Name: 合并的shRNA文库筛选，以确定调节耐药性表型的因素 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 51 s
Description: 了解合并shRNA表观遗传文库筛选技术，用于鉴定急性髓系白血病中调控阿糖胞苷耐药性的关键表观遗传因子。该方法通过MV4-11耐药细胞系进行负向选择筛选，结合测序分析揭示耐药机制。

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本研究部分由生物技术部资助，资助编号为 BT/PR8742/AGR/36/773/2013，授予 SRV；以及印度生物技术部 BT/COE/34/SP13432/2015 和印度科学技术部 EMR/2017/003880，授予 P.B。RVS 和 P.B. 分别获得惠康基金会-DBT印度联盟项目 IA/S/17/1/503118 和 IA/S/15/1/501842 的支持。S.D. 获得 CSIR-UGC 博士研究员奖学金支持，S.I. 获得印度医学研究委员会高级研究员奖学金支持。我们感谢 Abhirup Bagchi、Sandya Rani 以及 CSCR 流式细胞术核心设施工作人员提供的帮助。同时感谢 MedGenome 公司在高通量测序和数据分析方面提供的协助。

遵循机构生物安全委员会（IBSC）指南，并在适当的设施中操作慢病毒（BSL-2）。操作人员应接受慢病毒处理与处置的适当培训。本方案遵循印度韦洛尔基督教医学院的生物安全指南。
1. 选择最有效的启动子以获得shRNA的持久和长期表达
注意：使用表达荧光蛋白的、带有不同启动子的慢病毒载体进行转导实验至关重要，以确定在实验所选细胞系中能够实现shRNA稳定且长期表达的启动子。常用于此目的的启动子包括表达绿色荧光蛋白（GFP）的人EF1α（人延伸因子1α）、hCMV（人巨细胞病毒）和SSFV（脾灶形成病毒）启动子（图2A）。
<ol>
	<li>使用台盼蓝排斥法进行细胞计数。将 MV4-11 AraC R 细胞悬浮于含 8 µg/mL 多聚素的 10% RPMI 培养基（RPMI 加 10% 胎牛血清，并补充 100 U/mL 青霉素和 100 U/mL 链霉素）中。每孔加入 1.5 mL 培养基，按每孔 1 × 106 个细胞接种至 6 孔板中，设三个重复孔。</li>
	<li>向各孔中加入不同体积的浓缩慢病毒（例如，根据慢病毒滴度加入 10 µL、20 µL 或 40 µL）。轻轻摇晃培养板以混匀内容物。</li>
	<li>在 37 °C 条件下，以 920 ×g 离心 90 分钟，进行离心感染（spinfection）。</li>
	<li>立即放入 CO2 培养箱（37 °C，5% CO2）中孵育。</li>
	<li>感染 48 小时后，在荧光显微镜下观察 GFP 表达情况，以确认转导成功。</li>
	<li>感染 72 小时后，通过流式细胞术定量检测 GFP 表达，以评估转导效率。</li>
	<li>将细胞连续培养共 2 周，并定期通过流式细胞术监测 GFP 表达。GFP 表达的降低，以平均荧光强度和 GFP 阳性细胞百分比的下降为指标，提示启动子发生沉默。</li>
	<li>在第 10 天对 GFP 阳性细胞进行分选，分选后继续培养 1 周。培养期间定期检测 GFP 表达情况。</li>
	<li>使用未转导的细胞设定门控范围。在 x 轴上位于 1 × 101 标度右侧的细胞群体被视为 GFP 阳性群体。</li>
	<li>选择在细胞长期培养过程中仍能维持 GFP 持续表达的启动子。</li>
</ol>
2. 混合慢病毒人类表观遗传因子shRNA文库的制备
<ol>
	<li>将293T细胞（低代次且增殖状态良好）接种于三个10 cm细胞培养皿中，每皿加入8 mL含10%胎牛血清（FBS）并添加100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的DMEM培养基（即10% DMEM培养基）。</li>
	<li>当细胞融合度达到60%时，更换为完全培养基。</li>
	<li>配制转染混合液（如表1所示），其中包含无血清培养基、慢病毒包装质粒（psPAX2）、包膜质粒（pMD2.G）、文库质粒混合物，以及转染试剂。</li>
	<li>轻弹混匀后，室温孵育15分钟。</li>
	<li>将转染混合液加入293T细胞中，轻轻晃动培养皿混匀。将培养皿置于CO2培养箱（37 °C，5% CO2）中孵育。24小时后更换培养基。</li>
	<li>48小时后，在荧光显微镜下观察GFP表达情况，以确认293T细胞具有较高的转染效率。</li>
	<li>分别在转染后48小时、60小时和72小时收集病毒上清液，并置于4 °C保存。每次收集病毒后，向每皿中补充8 mL新鲜培养基。</li>
	<li>合并收集的病毒上清液。合并后的病毒总体积为：约8 mL/皿 × 3次收集 = 约24 mL/皿；约24 mL/皿 × 3个培养皿 = 来自3个培养皿的总计约72 mL。</li>
	<li>使用0.4 µm滤器过滤合并的病毒液。</li>
	<li>为获得高滴度病毒，需通过超速离心浓缩病毒液。将过滤后的病毒上清液转移至两个70 Ti离心管中（每管32 mL），在4 °C预冷的离心机和转子中，以18,000x g离心2小时，加减速设置为慢速。</li>
	<li>小心从离心机中取出离心管，彻底弃去上清液。</li>
	<li>使用微量移液器，用400 µL不含FBS和抗生素的DMEM培养基轻轻重悬沉淀。冰上孵育1小时，并将两管中的沉淀混合均匀。</li>
	<li>将病毒分装后于−80 °C冻存。 
	注意：步骤2.10–2.13期间，离心管和病毒必须始终保持在冰上。使用基础培养基重悬病毒时避免产生气泡。培养基应维持在4 °C。</li>
	<li>按下述方法计算病毒浓缩倍数（x）： 
	浓缩前总体积 = 72 mL（72,000 µL） 
	浓缩后体积 = 400 µL 
	浓缩倍数 = 72,000/400 = 180x</li>
</ol>
3. 慢病毒转导效率的估算
<ol>
	<li>用不同体积（2 µL、4 µL、8 µL）的浓缩病毒转导293T细胞，以确认慢病毒成功制备。 
	注意：如果浓缩病毒在小体积（1–2 µL）下表现出高转导效率（&#62;50%），建议将浓缩病毒按所需倍数稀释（100倍至75倍）。</li>
	<li>用不含FBS和抗生素的DMEM将浓缩病毒稀释100倍，用于在MV4-11 AraC R细胞系中进行滴定实验。</li>
	<li>在六孔板的一个孔中接种1 × 106个细胞（含8 µg/mL polybrene的1.5 mL 10% RPMI培养基中的MV4-11 AraC R细胞系）。准备四个孔，用于加入不同体积的病毒进行转导。</li>
	<li>分别加入四种不同体积的100倍稀释病毒（例如，1 µL、1.5 µL、2 µL和2.5 µL）。</li>
	<li>通过在37 °C下以920 ×g离心90分钟进行离心转导（spinfection）。</li>
	<li>72小时后，通过流式细胞术检测GFP+细胞的百分比。</li>
	<li>确定获得30%转导效率所需的病毒体积。选择较低的转导效率是为了确保每个细胞中仅整合单个shRNA。</li>
</ol>
4. 在耐药细胞系中转导混合表观遗传shRNA文库
<ol>
	<li>将靶细胞系 MV4-11 AraC R 维持在 0.5 × 106 个细胞/mL 的密度，确保细胞处于培养的对数生长期。</li>
	<li>根据病毒整合拷贝数计算实验所需细胞数量，方法如下： 
转导所需细胞数 = 5,485（shRNA 数量）× 500（shRNA 覆盖倍数）/ 0.25（MOI）= 10,982,000 ≈ 11 × 106 个细胞</li>
	<li>将 1.1 × 107 个细胞重悬于 16 mL 的 10% RPMI 培养基中。</li>
	<li>加入聚凝胺（终浓度 8 µg/mL），充分混匀，然后加入前一步计算所得体积的病毒，以达到约 30% 的转导效率。</li>
	<li>将所有细胞接种至六孔板中，每孔接种密度为 1 × 106 个细胞/1.5 mL 10% RPMI 培养基。</li>
	<li>在 37 °C 条件下，以 920 × g 离心 90 分钟。</li>
	<li>将六孔板置于 CO2 培养箱中（37 °C，5% CO2）过夜培养。</li>
	<li>24 小时后更换培养基，并将转导后的细胞转移至 T-75 培养瓶中。</li>
	<li>48 小时后，在荧光显微镜下观察 GFP 表达，以确认转导成功。</li>
	<li>72 小时后，通过流式细胞术定量检测 GFP+ 细胞的百分比。</li>
</ol>
5. 富集GFP阳性细胞
注意：将转导后的细胞以 0.5 × 106 个细胞/mL 的密度培养 5–7 天进行扩增。这些细胞为转导与未转导细胞的混合群体，后续步骤中将根据 GFP 表达通过分选进行筛选。
<ol>
	<li>使用流式分选设置（高纯度、低得率）对GFP+转导细胞进行流式分选。利用未转导的细胞设定分选门。向右侧超过1 x 102 的细胞群被视为阳性群体。</li>
	<li>将分选出的细胞收集至5% RPMI培养基中（RPMI添加5%胎牛血清，并补充100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素）。</li>
	<li>将分选出的细胞在10% RPMI培养基中进行培养。</li>
	<li>72小时后，检测分选后GFP+细胞的百分比，以确认&#62;95%的分选效率。 
	注意：为获得shRNA文库约450至500倍的覆盖度，确保分选后获得约3-5 x 106个GFP阳性细胞。</li>
</ol>
6. 通过敲除筛选鉴定介导药物耐药性的表观遗传因子
<ol>
	<li>将转导shRNA文库的细胞在10% RPMI培养基中培养最多5天。如需在药物处理前将转导的细胞冷冻保存以用于后续实验。</li>
	<li>在25 °C下，以280 × g离心1 × 107个细胞，重复两份，离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀在−80 °C保存。这些样品将作为表观遗传shRNA文库的基线对照。</li>
	<li>将剩余的转导细胞分成两份（R1和R2）进行培养，每份维持细胞数量达到文库的500倍覆盖度。</li>
	<li>对其中一份重复样本施加药物处理（10 µM 阿糖胞苷）（R2），另一份不加药物处理（R1）。</li>
	<li>每72小时更换一次含药和不含药培养瓶的培养基。共更换3次，累计药物暴露时间为9天。</li>
	<li>经过9天药物处理后，采用台盼蓝排斥法检测细胞活力。</li>
	<li>在室温下以280 × g离心剩余细胞5分钟。用无菌PBS重悬细胞并洗涤，随后在室温下以280 × g再次离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞沉淀在−80 °C保存，用于后续DNA提取。</li>
</ol>
7. 通过PCR扩增整合的shRNA
<ol>
	<li>从转导的基础细胞（T）、药物处理的细胞（R2）以及未用药物处理的细胞（R1）中提取DNA（步骤6.2）。</li>
	<li>使用荧光计检测样品的浓度。</li>
	<li>按以下方法计算PCR所需的DNA量： 
	5,485（shRNA数量）× 500（shRNA覆盖数）× 1 × 6.6−12（g/二倍体基因组）= 15 µg DNA</li>
	<li>对样品进行第一轮PCR扩增。 
	注：PCR反应体系如表2所示，并包含热循环仪的反应条件。引物详细信息见补充表1。</li>
	<li>设置多个反应，每管加入850 ng DNA（共43个反应）。 
	注：第一轮PCR扩增shRNA的侧翼区域，得到大小为397 bp的扩增产物。</li>
	<li>合并PCR产物，并使用3-4个标准凝胶/PCR纯化试剂盒的纯化柱对PCR产物进行纯化。 
	注：详细操作见表3。</li>
	<li>用每根纯化柱的洗脱缓冲液各洗脱50 µL，合并所有洗脱液。</li>
	<li>定量DNA并储存于−20 °C。 
	注：试剂信息列于表4，并包含热循环仪的反应条件。第二轮PCR使用带有INDEX序列的引物，以便在NGS单通道芯片中进行多重分析。因此，每个样品应标记不同的index。引物序列见补充表1。</li>
	<li>每个样品及阴性对照均设置四个反应，每个反应加入500 ng第一轮PCR产物，总体积为50 µL。</li>
	<li>将全部PCR产物上样进行电泳，使用2% TBE琼脂糖凝胶，并用1 kb分子量标记物确认条带大小。扩增产物大小为399 bp。</li>
	<li>在凝胶成像系统中观察PCR产物。</li>
	<li>切下目标条带，并使用凝胶纯化试剂盒进行纯化。 
	注：试剂盒纯化相关计算见表3。</li>
	<li>用30 µL洗脱缓冲液进行最终洗脱。每个洗脱液的浓度约为80–90 ng/µL，总体积为30 µL。</li>
</ol>
8. 下一代测序与数据分析
<ol>
	<li>对第7.13步中经凝胶纯化后的产物使用下一代测序仪（例如Illumina）进行测序，以获得耗竭型shRNA的读段数。</li>
	<li>使用Fastx-tool kit（版本0.7）对生成的FastQ读段进行接头序列截短处理。</li>
	<li>使用Bowtie比对工具将过滤后的读段比对至参考序列，参数设置为允许两个错配。确保接头截短后的读段长度约为21 bp。</li>
	<li>使用Samtools（版本1.9）程序加载文件，使用Flagstat选项并计算比对结果汇总。</li>
	<li>在CRISPRCloud2（CC2）软件（https://crispr.nrihub.org/）中加载截短后的fastQ文件，并同时上传以FASTA文件格式提供的参考shRNA序列，按照软件说明进行分析。
	<ol>
		<li>在CC2中点击Start Analysis链接。</li>
		<li>选择筛选类型为“Survival”和“Dropout”筛选。设置组数，并为每组输入名称。</li>
		<li>以FASTA文件格式上传参考文库。上传的数据将被处理。点击输出URL以获取结果。 
		注：该软件采用贝塔-二项分布模型结合改良的Student's t检验来检测sgRNA/shRNA水平的差异，随后使用Fisher联合概率检验评估基因水平的显著性。其计算经处理（富集或耗竭）样本与未处理样本（基线）之间表观遗传因子shRNA的估计总体log2倍数变化（Log2Fc），并提供&#34;p值&#34;和&#34;FDR值&#34;。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确保Dropout筛选的FDR值为&#34;负值&#34;，而Survival筛选的FDR值为&#34;正值&#34;。 
	注：CC2是一个用于统计读段数并计算shRNA在不同样本间富集或耗竭倍数的分析平台。</li>
	<li>从CC2结果中鉴定出显著富集或耗竭的shRNA（FDR &#60;0.05）。 
	注：针对每个因子有5–24条shRNA。检查每条shRNA的FDR值；优先考虑FDR &#60;0.01的shRNA，并对所选shRNA取平均值。考虑前40个显著结果。根据Log2Fc或FDR负值绘制所选因子的图表。确保非靶向shRNA也具有显著的FDR值，以验证数据的真实性，因其作为对照shRNA发挥作用。</li>
</ol>

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</ol>

作者无利益冲突，无可披露内容。

RNA干扰（RNAi）被广泛应用于功能基因组学研究，包括siRNA和shRNA筛选。shRNA的优势在于其可被插入质粒载体并整合到基因组DNA中，从而实现稳定表达，因此对靶标mRNA的沉默效果更持久。与传统的阵列式筛选（siRNA）相比，混合shRNA文库筛选具有更高的稳健性和成本效益。在全基因组范围内鉴定某一特定类别蛋白质的功能重要性可能较为繁琐。靶向筛选策略能够在特定蛋白类别中揭示各个蛋白质对癌细胞存活或药物耐药性的功能重要性，同时降低背景噪声。本实验方案重点介绍针对表观遗传因子的RNAi筛选，以系统性地研究必需基因和非必需基因，并展示该方法作为功能筛选平台的应用，用于鉴定介导急性髓系白血病（AML）药物耐药性的关键靶点。
这项强大技术在实验设计与实施过程中需要采取某些预防措施。首先，应选择在细胞培养期间不会发生显著沉默的启动子，以表达shRNA，因为其高效表达对于靶基因的敲低至关重要。其次，维持shRNA的代表性（即每种shRNA转导的细胞数量）尤为关键。在整个shRNA筛选过程中，每种shRNA构建体平均由&#62;500个细胞代表，有助于提高识别引起表型效应的shRNA的...

在过去近五十年中，急性髓系白血病（AML）的治疗方案一直未有改变，以阿糖胞苷（AraC）和蒽环类药物作为治疗该疾病的核心手段。AML治疗面临的一个挑战是白血病干细胞对化疗药物的耐药性，从而导致疾病复发1,2。表观遗传调控在癌症发病机制和药物耐药性中发挥关键作用，多个表观遗传因子已作为有前景的治疗靶点被提出3,4,5。表观遗传调控机制影响细胞在持续暴露于化疗药物条件下的增殖与存活。在非血液系统恶性肿瘤中的研究报道，有少量细胞能够克服药物作用，并经历多种表观遗传学修饰，从而实现存活6,7。然而，表观遗传因子在介导AML中对阿糖胞苷产生获得性耐药方面的作用尚未被研究。
高通量筛选是一种药物发现方法，其全球重要性日益增加，现已成为识别细胞机制中潜在靶点、进行通路分析以及分子水平研究的标准方法8,9。合成致死概念涉及两个基因之间的相互作用，单独扰动其中任一基因仍可维持细胞存活，但同时扰动两个基因则导致细胞失去活力10。在癌症治疗中利用合成致死效应，有助于识别并从机制上表征稳定的合成致死基因相互作用11。我们采用高通量shRNA筛选与合成致死相结合的策略，以鉴定在急性髓系白血病（AML）中导致阿糖胞苷获得性耐药的表观遗传因子。
由混合谱系白血病基因染色体易位驱动的急性白血病（MLL 或 KMT2A与患者生存率差相关。所产生的嵌合产物 MLL 基因重排，即 MLL 融合蛋白（MLL-FPs），可在多种表观遗传因子的参与下，将造血干细胞/祖细胞（HSPCs）转化为白血病母细胞。这些表观遗传调控因子构成一个复杂的网络，主导白血病程序的维持，因此可能成为潜在的治疗靶点。在此背景下，我们利用携带 MLL 融合基因 MLL-AF4 及 FLT3-ITD 突变的 MV4-11 细胞系（称为 MV4-11 P），建立了获得性阿糖胞苷耐药细胞系，命名为 MV4-11 AraC R。该细胞系通过间歇性停药（即药物假期）并逐步增加阿糖胞苷剂量进行诱导。半数最大抑制浓度（IC50）通过以下方法测定： 体外 细胞毒性检测
我们使用了由hEF1a启动子驱动、以pZIP慢病毒为骨架的表观遗传学shRNA文库（见材料表）。该文库包含靶向407个表观遗传因子的shRNA，每个因子对应5至24个shRNA，总共5,485个shRNA，其中包括5个非靶向对照shRNA。经过改造的&#34;UltrmiR&#34; miR-30支架结构已优化，可高效实现初级shRNA的生物合成与表达12,13。
本实验的流程如图1A所示。当前方案重点是利用表观遗传因子shRNA文库在MV4-11 AraC R细胞系（图&#160;1B）中进行RNAi筛选，该细胞系为悬浮生长细胞系。本方案可用于在任意选定的耐药细胞系中筛选任何靶向文库。需要注意的是，贴壁细胞的转导方案将有所不同。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 bp Ladder Hyper Ladder</td><td>BIOLINE</td><td>BIO-33025</td><td></td></tr><tr><td>1kb Ladder Hyper Ladder</td><td>BIOLINE</td><td>BIO-33056</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Lonza Seachekm</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>甜菜碱（5 mM）</td><td>Sigma</td><td>B03001VL</td><td></td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Qualigens</td><td>12005</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养塑料器皿</td><td>Corning</td><td>as appicable</td><td></td></tr><tr><td>盐酸阿糖胞苷（Cytosine &amp;beta;-D-arabinofuranoside hydrochloride）</td><td>Sigma</td><td>C1768-500MG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>MP BIO</td><td>91233354</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Wak Chemie GMBH</td><td>Cryosure DMSO 10ml</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Sigma</td><td>E1510-10 mL</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>凝胶/PCR 纯化试剂盒</td><td>MACHEREY-NAGEL</td><td>REF&amp;nbsp;740609.50</td><td></td></tr><tr><td>Gibco- RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23400021</td><td></td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Thermo</td><td>Q11007</td><td></td></tr><tr><td>hCMV GFP 质粒</td><td>Transomics</td><td>TransOmics Promoter selection KIT</td><td></td></tr><tr><td>hEF1a GFP 质粒</td><td>Transomics</td><td>TransOmics Promoter selection KIT</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>HL60 细胞系</td><td>ATCC</td><td>CCL-240</td><td></td></tr><tr><td>KOD Hot Start 聚合酶</td><td>Merck</td><td>71086</td><td></td></tr><tr><td>Molm13 细胞系</td><td>Ellen Weisberg 实验室，达纳-法伯癌症研究所，波士顿，马萨诸塞州，美国</td><td>达纳-法伯癌症研究所，波士顿，马萨诸塞州，美国</td><td></td></tr><tr><td>MV4-11 细胞系</td><td>ATCC</td><td>CRL-9591</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2 和 pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>Addgene 质粒编号 12260 &amp;amp; Addgene 质粒编号 12259</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 检测试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>REF Q32854</td><td></td></tr><tr><td>SFFV&amp;nbsp; GFP 质粒</td><td>Transomics</td><td>TransOmics Promoter selection KIT</td><td></td></tr><tr><td>来自 Transomics 的 shERWOOD-UltrmiR shRNA 文库</td><td>Transomics</td><td>货号 TLH UD7409；批号 A116.V 132.14</td><td></td></tr><tr><td>Trans-IT-LTI Mirus</td><td>Mirus</td><td>Mirus 目录编号：MIR2300</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>MP Biomedicals</td><td>0219485591</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-100ML</td><td></td></tr><tr><td>超速离心管</td><td>Beckman Coulter</td><td>&amp;nbsp;103319</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Aria III 细胞分选仪</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter Optima L-100K 超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Thermo Multiguge 3SR+</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc 成像系统&amp;nbsp;（Fluro Chem M 系统）</td><td>Fluro Chem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica AF600</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Zeiss Axiovert 40c</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 荧光计</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR 仪</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用shrna文库筛选鉴定调控药物耐受表型的因素

Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype

阐明急性髓系白血病（AML）患者获得性化疗耐药的临床相关驱动机制，对于揭示克服耐药性并改善患者生存率的方法至关重要。在化疗后存活的一小部分白血病细胞具有预先准备的表观遗传状态，能够耐受化疗药物的损伤。进一步的化疗暴露使这些药物持久性细胞获得稳定的表观遗传状态，导致基因表达改变，从而促进耐药细胞群体的增殖，最终导致疾病复发或难治。因此，鉴定维持耐药白血病细胞存活所必需的表观遗传调控因子至关重要。本文详细描述了一种利用混合shRNA文库筛选技术，在获得性阿糖胞苷（AraC）耐药的AML细胞系中鉴定介导对核苷类似物阿糖胞苷耐药的表观遗传调控因子的实验方案。该文库包含5,485个shRNA构建体，靶向407个人类表观遗传因子，可实现表观遗传因子的高通量筛选。

整体筛选流程如 图1A所示。体外细胞毒性实验显示，MV4-11 AraC R细胞系对阿糖胞苷（48 h）的IC50值高于MV4-11 P细胞系（图1B）。本研究采用该细胞系作为模型，用于筛选介导阿糖胞苷耐药的表观遗传因子。
图 2A 显示了线性化的 pZIP 载体图谱，包含三种不同的启动子：hEF1α（人延伸因子 1α）、hCMV（人巨细胞病毒）和 SSFV（脾灶形成病毒），其中包含位于 UltramiR 序列内的乱序 shRNA。图 2B 展示了在文库实验中使用的 pZIP 载体图谱，该载体包含靶向表观遗传因子的 shRNA，并以 Zsgreen 和嘌呤霉素作为筛选标记，由 hEF1a 启动子驱动表达。这些载体用于最强启动子筛选实验。
在...

利用慢病毒shRNA文库进行高通量RNA干扰（RNAi）筛选，可作为发现恶性肿瘤中具有治疗意义的合成致死靶点的工具。我们提供一种基于shRNA文库的筛选方法，用于研究急性髓系白血病（AML）中的表观遗传调控因子。

利用shRNA文库筛选鉴定调控药物耐受表型的因素

理解获得性化疗耐药的临床相关驱动机制，对于阐明克服耐药性并改善治疗效果的途径至关重要。

本视频的总体目标是演示如何利用汇集的shRNA表观遗传文库进行负向筛选。该筛选可通过测序鉴定特定的表观遗传靶点。此方法有助于鉴定介导急性髓系白血病（AML）中获得性阿糖胞苷耐药性的表观遗传因子。具体步骤如下。选择最有效的启动子以实现shRNA的持久和长期表达。本实验方案的重点是利用表观遗传因子shRNA文库，在阿糖胞苷耐药的MV4-11细胞系中进行RNA干扰筛选。所使用的启动子包括人EF-1α、人CMV和SFFV启动子，这些启动子可表达绿色荧光蛋白。使用台盼蓝染色排除法进行细胞计数。将细胞悬浮于含有8 µg/mL 多聚素（polybrene）的10% RPMI 培养基中。每孔加入1.5 mL 培养基，按每孔100万个细胞接种于6孔板中，每组设三个重复孔。加入不同体积的浓缩慢病毒。例如，根据慢病毒的滴度，向每孔加入10、20和40 µL的慢病毒。轻轻摇动培养板以混匀内容物。在37摄氏度下以920 ×g离心90分钟进行旋转感染。随后立即将培养板放入二氧化碳培养箱中孵育。在转染后48小时观察绿色荧光蛋白（GFP）表达，并在72小时时进行定量分析。接下来，按照流程图所示步骤，选择在整个培养过程中表现出稳定GFP表达的启动子。制备汇集的慢病毒人类表观遗传因子shRNA文库。将293T细胞以较低传代次数、良好增殖状态，在三个10厘米细胞培养皿中培养，每个培养皿中加入8 ml 10% DMEM培养基。当细胞达到60%融合度时，完全更换为新鲜培养基。按照如下步骤制备转染混合物：将无血清培养基、慢病毒包装质粒PAX2、包膜质粒pMD2.G、文库质粒混合物以及转染试剂依次加入并混匀。轻敲混合物使其充分混匀，在室温下孵育15分钟。将转染混合物加入293T细胞中，通过轻轻晃动培养板混匀。将培养板置于二氧化碳培养箱中孵育。24 小时后更换培养基。48 小时后，在荧光显微镜下观察 GFP 表达，以确认转染 293T 细胞的效率是否较高。分别在 48、60 和 72 小时收集病毒上清液，置于 4 °C 保存，并在每次收集病毒后加入 8 mL 新鲜培养基。用0.4微米滤器过滤混合的病毒。为了获得高滴度的病毒，可通过超速离心浓缩混合的病毒。将过滤后的病毒上清液转移至70 Ti离心管中，在18,000 g下离心2小时。使用预冷的转子，在 4 度条件下离心。小心从离心机中取出离心管，彻底去除上清液。用移液器将沉淀物轻轻重悬于 400 µL 不含 FBS 和抗生素的 DMEM 中，冰上孵育 1 小时。将病毒分装后于-80摄氏度冷冻保存。按所示方法计算病毒浓度。慢病毒转导效率的估算。使用不同体积（2、4 和 8）的浓缩病毒转导 293T 细胞，以确认慢病毒的成功制备。将浓缩病毒稀释至 100 倍，用于在靶细胞系中进行滴定实验。在六孔板的一个孔中，加入含有 8 微克/毫升聚凝胺的 1.5 毫升 10% RPMI 培养基，接种 100 万靶细胞。加入四种不同体积的100倍浓缩病毒，分别为1、1.5、2、2.5 µL。将培养板在37°C条件下，以920 ×g离心90分钟，进行离心感染（spinfection）。72小时后，通过流式细胞术检测GFP阳性细胞的百分比。确定病毒的体积，以获得30%的转导效率。这种低转导效率可确保每个细胞中单个shRNA的整合。在耐药细胞系中进行表观遗传shRNA文库的转导。根据病毒整合数计算实验所需细胞数量，方法如下。将1100万个细胞重悬于16 mL含10%胎牛血清的RPMI培养基中。加入终浓度为8 µg/mL的聚凝胺，充分混匀，然后加入预先计算好的病毒体积，以达到30%的转导效率。将所有细胞以每孔150万细胞、1.5 ml的密度接种于六孔板中。在37摄氏度下，以920 ×g离心90分钟。将六孔板置于二氧化碳培养箱中过夜培养。24 小时后，更换培养基并将转导的细胞转移至 T-75 培养瓶。48 小时后，在荧光显微镜下观察 GFP，以确认转导成功。72 小时后，通过流式细胞术定量检测 GFP。富集GFP阳性细胞。将转导后的细胞以每毫升50万个的密度培养5至7天以扩增细胞，然后使用流式分选仪进行分选，分选条件设置为高纯度、低得率。将分选后的细胞在10% RPMI培养基中培养。72 小时后，进行分选后 GFP 阳性细胞百分比的估算，以确保分选效率超过 95%。通过剔除筛选鉴定介导药物耐药性的表观遗传因子。将转导 shRNA 文库的细胞在 10% RPMI 培养基中培养最多 5 天。将一千万个细胞分两份进行离心。弃去上清液，并将沉淀物保存在负80度。这些样品将作为表观遗传shRNA文库的基线对照。将剩余的转导细胞以500倍文库覆盖率的细胞数量，分别以重复组R1和R2进行培养。对其中一个重复组施加药物处理（10 µM 阿糖胞苷），另一个重复组则不加药物。每72小时更换含药和不含药培养瓶中的培养基。重复换液三次，累计药物处理时间为9天。药物处理第9天时，采用台盼蓝排斥法检测细胞活力。将剩余的活细胞离心沉淀，用无菌PBS洗涤，并在室温下以280 g离心5分钟。弃去上清液，将沉淀物于-80℃保存，用于DNA提取。通过PCR扩增整合的shRNA。从转导的基线细胞、经处理和未处理的细胞中提取DNA，随后使用荧光计检测浓度，按所示计算所需DNA量，并将样品进行第一轮PCR反应。PCR反应体系如表2所示，并附有热循环仪的反应条件。设置多组反应，每管含有850纳克DNA，共计43个反应。将PCR产物混合后进行纯化。用50 µL缓冲液洗脱产物并进行定量，最后于-20 °C保存。进行第二轮PCR时，使用反向index引物，试剂见表4。每个样本取500 ng的首轮PCR产物，总体积为50 µL，设置四个反应，并设置阴性对照。将全部产物上样进行电泳，使用2% TBE琼脂糖凝胶，并用1 kb DNA分子量标准确认条带大小。在凝胶成像系统中观察PCR产物。切下特异性条带，并使用凝胶回收试剂盒进行纯化。使用试剂盒进行纯化的计算结果见表3。用30微升洗脱缓冲液洗脱，最终体积约为30微升，各洗脱液的浓度大约为每微升80至90纳克。下一代测序及数据分析。将凝胶纯化后的产物进行高通量测序，以获得耗竭型shRNA的读段数。剪切接头序列，将过滤后的读段比对至参考序列，使用SAMtools加载文件以获取比对结果摘要。在CRISPRCloud2中载入剪切后的fastQ文件，并按照说明进行分析。点击提供的链接进入 CRISPRCloud2，选择筛选类型为生存筛选和基因敲除筛选。设置组数，并为每组输入名称。以 FASTA 文件格式上传参考文库。上传的数据将被处理，结果可在指定的 URL 中查看。代表性数据。该图显示了MV4-11亲本细胞和耐药细胞在浓度递增的阿糖胞苷（0.1 微摩尔至1,000 微摩尔）处理下的存活率，通过MTT法进行评估。该图展示了在72小时结束时，通过流式细胞术检测GFP表达水平的代表性流式图，所用启动子包括人EF-1α、人CMV和SFFV启动子。其中人CMV呈现异质性峰，而人EF-1α和SFFV则显示单一均质峰。该图显示了 MV4-11 细胞中三种不同启动子效率的柱状图。由 SFFV 驱动的 GFP 在长期培养中出现 GFP 沉默现象。而由 hEF-1 alpha 驱动的 GFP 细胞在分选后表现出持续的表达。左图显示了在转染48小时后，通过荧光显微镜观察到的shRNA文库在293T细胞中的转染效率。右图显示了不同病毒体积（2、4和8微升）下，病毒文库在293T细胞中的转导效率。该图展示了在MV4-11耐药细胞系中，使用不同体积的病毒（如1、1.5、2、2.5微升）进行转导，以达到30%转导效率的结果。该图显示了转导效率为30%的GFP阳性细胞，采用高纯度、低产量分选模式进行分选。图中示意性地展示了对分选出的GFP阳性细胞进行药物处理的实验流程，包括长达9天的阿糖胞苷暴露处理，随后检测细胞活力并收集细胞用于DNA提取。该图还显示了在第一轮和第二轮PCR中所用引物的结合区域。该图展示了第一轮 PCR 结束时 PCR 产物的条带大小为 397 个碱基对，第二轮 PCR 产物为 399 个碱基对，后者经凝胶回收、纯化后用于下一代测序（NGS）。该图展示了靶向可能介导急性髓系白血病（AML）中阿糖胞苷耐药性的表观遗传因子的富集或耗竭的 shRNA 的分布情况。结论：本实验方案强调了靶向敲低筛选在系统性研究必需和非必需基因中的重要性，并展示了该方法作为功能性筛选平台的应用，可用于鉴定与药物耐药性相关的靶点。

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