用于量化蚊虫和果蝇杀虫剂毒性的局部施用生物测定法

通过直接将杀虫剂施用于昆虫体内，而非通过表面接触，可最大限度减少杀虫剂暴露的变异，从而更准确地测定蚊虫种群的敏感性特征。该技术的主要优势在于，能够计算基于质量标准化的杀虫剂致死剂量，而非致死浓度，从而显著提高抗性比值的可比性。务必注意妥善保存杀虫剂，避免工具污染，并确保注射器各部件处于良好状态。

这将有助于获得一致的实验结果。首先，从冷冻箱中取出所需的杀虫剂溶液。立即涡旋振荡溶液或倒置混匀五次，并将其置于避光容器中，在室温下放置，使杀虫剂升温至室温后再使用。

准备五个微型离心管，每管中加入0.5毫升丙酮。用第一个管中的丙酮将注射器筒完全充满，然后迅速推动活塞，将丙酮排入废液容器中。重复此操作四次，共使用同一份丙酮完成五次洗涤。

然后，将注射器筒完全充满空气，并将空气及可能残留的丙酮排入废液容器中。重复此操作两次，共完成三次空气清洗。通过将活塞向筒内拉动约五毫米，在注射器筒内、活塞与针头顶部之间形成一个空气腔。

使用随机编号标记塑料盛放杯，用于盲法死亡率评估。使用由吸气驱动的吸虫器，吸取所需数量的三至五日龄成蚊。将吸虫器的尖端插入装有棉塞的试管中，棉塞应包裹在吸虫器尖端周围。

轻轻呼气，轻敲吸蚊器，将蚊虫转移至锥形管中。移除吸蚊器吸头后，立即用棉塞堵住管口，然后盖上管盖。将装有蚊虫的锥形管置于4摄氏度环境中至少10分钟，或将其埋入冰盒的冰中，以短暂击倒蚊虫。

将击倒的蚊子转移至昆虫操作帐篷中。将蚊子小心倾倒至置于冰上的塑料托盘中，每次倾倒约50只，确保每只蚊子均接触下方低温托盘，以维持其击倒状态。使用镊子轻轻夹住蚊子的足或翅，按性别进行分选，将不同性别的蚊子分别放入各自的暂存杯中，达到所需数量后停止操作。

分选时，剔除受伤或体型过大或过小的蚊子。为记录蚊子容器的重量，将一个空容器加上培养皿作为盖子放在天平上，将天平归零。将蚊子倒入容器中，并盖上盖子。

将容器置于天平上，记录最终重量及蚊虫数量。立即将装有样本的杯子放回冰上，以保持其处于麻痹状态，直至所有样本杯均完成称重。将准备好的蚊虫分成5至10份，分别置于冰上的杯子中，并用随机编号标记。

使用镊子和手持计数器，每杯放入20至25只蚊子。分选果蝇时，用二氧化碳麻醉果蝇7秒，然后将果蝇倒入包裹在实验台纸中的冰袋上。

使用尖头画笔将雄性和雌性分开并计数。用画笔轻轻挑起选定的果蝇，放入干净的空培养瓶中。在挑选出数量相等的雄性和雌性果蝇后，用菌株名称和果蝇总数标记培养瓶。

用二氧化碳麻醉果蝇瓶7秒钟。将果蝇倒在称量纸上，利用称量纸作为漏斗，将果蝇转移至已去皮并标记有随机编号的样品瓶中。将培养皿盖盖在装有果蝇的样品瓶上后，置于天平上。在记录表上记下总重量及标本数量。

立即将装有果蝇的试剂瓶放入冰盘中，瓶盖保持盖紧，以防止果蝇逃逸。使用适当浓度的杀虫剂填充注射器，从最低浓度剂量开始，对每组生物依次逐步增加至最高浓度剂量。将样本倾倒至铺在冰盘上的称量纸上。

使用干净且无杀虫剂的画笔或棉签将靠在一起的标本分开，以便于对每个标本进行给药操作。使用注射器将一滴杀虫剂溶液施加到蚊子的腹胸部及腹部区域，或施加到果蝇的背部。随后立即将标本倒回已标记的塑料杯中。

用网罩和橡皮筋盖住杯子。若在此过程中有标本死亡、受损或逃逸，需在杯子上注明更新后的标本数量。将处理完毕的杯子放入盛放托盘中。

对于第一个杯子，记录给药完成的时间。对每个杯子重复给药操作，直至所有样本均已被施加适当的杀虫剂浓度，并记录所有样本完成给药的结束时间。通过湿润的棉球向每个杯子提供10%蔗糖溶液，并将蚊子和果蝇置于所需的温度和湿度条件下饲养。

在开始杀虫剂暴露后24小时记录样本死亡率。根据世界卫生组织（WHO）的描述，若蚊虫能够飞行并保持直立，则归为存活；若无法移动或出现共济失调，则归为死亡。对果蝇采用相同的死亡率评估标准。

完成生物测定后，获得了针对埃及伊蚊的Rockefeller和IICC基因型雌雄个体的剂量反应数据。Rockefeller和IICC基因型的相对质量中位致死剂量分别为0.008和0.336纳克每毫克。结果表明，在每种基因型内，雌蚊与雄蚊的剂量反应曲线之间无显著差异。

因此，合并两性别的数据以计算半数致死剂量值。由于这两种品系半数致死剂量的95%置信区间无重叠，认为这些值具有显著差异。此外，在计算抗性倍数时，IICC品系的抗性超过敏感型Rockefeller品系40倍以上。

还获得了果蝇（Drosophila melanogaster）Canton-S品系的剂量反应数据，其质量归一化的半数致死剂量为0.213纳克每毫克。实验过程中保持一致性至关重要，尤其是在储存和施用杀虫剂以及评估死亡率时。此外，在处理样本时需格外小心，以避免造成非杀虫剂引起的伤害或死亡。

通过该方法，我们现在能够准确测定蚊虫种群的技术抗性，以及环境条件对技术抗性的影响，或技术抗性如何预测实际抗性。