:5,000 稀释</td></tr><tr><td>2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）</td><td>Nacalai Tesque</td><td>02442-44</td><td></td></tr><tr><td>300 kDa 超滤离心柱</td><td>Aproscience</td><td>PT-1013</td><td></td></tr><tr><td>6-11B1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7451</td><td>1:5,000 稀释</td></tr><tr><td>&amp;#196;KTAprime plus</td><td>Cytiva</td><td>11001313</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-035-146</td><td>1:5,000 稀释</td></tr><tr><td>抑蛋白酶肽</td><td>Peptide Institute Inc.</td><td>4062</td><td></td></tr><tr><td>抑肽酶</td><td>Nacalai Tesque</td><td>03346-84</td><td></td></tr><tr><td>Chemi-Lumi One L</td><td>Nacalai Tesque</td><td>07880-54</td><td></td></tr><tr><td>Corning 瓶顶真空过滤系统</td><td>Corning</td><td>430758</td><td>0.22&amp;micro;m 33.2cm&amp;sup2; 硝酸纤维素膜</td></tr><tr><td>DIFP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>55-91-4&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DIGITAL HOMOGENIZER HK-1</td><td>AS ONE</td><td>1-2050-11</td><td></td></tr><tr><td>DM1A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9026</td><td>1:5,000 稀释</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Nacalai Tesque</td><td>14128-46</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Nacalai Tesque</td><td>37346-05</td><td></td></tr><tr><td>FluoroTrans W 3.3 米卷</td><td>Pall Corporation</td><td>BSP0161</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Nacalai Tesque</td><td>17018-25</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Nacalai Tesque</td><td>17450-61</td><td></td></tr><tr><td>高速冷冻微量离心机 Kitman</td><td>TOMY</td><td>KITMAN-24</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg 柱</td><td>Cytiva</td><td>28-9893-35</td><td></td></tr><tr><td>Image Gauge 软件&amp;nbsp;</td><td>FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImmunoStar LD&amp;nbsp;</td><td>FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>292-69903</td><td></td></tr><tr><td>KMX-1</td><td>Millipore</td><td>MAB3408</td><td>1:5,000 稀释</td></tr><tr><td>LAS-4000 化学发光图像分析仪</td><td>FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>亮抑蛋白酶肽</td><td>Peptide Institute Inc.</td><td>43449-62</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Nacalai Tesque</td><td>21003-75</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;VO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Nacalai Tesque</td><td>32013-92</td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td>Nacalai Tesque</td><td>31420-82</td><td></td></tr><tr><td>冈田酸</td><td>LC Laboratories</td><td>O-2220&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>OPTIMA MAX-XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>393315</td><td></td></tr><tr><td>胃蛋白酶抑制剂</td><td>Nacalai Tesque</td><td>26436-52</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Nacalai Tesque</td><td>27327-81</td><td></td></tr><tr><td>TLA120.2 用聚碳酸酯离心管</td><td>Beckman Coulter</td><td>343778</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物（cOmplete&amp;#8482;，无 EDTA）</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>纯化微管蛋白&amp;nbsp;</td><td>Cytoskeleton</td><td>T240</td><td></td></tr><tr><td>QSONICA Q55</td><td>QSonica</td><td>Q55</td><td></td></tr><tr><td>紫杉醇</td><td>LC Laboratories</td><td>P-9600</td><td></td></tr><tr><td>TLA-120.2 转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>357656</td><td></td></tr><tr><td>TLA-55 转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>366725</td><td></td></tr><tr><td>TLCK</td><td>Nacalai Tesque</td><td>34219-94</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Nacalai Tesque</td><td>12967-45</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-甘油磷酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9422</td><td></td></tr></tbody></table>

定量微管分级分离技术：在小鼠组织中分离稳定微管、不稳定微管和游离微管蛋白

Quantitative Microtubule Fractionation Technique to Separate Stable Microtubules, Labile Microtubules, and Free Tubulin in Mouse Tissues

微管由α/β-微管蛋白二聚体组成，是真核细胞细胞骨架的关键组分。这些管状聚合物表现出动态不稳定性，即微管蛋白异源二聚体亚基反复发生聚合与解聚。通过微管蛋白的翻译后修饰以及微管相关蛋白，可精确调控微管的稳定性与动态行为，这对多种细胞功能至关重要。微管功能障碍与多种疾病的发病机制密切相关，包括神经退行性疾病。当前研究集中于靶向微管的治疗药物，这些药物可调节微管稳定性，为上述疾病及癌症提供潜在的治疗选择。因此，理解微管的动态状态对于评估疾病进展和治疗效果至关重要。
传统上，微管动力学是通过以下方式评估的 体外 或通过粗分级分离或免疫测定法，利用靶向微管蛋白翻译后修饰的抗体，在培养细胞中进行检测。然而，使用此类方法准确分析组织中微管蛋白状态仍存在挑战。本研究中，我们开发了一种简单且创新的微管蛋白分级分离方法，用于在小鼠组织中分离稳定的微管、不稳定的微管以及游离的微管蛋白。
该实验步骤包括将解剖所得的小鼠组织在微管稳定缓冲液中按19:1的体积比进行匀浆。匀浆液随后通过两步超速离心法进行分级分离，首先进行低速离心（2,400 × g）以去除碎片。第一步超速离心（100,000 × g）使稳定的微管沉淀，而所得上清液则进行第二步超速离心（500,000 × g），以分离不稳定的微管和可溶性微管蛋白二聚体。该方法可确定构成小鼠脑组织中稳定或不稳定微管的微管蛋白比例。此外，观察到不同组织中微管稳定性存在差异，且与组成细胞的增殖能力相关。这些发现凸显了该新型方法在生理和病理条件下分析微管稳定性的重大潜力。

通过微管分离法对小鼠脑组织P2、P3和S3组分中的微管蛋白进行定量 
采用微管（MT）分离法将小鼠组织中的微管蛋白分离至P2、P3和S3组分，并通过蛋白质印迹法进行定量分析（图1A）。在100,000 × g 条件下超速离心20分钟后，保留在P2组分中的微管沉淀物占小鼠脑组织总微管蛋白的34.86% ± 1.68%。上清液（S2）进一步在500,000 × g 条件下离心60分钟，获得沉淀物（P3组分）和上清液（S3组分），分别占小鼠脑组织总微管蛋白的56.13% ± 2.12% 和 9.01% ± 0.68%（图1B）。
本研究中使用的大脑皮层包含神经元和非神经元细胞（如胶质细胞）。为选择性评估小鼠脑内神经元中微管（MT）的稳定性，我们通过Tuj1（抗TUBB3抗体）进行Western blotting，定量检测TUBB3——一种仅在中枢和外周神经系统神经元中表达的微管蛋白亚型。TUBB...

微管是由微管蛋白聚合而成的结构，在真核细胞中作为细胞骨架的重要组分发挥关键作用，并以其动态不稳定性而著称。本研究建立了一种微管分级分离方法，可将微管分离为稳定微管、不稳定微管和游离微管蛋白，以评估微管在多种小鼠组织中的稳定性。

微管由α/β-微管蛋白二聚体组成，是真核细胞细胞骨架的关键组分。这些管状聚合物表现出……

我们的新方案有助于区分和定量动物组织中微管环的三种状态，即稳定微管、不稳定微管和游离微管。该技术由简单的步骤组成，能够评估微管的结构稳定性，而这种稳定性无法通过微管翻译后修饰的定量分析来检测。该方法对于微管稳定性至关重要的疾病（如阿尔茨海默病和癌症）的治疗策略研发具有重要意义。开始实验前，准备好用于组织解剖的实验防护装备。取一个容器装入碎冰，并将两个培养皿置于冰上。其中一个培养皿中加入冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS），用于组织样本的短暂清洗和临时保存。将用 PBS 润湿的滤纸铺在第二个培养皿上。接着，称量装有 PBS 的 1.5 毫升离心管，用于存放解剖所得组织。从小鼠体内取出组织后，立即将其转移至离心管中，并重新称量每个离心管。将组织转移至含有冰冻微管稳定缓冲液或MSB+培养基的玻璃匀浆器中，并立即使用预冷的匀浆器匀浆组织。随后用巴斯德吸管将组织匀浆液转移至2毫升微量离心管中，在2°C条件下以2,400 G离心3分钟。将上清液转移至新的1.5毫升微量离心管中，以去除碎片杂质。将上清液或S1组分在新的1.5毫升微量离心管中涡旋混匀。立即用移液器吸取200微升S1组分至离心微量管中，在2摄氏度条件下使用TLA-55转子以100,000 G离心20分钟。第二次离心后，将S2上清液与P2沉淀分离。立即将S2上清液的全部组分转移至离心微量管中，使用TLA-120.2转子在2°C条件下以500,000 G离心60分钟。第三次离心后，分离S3上清液与P3沉淀。将全部S3组分溶解于200 µL的2X十二烷基硫酸钠（SDS）样品缓冲液中。将剩余的S1组分与等体积的2X SDS上样缓冲液混合，用于制备蛋白质印迹实验的标准曲线。接着，向P2和P3组分的离心管中各加入400微升SDS上样缓冲液。然后，对溶液进行短时间超声处理，以溶解沉淀物，再将样品转移至新的1.5毫升微量离心管中，并置于冰盒中保存。将所有样品在 100 摄氏度下煮沸三分钟。小鼠脑组织中 P2 组分的微管占总 α-微管蛋白的 34.86%，而 P3 和 S3 组分中的微管分别占 56.13% 和 9.01%。P2、P3 和 S3 组分中 β-3 微管蛋白的比例与 α-微管蛋白相比无显著差异。S2组分中微管蛋白通过300千道尔顿超滤离心柱的透过有限，而S3组分则允许微管蛋白复合物完全透过。层析分离得到S3微管蛋白在100千道尔顿处洗脱。每个组分中回收的α-和β-微管蛋白比例相等。P2组分中乙酰化α-微管蛋白显著富集，而P3组分中以酪氨酸化α-微管蛋白为主。在匀浆前对脑组织进行冷冻，会导致P2组分中α-微管蛋白浓度降低，但P3组分中的α-微管蛋白则有所增加。冷冻还降低了P2组分中α-微管蛋白的乙酰化水平，并增加了其酪氨酸化水平。诺考达唑处理减少了P2组分中的α-微管蛋白含量。与冷冻不同，诺考达唑对P2组分微管蛋白的翻译后修饰没有影响。脑组织中P2微管蛋白的浓度显著较高，而P3微管蛋白则集中在增殖组织中。Western印迹结果显示，神经系统中特异性存在的P2微管蛋白来源于稳定的微管，而P3微管蛋白则来源于不稳定的微管。微管的稳定性具有高度动态性。必须在低温环境中快速且不间断地完成本实验方案。同时确保组织和各组分在溶解于SDS样品缓冲液之前始终未被冷冻。通过将各组分的免疫印迹分析与蛋白质组学相结合，有望鉴定出参与微管动态调控的相关因子。利用该方法，我们揭示了正常tau蛋白在微管上的存在形式。该方法还可用于研究tau蛋白在衰老大脑中如何发生异常，从而识别出痴呆症新的药物靶点。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

定量微管分离技术分离小鼠组织中稳定的微管、不稳定的微管和游离微管蛋白

微管是本质上不稳定的多聚体，其在生长与缩短之间的转换具有随机性且难以控制。本文描述了使用带有可光解稳定帽的节段化微管的实验方案。通过高时间和空间分辨率触发节段化微管的去聚合，从而有助于分析由微管解聚末端所驱动的运动过程。...

制备分段微管以研究由微管末端解聚驱动的运动

本方法中，我们介绍了从多种小鼠组织中快速高效分离中间丝（IF）蛋白的生化操作流程。分离得到的中间丝可用于通过质谱及其他生化实验研究翻译后修饰的变化。...

从小鼠多种组织中分离中间丝蛋白以研究衰老相关翻译后修饰

本文描述了用于分析斑马鱼发育中脑内不同微管群体的免疫标记方法，这些方法也可广泛适用于其他组织。第一个方案概述了一种优化的免疫标记稳定和动态微管的方法。第二个方案提供了一种特异性成像和定量新生微管的方法。...

利用免疫标记分析斑马鱼胚胎中稳定的、动态的和新生的微管

本文介绍了一种利用活细胞旋转盘共聚焦显微镜和基于 MATLAB...

利用转盘显微镜测量单极有丝分裂纺锤体中微管的动力学

本方案描述了利用聚合和去聚合循环从小规模或中等规模来源（如培养细胞或单个小鼠脑组织）中纯化微管蛋白的方法。所获得的纯化微管蛋白在特定异构体或特定翻译后修饰方面得到富集，可用于体外重建实验，以研究微管动力学及其相互作用。...

通过聚合-去聚合循环从有限来源纯化具有可控翻译后修饰和亚型的微管蛋白

同时可视化交联微管与单体微管的动力学行为 体外 通过全内反射荧光显微镜

此处，我们介绍一种微管束的重建方案 体外...

直接测量重建的活性微管束内部作用力

本文介绍了由微管和驱动蛋白马达制备活性向列相的方法，包括蛋白质的制备与构建，以及利用微井实现活性向列相的限制。...

形成、限制与观察基于微管的活性向列相

本方案描述了一种适用于小型仪器设备的猪脑微管蛋白高产率分离技术。该分离流程辅以微管蛋白聚合活性的测定方法。 体外...

优化从猪脑组织中提取微管蛋白的产量

本文介绍了一种从哺乳动物细胞中提取内源性微管蛋白的实验方案，这些细胞可缺乏或含有特定的微管修饰酶，从而获得富含特定修饰的微管。随后，我们描述了如何将提取的微管与纯化的微管结合蛋白进行孵育，以制备用于冷冻电子显微镜观察的载网样品。...

从哺乳动物细胞中提取修饰微管以通过冷冻电镜研究微管-蛋白质复合物

本方案详细介绍了适用于研究微管聚合力学的微流控装置的设计与制备方法。通过结合微加工技术、自动流体控制和计算建模技术，构建了一个灵活的系统，特别适用于细胞骨架的力学特性探究。 体外.

基于微流控技术的微管聚合力学研究方法的开发

学习定量微管分离技术，用于区分和量化小鼠组织中稳定微管、不稳定微管及游离微管蛋白。该方法可评估微管结构稳定性，有助于研究阿尔茨海默病和癌症等疾病。

定量微管分级分离技术：在小鼠组织中分离稳定微管、不稳定微管和游离微管蛋白

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