利用shRNA文库筛选鉴定调控药物耐受表型的因素

本视频的总体目标是演示如何利用汇集的shRNA表观遗传文库进行负向筛选。该筛选可通过测序鉴定特定的表观遗传靶点。此方法有助于鉴定介导急性髓系白血病（AML）中获得性阿糖胞苷耐药性的表观遗传因子。具体步骤如下。

选择最有效的启动子以实现shRNA的持久和长期表达。本实验方案的重点是利用表观遗传因子shRNA文库，在阿糖胞苷耐药的MV4-11细胞系中进行RNA干扰筛选。所使用的启动子包括人EF-1α、人CMV和SFFV启动子，这些启动子可表达绿色荧光蛋白。

使用台盼蓝染色排除法进行细胞计数。将细胞悬浮于含有8 µg/mL 多聚素（polybrene）的10% RPMI 培养基中。每孔加入1.5 mL 培养基，按每孔100万个细胞接种于6孔板中，每组设三个重复孔。

加入不同体积的浓缩慢病毒。例如，根据慢病毒的滴度，向每孔加入10、20和40 µL的慢病毒。轻轻摇动培养板以混匀内容物。

在37摄氏度下以920 ×g离心90分钟进行旋转感染。随后立即将培养板放入二氧化碳培养箱中孵育。在转染后48小时观察绿色荧光蛋白（GFP）表达，并在72小时时进行定量分析。

接下来，按照流程图所示步骤，选择在整个培养过程中表现出稳定GFP表达的启动子。制备汇集的慢病毒人类表观遗传因子shRNA文库。将293T细胞以较低传代次数、良好增殖状态，在三个10厘米细胞培养皿中培养，每个培养皿中加入8 ml 10% DMEM培养基。

当细胞达到60%融合度时，完全更换为新鲜培养基。按照如下步骤制备转染混合物：将无血清培养基、慢病毒包装质粒PAX2、包膜质粒pMD2.G、文库质粒混合物以及转染试剂依次加入并混匀。

轻敲混合物使其充分混匀，在室温下孵育15分钟。将转染混合物加入293T细胞中，通过轻轻晃动培养板混匀。将培养板置于二氧化碳培养箱中孵育。

24 小时后更换培养基。48 小时后，在荧光显微镜下观察 GFP 表达，以确认转染 293T 细胞的效率是否较高。分别在 48、60 和 72 小时收集病毒上清液，置于 4 °C 保存，并在每次收集病毒后加入 8 mL 新鲜培养基。

用0.4微米滤器过滤混合的病毒。为了获得高滴度的病毒，可通过超速离心浓缩混合的病毒。将过滤后的病毒上清液转移至70 Ti离心管中，在18,000 g下离心2小时。

使用预冷的转子，在 4 度条件下离心。小心从离心机中取出离心管，彻底去除上清液。用移液器将沉淀物轻轻重悬于 400 µL 不含 FBS 和抗生素的 DMEM 中，冰上孵育 1 小时。

将病毒分装后于-80摄氏度冷冻保存。按所示方法计算病毒浓度。慢病毒转导效率的估算。

使用不同体积（2、4 和 8）的浓缩病毒转导 293T 细胞，以确认慢病毒的成功制备。将浓缩病毒稀释至 100 倍，用于在靶细胞系中进行滴定实验。在六孔板的一个孔中，加入含有 8 微克/毫升聚凝胺的 1.5 毫升 10% RPMI 培养基，接种 100 万靶细胞。

加入四种不同体积的100倍浓缩病毒，分别为1、1.5、2、2.5 µL。将培养板在37°C条件下，以920 ×g离心90分钟，进行离心感染（spinfection）。72小时后，通过流式细胞术检测GFP阳性细胞的百分比。

确定病毒的体积，以获得30%的转导效率。这种低转导效率可确保每个细胞中单个shRNA的整合。在耐药细胞系中进行表观遗传shRNA文库的转导。

根据病毒整合数计算实验所需细胞数量，方法如下。将1100万个细胞重悬于16 mL含10%胎牛血清的RPMI培养基中。加入终浓度为8 µg/mL的聚凝胺，充分混匀，然后加入预先计算好的病毒体积，以达到30%的转导效率。

将所有细胞以每孔150万细胞、1.5 ml的密度接种于六孔板中。在37摄氏度下，以920 ×g离心90分钟。将六孔板置于二氧化碳培养箱中过夜培养。

24 小时后，更换培养基并将转导的细胞转移至 T-75 培养瓶。48 小时后，在荧光显微镜下观察 GFP，以确认转导成功。72 小时后，通过流式细胞术定量检测 GFP。

富集GFP阳性细胞。将转导后的细胞以每毫升50万个的密度培养5至7天以扩增细胞，然后使用流式分选仪进行分选，分选条件设置为高纯度、低得率。将分选后的细胞在10% RPMI培养基中培养。

72 小时后，进行分选后 GFP 阳性细胞百分比的估算，以确保分选效率超过 95%。通过剔除筛选鉴定介导药物耐药性的表观遗传因子。将转导 shRNA 文库的细胞在 10% RPMI 培养基中培养最多 5 天。

将一千万个细胞分两份进行离心。弃去上清液，并将沉淀物保存在负80度。这些样品将作为表观遗传shRNA文库的基线对照。

将剩余的转导细胞以500倍文库覆盖率的细胞数量，分别以重复组R1和R2进行培养。对其中一个重复组施加药物处理（10 µM 阿糖胞苷），另一个重复组则不加药物。每72小时更换含药和不含药培养瓶中的培养基。

重复换液三次，累计药物处理时间为9天。药物处理第9天时，采用台盼蓝排斥法检测细胞活力。将剩余的活细胞离心沉淀，用无菌PBS洗涤，并在室温下以280 g离心5分钟。

弃去上清液，将沉淀物于-80℃保存，用于DNA提取。通过PCR扩增整合的shRNA。从转导的基线细胞、经处理和未处理的细胞中提取DNA，随后使用荧光计检测浓度，按所示计算所需DNA量，并将样品进行第一轮PCR反应。

PCR反应体系如表2所示，并附有热循环仪的反应条件。设置多组反应，每管含有850纳克DNA，共计43个反应。将PCR产物混合后进行纯化。

用50 µL缓冲液洗脱产物并进行定量，最后于-20 °C保存。进行第二轮PCR时，使用反向index引物，试剂见表4。每个样本取500 ng的首轮PCR产物，总体积为50 µL，设置四个反应，并设置阴性对照。

将全部产物上样进行电泳，使用2% TBE琼脂糖凝胶，并用1 kb DNA分子量标准确认条带大小。在凝胶成像系统中观察PCR产物。切下特异性条带，并使用凝胶回收试剂盒进行纯化。

使用试剂盒进行纯化的计算结果见表3。用30微升洗脱缓冲液洗脱，最终体积约为30微升，各洗脱液的浓度大约为每微升80至90纳克。下一代测序及数据分析。

将凝胶纯化后的产物进行高通量测序，以获得耗竭型shRNA的读段数。剪切接头序列，将过滤后的读段比对至参考序列，使用SAMtools加载文件以获取比对结果摘要。在CRISPRCloud2中载入剪切后的fastQ文件，并按照说明进行分析。

点击提供的链接进入 CRISPRCloud2，选择筛选类型为生存筛选和基因敲除筛选。设置组数，并为每组输入名称。

以 FASTA 文件格式上传参考文库。上传的数据将被处理，结果可在指定的 URL 中查看。代表性数据。

该图显示了MV4-11亲本细胞和耐药细胞在浓度递增的阿糖胞苷（0.1 微摩尔至1,000 微摩尔）处理下的存活率，通过MTT法进行评估。该图展示了在72小时结束时，通过流式细胞术检测GFP表达水平的代表性流式图，所用启动子包括人EF-1α、人CMV和SFFV启动子。其中人CMV呈现异质性峰，而人EF-1α和SFFV则显示单一均质峰。

该图显示了 MV4-11 细胞中三种不同启动子效率的柱状图。由 SFFV 驱动的 GFP 在长期培养中出现 GFP 沉默现象。而由 hEF-1 alpha 驱动的 GFP 细胞在分选后表现出持续的表达。

左图显示了在转染48小时后，通过荧光显微镜观察到的shRNA文库在293T细胞中的转染效率。右图显示了不同病毒体积（2、4和8微升）下，病毒文库在293T细胞中的转导效率。该图展示了在MV4-11耐药细胞系中，使用不同体积的病毒（如1、1.5、2、2.5微升）进行转导，以达到30%转导效率的结果。

该图显示了转导效率为30%的GFP阳性细胞，采用高纯度、低产量分选模式进行分选。图中示意性地展示了对分选出的GFP阳性细胞进行药物处理的实验流程，包括长达9天的阿糖胞苷暴露处理，随后检测细胞活力并收集细胞用于DNA提取。该图还显示了在第一轮和第二轮PCR中所用引物的结合区域。

该图展示了第一轮 PCR 结束时 PCR 产物的条带大小为 397 个碱基对，第二轮 PCR 产物为 399 个碱基对，后者经凝胶回收、纯化后用于下一代测序（NGS）。该图展示了靶向可能介导急性髓系白血病（AML）中阿糖胞苷耐药性的表观遗传因子的富集或耗竭的 shRNA 的分布情况。结论：本实验方案强调了靶向敲低筛选在系统性研究必需和非必需基因中的重要性，并展示了该方法作为功能性筛选平台的应用，可用于鉴定与药物耐药性相关的靶点。