定量微管分级分离技术：在小鼠组织中分离稳定微管、不稳定微管和游离微管蛋白

我们的新方案有助于区分和定量动物组织中微管环的三种状态，即稳定微管、不稳定微管和游离微管。该技术由简单的步骤组成，能够评估微管的结构稳定性，而这种稳定性无法通过微管翻译后修饰的定量分析来检测。该方法对于微管稳定性至关重要的疾病（如阿尔茨海默病和癌症）的治疗策略研发具有重要意义。

开始实验前，准备好用于组织解剖的实验防护装备。取一个容器装入碎冰，并将两个培养皿置于冰上。其中一个培养皿中加入冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS），用于组织样本的短暂清洗和临时保存。

将用 PBS 润湿的滤纸铺在第二个培养皿上。接着，称量装有 PBS 的 1.5 毫升离心管，用于存放解剖所得组织。从小鼠体内取出组织后，立即将其转移至离心管中，并重新称量每个离心管。

将组织转移至含有冰冻微管稳定缓冲液或MSB+培养基的玻璃匀浆器中，并立即使用预冷的匀浆器匀浆组织。随后用巴斯德吸管将组织匀浆液转移至2毫升微量离心管中，在2°C条件下以2,400 G离心3分钟。将上清液转移至新的1.5毫升微量离心管中，以去除碎片杂质。

将上清液或S1组分在新的1.5毫升微量离心管中涡旋混匀。立即用移液器吸取200微升S1组分至离心微量管中，在2摄氏度条件下使用TLA-55转子以100,000 G离心20分钟。第二次离心后，将S2上清液与P2沉淀分离。

立即将S2上清液的全部组分转移至离心微量管中，使用TLA-120.2转子在2°C条件下以500,000 G离心60分钟。第三次离心后，分离S3上清液与P3沉淀。将全部S3组分溶解于200 µL的2X十二烷基硫酸钠（SDS）样品缓冲液中。

将剩余的S1组分与等体积的2X SDS上样缓冲液混合，用于制备蛋白质印迹实验的标准曲线。接着，向P2和P3组分的离心管中各加入400微升SDS上样缓冲液。然后，对溶液进行短时间超声处理，以溶解沉淀物，再将样品转移至新的1.5毫升微量离心管中，并置于冰盒中保存。

将所有样品在 100 摄氏度下煮沸三分钟。小鼠脑组织中 P2 组分的微管占总 α-微管蛋白的 34.86%，而 P3 和 S3 组分中的微管分别占 56.13% 和 9.01%。P2、P3 和 S3 组分中 β-3 微管蛋白的比例与 α-微管蛋白相比无显著差异。

S2组分中微管蛋白通过300千道尔顿超滤离心柱的透过有限，而S3组分则允许微管蛋白复合物完全透过。层析分离得到S3微管蛋白在100千道尔顿处洗脱。每个组分中回收的α-和β-微管蛋白比例相等。

P2组分中乙酰化α-微管蛋白显著富集，而P3组分中以酪氨酸化α-微管蛋白为主。在匀浆前对脑组织进行冷冻，会导致P2组分中α-微管蛋白浓度降低，但P3组分中的α-微管蛋白则有所增加。

冷冻还降低了P2组分中α-微管蛋白的乙酰化水平，并增加了其酪氨酸化水平。诺考达唑处理减少了P2组分中的α-微管蛋白含量。与冷冻不同，诺考达唑对P2组分微管蛋白的翻译后修饰没有影响。

脑组织中P2微管蛋白的浓度显著较高，而P3微管蛋白则集中在增殖组织中。Western印迹结果显示，神经系统中特异性存在的P2微管蛋白来源于稳定的微管，而P3微管蛋白则来源于不稳定的微管。微管的稳定性具有高度动态性。

必须在低温环境中快速且不间断地完成本实验方案。同时确保组织和各组分在溶解于SDS样品缓冲液之前始终未被冷冻。通过将各组分的免疫印迹分析与蛋白质组学相结合，有望鉴定出参与微管动态调控的相关因子。

利用该方法，我们揭示了正常tau蛋白在微管上的存在形式。该方法还可用于研究tau蛋白在衰老大脑中如何发生异常，从而识别出痴呆症新的药物靶点。