局部应用生物测定以量化蚊子和果蝇的杀虫剂毒性
January 19th, 2022
我们描述了局部应用生物测定法在蚊子和果蝇中测量杀虫剂易感性的方法和重要性。所提出的测定是高通量的，利用昆虫质量 - 从而允许计算质量相对化致死剂量而不是浓度 - 并且可能具有比其他类似方法更低的变异性。
通过直接在昆虫上施用杀虫剂而不是通过表面接触，杀虫剂暴露的变化很小，这使我们能够更准确地测量蚊子种群的易感性分布。这种技术的主要优点是它允许我们计算杀虫剂的质量相对化致死剂量而不是致死浓度，这大大提高了抗药率比较。小心正确存放杀虫剂，避免污染工具，并确保注射器部件处于良好状态。
这将帮助您获得一致的结果。首先，从冰箱中取出所需的杀虫剂溶液。立即涡旋溶液或倒置五次，并将其置于室温下耐光容器中，让杀虫剂在使用前升温至室温。
设置五个微量离心管，每个管含有0.5毫升丙酮。用第一管中的丙酮完全填充注射器桶。然后通过迅速向下推柱塞将丙酮排出到废容器中，并重复四次，以完成从同一丙酮等分试样中总共五次丙酮洗涤。
然后，用空气完全填充注射器桶，并将空气和潜在的丙酮残留物排出到废物容器中。再重复两次，用空气完成三次洗涤。在注射器柱塞和针头顶部之间的枪管内创建一个气穴，方法是将柱塞向上拉约五毫米到枪管中。
用随机ID标记塑料保温杯，以进行盲人死亡率评估。使用由吸入吸入驱动的吸气器，吸出所需数量的三到五天大的成年蚊子。将吸气器的尖端放入管中，尖端缠绕有棉花。
轻轻呼气，然后点击吸气器将蚊子转移到锥形管中。当吸气器尖端被移除时，使用棉花堵塞管子，然后用盖子盖住。将蚊子在4摄氏度下放置至少10分钟或将它们埋在冰盘中的冰下，将其短暂地击倒管中。
将被击倒的蚊子转移到昆虫处理帐篷。小心地将蚊子倒在放在冰上的塑料托盘上，一次倒入大约50只蚊子，以确保每只蚊子都接触到它下面的凉爽托盘并保持被击倒。按性别对蚊子进行分类，用镊子轻轻地用腿或翅膀捡起它们，然后将每个性别放入单独的抱杯中，并在达到所需数量时停止。
分类时，清除任何受伤或超大或超小的蚊子。要记录蚊子杯的重量，请将一个带有培养皿的空杯子作为秤上的盖子，然后将秤去皮。将蚊子倒入容器中，并将盖子放在顶部。
将容器放在秤上，记录最终重量以及蚊子的数量。立即将标本杯放回冰上，使其保持固定，直到称量标本的所有杯子。将准备好的蚊子分成5到10个单独的杯子，放在冰上，用随机ID标记。
使用镊子和手持式计数器，每杯可灭蚊20至25只。要对果蝇进行分类，请使用二氧化碳麻醉果蝇七秒钟。将苍蝇倒在用长凳纸包裹的冰袋上。
使用细尖的画笔，分离并计算男性和女性。使用画笔轻轻地捡起选择的苍蝇，并将它们放入干净的空汤瓶中。选择相同数量的雄性和雌性果蝇后，用菌株名称和果蝇总数标记库存瓶。
用二氧化碳麻醉果蝇瓶七秒钟。将果蝇倒在称量纸上，并将纸用作漏斗，将果蝇引入标有随机ID的去皮小瓶中。将培养皿盖放在果蝇小瓶的顶部后，将其放在秤上。在评分表上记录标本的总重量和数量。
立即将果蝇小瓶放入冰盘中，盖子仍然在上面，以防止果蝇逃跑。在注射器中装载适当的杀虫剂浓度，从浓度最小的剂量开始，然后与每组生物体一起朝着最集中的剂量努力。将标本倒在放在冰上托盘上的称量纸上。
使用干净的无杀虫剂画笔或棉签分离靠近在一起的标本，以便于访问每个标本进行给药。使用注射器，将一滴杀虫剂溶液涂抹在蚊子的腹侧胸部和腹部区域以及果蝇的背部。立即将试样倒回贴有标签的塑料杯中。
用网和橡皮筋盖住杯子。请注意，如果在此过程中有任何标本被杀死、损坏或逸出，则杯子上会记录更新的标本计数。将完成的杯子放入保温盘中。
对于第一个杯子，记录配料完成的时间。对每个杯子重复加药，直到所有试样都用适当的杀虫剂浓度加药，并记录所有试样的给药结束时间。通过湿棉球为每杯提供10%蔗糖溶液，并将蚊子和果蝇储存在所需的温度和湿度下。
记录杀虫剂暴露后 24 小时内的标本死亡率。如世界卫生组织所述，如果蚊子可以飞行并保持直立，如果它们不动或共济失调，则将其归类为活体。对果蝇进行相同的死亡率评估。
进行生物测定后，获得剂量反应数据，其中两种菌株是洛克菲勒和IICC基因型的雄性和雌性埃及伊蚊。洛克菲勒和IICC的质量相对化中位致死剂量分别为每毫克0.008和0.336纳克。结果显示，每个品系中雌性和雄性蚊子的剂量反应曲线之间没有差异。
因此，将来自两性的数据结合起来计算中位致死剂量值。由于这两种菌株的中位致死剂量的95%置信区间不重叠，因此这些值被认为显着不同。此外，在计算抗性比时，IICC菌株的耐药性是易感洛克菲勒菌株的40倍以上。
还获得了果蝇，黑腹果蝇，Canton-S菌株的剂量反应数据，发现质量相对化的中位致死剂量为每毫克0.213纳克。一致性至关重要，特别是在储存和施用杀虫剂以及评估死亡率时。此外，在处理标本时要小心，以避免非杀虫剂引起的伤害或死亡。
通过这种方法，我们现在可以准确地确定蚊子种群的技术抗性，以及环境条件如何影响抗性或技术耐药性如何预测实际耐药性。
概述
本研究调查了一种用于测量蚊虫和果蝇对杀虫剂敏感性的局部应用生物测定法。它突出了该方法的优点，包括更低的变异性和能够计算质量相关的致死剂量。
关键研究组成部分
研究领域
- 杀虫剂敏感性测试
- 媒介控制策略
- 抗性研究
背景
- 提高测量昆虫敏感性的准确性
- 传统给药方法的挑战
- 质量相关的致死剂量对抗性比较的重要性
使用的方法
- 局部应用生物测定法
- 蚊虫和果蝇
- 高通量剂量评估技术
主要结果
- 鉴定了埃及按蚊菌株的质量相关的中间致死剂量
- 结果的一致性得到改善
- 直接应用提高了测量精度
结论
- 该研究成功展示了一种评估杀虫剂效力的可靠方法。
- 研究结果支持更好的媒介管理和抗性监测实践。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accurate phenotyping of insecticide susceptibility is critical for resistance surveillance and vector control strategy optimization. The topical application bioassay provides a high-throughput, mass-normalized approach that reduces variability in exposure and enables statistically rigorous LD50 determination. This supports predictive confidence in resistance monitoring and informs go/no-go decisions in insecticide development and deployment pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables mechanistic de-risking by quantifying insecticide susceptibility profiles across strains and sexes.
- Operational Value: Standardizes exposure through direct topical application, minimizing contact variability.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates dose-response curves that account for mass differences between populations, improving cross-strain comparability.
- Operational Value: Facilitates high-throughput testing of large insect cohorts across multiple concentrations.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges genotypic and phenotypic resistance by providing phenotypic readouts aligned with genotypic surveillance.
- Operational Value: Produces LD50 values with confidence intervals for resistance ratio calculations, supporting translational continuity.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within discovery biology to lead identification workflows by providing quantitative susceptibility data that informs target validation and compound prioritization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of resistance mechanisms through precise LD50 measurements.
- Screening: Enables reproducible, quantitative assessment of compound efficacy across insect populations.
- Analytics: Delivers mass-relativized lethal dose outputs that allow statistical comparison of susceptibility profiles.
- Translational Research: Connects phenotypic resistance data to genotypic markers for holistic resistance profiling.
- Enterprise Reuse: Adaptable across insect species (e.g., mosquitoes, fruit flies) for platform-wide resistance screening.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in resistance phenotypes through precise, mass-normalized dosing.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized insecticide application and environmental controls.
- Strategic Value: Improves risk-adjusted prioritization of vector control strategies by enabling accurate resistance ratio calculations.
- Portfolio Impact: Supports data-driven advancement decisions in insecticide development by clarifying susceptibility thresholds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in insect handling, sex sorting, and cold immobilization techniques.
- Dependent on precise syringe calibration and insecticide solution preparation to avoid dosing variability.
- Necessitates standardized mortality assessment criteria (e.g., WHO guidelines) for blind evaluation.
- Requires environmental control (temperature, humidity) during post-exposure incubation to ensure consistent mortality readouts.
- Limited by the need for technical skill in microdosing and specimen handling to prevent non-insecticide-related mortality.
