定量微管分离技术分离小鼠组织中稳定的微管、不稳定的微管和游离微管蛋白
November 17th, 2023
微管是微管蛋白聚合物，在真核细胞中作为细胞骨架成分起着至关重要的作用，并以其动态不稳定性而闻名。本研究开发了一种将微管分离为稳定微管、不稳定微管和游离微管蛋白的方法，以评估微管在各种小鼠组织中的稳定性。
我们的新方案有助于区分和量化管环的三种状态，例如动物组织中的稳定微管、不稳定微管和游离小管。该技术由简单的步骤组成，可以评估管材的结构稳定性，这不能通过对管材平移后修饰的量化来检测。该方法对于研究和开发对微管稳定性至关重要的疾病（如阿尔茨海默病和癌症）的治疗方法至关重要。
通过准备用于组织解剖的实验室服装来开始该过程。用碎冰装满一个盒子，然后在上面放两个培养皿。用冰冷的磷酸盐缓冲溶液或PBS填充一个培养皿，用于解剖组织的瞬时洗涤和储存。
将用PBS润湿的滤纸放在第二个培养皿上。接下来，称量装有PBS的1.5毫升微管，用于解剖组织储存。从安乐死的小鼠中提取组织后，将它们转移到试管中并重新称量每个微管。
将组织移入具有冰冷微管稳定缓冲液或MSB +培养基的玻璃匀浆器中，并立即使用冷冻匀浆器匀浆组织。现在使用巴斯德移液管将组织匀浆转移到两毫升微管中，并在2摄氏度下以2,400G离心三分钟。将上清液转移到新的 1.5 毫升微管中以除去碎屑。
在新的 1.5 毫升微管中涡旋上清液或 S1 级分。立即将 200 微升 S1 馏分移液到离心微管中，并使用 TLA-55 转子在 2 摄氏度下以 100， 000 G 离心 20 分钟。第二次离心后，将S2上清液与P2沉淀物分离。
立即将全部的 S2 馏分转移到离心微管中，并使用 TLA-120.2 转子在 2 摄氏度下以 500， 000 G 旋转 60 分钟。第三次离心后，将S3上清液与P3沉淀物分离。将整个 S3 馏分溶解在 200 微升 2X 十二烷基硫酸钠或 SDS 样品缓冲液中。
将剩余的 S1 级分与等体积的 2X SDS 样品缓冲液混合，用作蛋白质印迹的标准曲线。接下来，向 P2 和 P3 馏分管中加入 400 微升 SDS 样品缓冲液。然后，在将样品转移到新的 1.5 毫升微管中并将它们放入冰箱中之前，短暂地超声处理溶液以溶解沉淀物。
将所有样品在 100 摄氏度下煮沸三分钟。P2组分的微管占小鼠脑中α-微管蛋白总量的34.86%，而P3和S3组分的微管分别占56.13%和9.01%。P2、P3和S3组分中β-3微管蛋白的百分比与α-微管蛋白的百分比无显著差异。
S2 组分显示微管蛋白通过 300 千道尔顿超滤离心柱的通过有限，而 S3 组分允许微管蛋白复合物完全通过。色谱分离导致 S3 微管蛋白洗脱 100 千道尔顿。在每个馏分中回收等比例的α-和β-微管蛋白。
P2组分显著富集乙酰化α-微管蛋白，而酪氨酸化α-微管蛋白在P3组分中占主导地位。在匀浆之前冷冻大脑导致 P2 组分中 α-微管蛋白浓度降低。然而，α-微管蛋白在P3组分中增加。
冷冻还降低了 P2 组分中 α-微管蛋白的乙酰化水平并增加了酪氨酸化水平。诺考达唑治疗降低了 P2 组分中的 α-微管蛋白。与冷冻相比，诺考达唑不影响P2微管蛋白翻译后修饰。
脑组织中P2微管蛋白浓度显著升高，而P3微管蛋白集中在增殖组织中。Western blotting显示，在神经系统中特异性发现的P2微管蛋白起源于稳定的微管，而P3微管蛋白起源于不稳定的微管。微管的稳定性是高度动态的。
在低温环境中快速、不间断地完成该协议非常重要。还要确保组织和馏分在溶解在SDS样品缓冲液中之前没有被冷冻。将使用每个组分的免疫呈递与蛋白质组学相结合，有望确定参与微管动力学的因素。
使用这种方法，我们揭示了正常tau蛋白如何存在于微管上。它还可用于研究它在老年大脑中如何变得异常，以确定痴呆的新药物靶点。
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概述
本研究提出了一种新的协议，用于区分和量化动物组织中的稳定微管、不稳定微管和游离管蛋白。该方法评估了微管的结构稳定性，这对于理解阿尔茨海默病和癌症等疾病至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 微管动力学
背景
- 微管是真核细胞细胞骨架的重要组成部分。
- 它们表现出动态不稳定性，影响细胞功能。
- 理解微管稳定性对于治疗开发至关重要。
- 阿尔茨海默病和某些癌症等疾病与微管功能障碍有关。
研究目的
- 开发一种用于分离小鼠组织中微管的方法。
- 评估不同微管状态的稳定性。
- 增强对与微管相关疾病的理解。
使用的方法
- 准备用于组织解剖的实验室服装。
- 使用冰冷的磷酸盐缓冲液处理组织。
- 将微管分离为稳定、不稳定和游离的管蛋白。
- 通过新协议量化微管稳定性。
主要结果
- 该协议有效地区分了稳定和不稳定的微管。
- 量化结果揭示了不同组织中微管稳定性的见解。
- 该方法简单且可重复用于实验室。
- 研究结果有助于理解疾病背景下的微管动力学。
结论
- 这个新协议是研究微管稳定性的研究人员的有价值工具。
- 它在理解和治疗与微管功能障碍相关的疾病方面具有潜在应用。
- 进一步的研究可以在这些发现基础上探索治疗途径。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accurate assessment of microtubule stability is essential for evaluating therapeutic mechanisms in neurodegenerative diseases and cancers where cytoskeletal dynamics influence drug response. This fractionation technique enables direct quantification of stable, labile, and free tubulin pools in native tissues, providing a biochemical readout that complements imaging and modification-specific assays. By resolving functional microtubule states, the method supports target validation and mechanistic de-risking in early discovery programs focused on microtubule-modulating agents.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypothesis by quantifying shifts in stable versus labile microtubule populations in response to compound treatment.
- Operational Value: Provides a tissue-based biochemical assay to validate target engagement of microtubule-stabilizing or destabilizing agents.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by correlating biochemical microtubule stabilization with functional outcomes in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative tubulin fractionation data suitable for high-content screening of compound libraries targeting microtubule dynamics.
- Reproducibility: Uses standardized ultracentrifugation steps to generate consistent separation of microtubule fractions across experiments.
- Scalability: Compatible with western blotting and proteomic follow-up to identify regulators of microtubule stability from fractionated tubulin pools.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Detects tissue-specific variations in microtubule stability that correlate with proliferative capacity, enabling stratification of preclinical models.
- Translational Continuity: Links biochemical microtubule states to post-translational modification signatures (e.g., acetylation in stable, tyrosination in labile pools) for biomarker alignment.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by providing quantitative stability metrics that predict therapeutic index in microtubule-targeting programs.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, where microtubule stability serves as a pharmacodynamic biomarker for mechanism-of-action confirmation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring compound-induced shifts in microtubule polymerization states in native tissue lysates.
- Screening: Enables assay standardization through defined sedimentation thresholds (100,000 × g for stable, 500,000 × g for labile microtubules) to ensure reproducible fractionation.
- Analytics: Generates quantitative tubulin readouts via western blot of P2 (stable), P3 (labile), and S3 (free tubulin) fractions to compare compound effects.
- Translational Research: Connects microtubule fractionation data to tissue-specific expression patterns and modification profiles for preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable biochemical platform for assessing microtubule-targeting compounds across multiple disease areas and tissue types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by directly measuring microtubule polymerization states rather than relying solely on post-translational modifications.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized centrifugation parameters and temperature-controlled processing to preserve microtubule integrity.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by providing orthogonal validation of microtubule-targeting mechanism beyond cellular assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on quantitative stabilization efficacy in disease-relevant tissues.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue homogenization and ultracentrifugation techniques to maintain microtubule stability during processing.
- Dependent on access to high-speed rotors (TLA-55 and TLA-120.2) capable of 100,000 × g and 500,000 × g for fraction separation.
- Necessitates cross-team standardization of fractionation timing and temperature to ensure consistent results across laboratories.
- Requires adaptation of buffer composition and centrifugation parameters when applying the method to non-neural tissues with different microtubule densities.
- Limited by the need for immediate processing to prevent artifactual microtubule depolymerization during sample handling.
