Name: 局部应用生物测定以量化蚊子和果蝇的杀虫剂毒性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: 学习局部应用生物测定法以量化埃及伊蚊和果蝇的杀虫剂毒性。该方法通过直接施药减少暴露变异，实现质量相对化致死剂量计算，提高抗性比率比较的准确性，为病媒管理和抗性监测提供更可靠的技术支持。

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本研究由美国国家科学基金会向SH提供的职业奖资助，项目编号为2047572。我们感谢Damien Rivera在果蝇饲养及局部施用试验样品制备方面的协助，感谢威斯康星大学麦迪逊分校的Ganetzky博士提供Canton-S果蝇品系，感谢美国疾病控制与预防中心提供Rockefeller品系，以及感谢美国农业部医学、农业与兽用昆虫学中心提供IICC近交系品系。图1使用BioRender.com制作。

作者声明无利益冲突。

本文介绍了一种适用于蚊子和果蝇的局部施用检测的改进方案。该方法所需专用设备极少，因此可轻松修改后用于野外工作及其他生物的研究。下文将详细说明本方案的关键步骤、可能的修改方法、故障排除建议、方法的局限性及其重要意义。
实验方案中的关键步骤： 本方案中有三个关键步骤，若操作不当，将极大影响生物测定的结果：杀虫剂浓度的准确性、试虫击倒情况以及死亡率评估。
杀虫剂浓度准确性： 
准确配制杀虫剂溶液对于获得可重复的剂量-反应曲线和有意义的结果至关重要。在文献中，无论是CDC瓶法生物测定7还是点滴法应用13,14,43，通常采用体积法配制杀虫剂溶液。然而，本文所述的重量法由于引入了（与温度相关的）密度参数，考虑了温度的影响，因而具有更高的内在准确性，可实现更精确的溶液配制。
标本击倒： 
击倒标本是本方法的关键步骤之一，有助于准确施用杀虫剂并进行称重测量。然而，击倒生物体不可避免地存在造成物理应激和损伤的风险，此前已有研究证实30。因此，在击倒标本时应谨慎操作，注意确保：i）每个标本的击倒时间相近，ii）击倒持续时间尽可能短，iii）所有标本采用一致的击倒方法。此外，建议在施用杀虫剂前单独测试击倒方法，以确认该方法有效，且不会导致对照组死亡率超过10%。初学者在初次测试时可能耗时较长，从而延长击倒时间。因此，在解读首次实验结果时应格外谨慎。
死亡率评估： 
评估死亡率可能具有挑战性，尤其是当杀虫剂并未完全杀死蚊子或苍蝇，而仅仅是将其击倒或致残时。因此，了解杀虫剂对靶标生物的影响，并对死亡标准有明确定义至关重要。 &#34;死亡的&#34; （或基因敲低）的生物体。此外，建议由同一人评估不同剂量组和重复组之间的死亡率，以减少变异。
方案修改：以下描述的多种修改可用于改进本方案的通用性和可操作性。
将检测方法适用于体型更小或更大的昆虫： 
使用体型更小或更大的样本时，建议相应地减少或增加杀虫剂的施用体积。例如，我们将蚊子实验方案调整用于果蝇时，将0.5 µL的剂量减少至0.2 µL。请确保根据所选的剂量体积选用合适规格的注射器。
将检测方法应用于野外昆虫： 
使用野外昆虫时，昆虫个体大小可能存在更大差异。因此，建议将昆虫按较小群体（例如，每杯）分别称重，而不是以大群体（例如，一次实验所用的全部昆虫）整体称重。这有助于反映因野外昆虫质量差异而导致的杀虫剂敏感性潜在变化。
设备改装： 
昆虫操作帐篷：可在由PVC管和蚊帐网简单搭建的昆虫操作帐篷内完成样本给药。该帐篷可作为封闭房间（例如昆虫饲养室）的替代方案，有助于避免在可能进行昆虫饲养的区域产生杀虫剂污染。这种昆虫操作帐篷易于搭建且成本低廉（约70美元）。此外，也可购买专用的昆虫操作笼（约425美元）。
冷藏台：可使用冰袋或冰盘来麻醉标本和/或保持标本处于麻醉状态。
培养箱：建议使用培养箱来饲养标本，并在杀虫剂处理后将标本保持24小时。如果无法获得培养箱，也可自行构建。构建培养箱所需的设备包括保温容器、加湿器、加热电缆、温湿度控制器以及光源，总成本约为170美元，该方案基于并扩展了先前的方法44。
持杯：尽管使用塑料杯来分类和盛放处理后的样本，但涂蜡的纸杯或玻璃容器也可作为合适的替代品。
生物体及生活史阶段的修饰： 
该方法具有高度适应性，可用于其他载体、昆虫和/或节肢动物，例如Culex quinquefasciatus蚊子32、家蝇32和蟑螂45，也可用于非成虫生活史阶段，例如蚊子幼虫46。
局部施用位置的调整： 
本方法描述了将杀虫剂施用于蚊虫的腹胸部及腹部区域（果蝇则施用于背部）。然而，只要暴露部位保持一致，也可采用其他施用位置。保持一致性非常重要，因为杀虫剂的敏感性可能因施用位置不同而有所差异32。
故障排除建议：该方法包含若干在初始阶段具有挑战性的步骤。以下列出了一些可能遇到的最常见问题。
杀虫剂溶液泄漏/挥发： 
杀虫剂通常溶解于丙酮中，丙酮是一种高度挥发性的化合物。这意味着丙酮在室温下会迅速蒸发，导致杀虫剂浓度随时间升高。如果发现杀虫剂溶液出现泄漏或蒸发现象，应重新配制溶液，确保管盖拧紧，并再次确认是否严格遵循储存规程（例如是否使用了封口膜，以及试管是否直立存放）。若泄漏问题持续存在，可尝试减少试管中的液体体积，以预留更多空间，适应丙酮在不同温度下体积的变化。此外，若使用丙酮作为溶剂，应确保试管材质适用于丙酮储存（例如FEP、TFE和PFA塑料）。若使用疏水性杀虫剂，应将溶液储存于玻璃小瓶中（因为疏水性杀虫剂易吸附于塑料表面）&#160;玻璃比塑料更不易渗透）。储存前标记溶液的弯月面位置以监测蒸发情况也是一种良好做法。
称量生物体时微量天平出现重量漂移： 
如果天平读数发生漂移（缓慢上升或下降），可能是由于静电所致。在塑料器皿中称量生物体时最常出现此类漂移，因为塑料容易携带静电荷。为避免此问题，可在被称量的塑料容器下方放置称量纸，或使用玻璃等非塑料材质的容器进行称量。
异常死亡率结果： 
死亡率结果可能出现异常的情况有多种，例如在对照组中观察到较高的死亡率，或在所有杀虫剂剂量下均出现较高或较低的死亡率。请查看以下各种情况，以针对每种情形进行故障排查。
对照组死亡率过高 
如果对照组出现较高的死亡率（10%或以上），应评估击倒方法以及标本暴露于击倒条件的时间长度。如有可能，应缩短标本的击倒时间。导致对照组死亡率升高的其他潜在因素包括：i）检查培养箱设置是否正确——异常的温度和/或湿度可能导致死亡率升高，应使用独立的数据记录仪检测温度和湿度；ii）评估昆虫操作过程，过度或粗暴地处理昆虫可能导致较高的死亡率；iii）检查用于处理对照组的100%丙酮或实验仪器上是否存在杀虫剂污染。应更换丙酮，并用丙酮或乙醇彻底清洁所有仪器。为避免污染，应频繁更换手套，防止液体溢出，并定期清洁仪器。请注意，在补充文件3中，对照组（仅使用丙酮）的容器内最多仅有两只蚊子死亡。该水平的死亡率不被视为过高（低于10%），因此无需担忧。
所有暴露组均出现高死亡率（但对照组未出现） 
使用较低浓度的杀虫剂或较小的剂量体积进行测试。所使用的剂量可能超过了不会引起死亡的最低剂量。可通过设置多个10倍梯度稀释浓度来确定合适的剂量范围，并排除污染的可能性。为避免污染，应从最低浓度开始施加剂量，并逐步向最高浓度进行。此外，务必定期使用丙酮和/或乙醇清洁所有使用过的设备，施加到样本上的剂量应非常微小，即使极轻微的交叉污染也可能影响实验结果。
所有暴露组的死亡率均较低 
使用更高浓度的杀虫剂。所使用的剂量可能均过低，不足以在种群中引起死亡。为确定正确的剂量范围，应将样本暴露于若干个更高10倍浓度梯度的剂量中。确保杀虫剂溶液未过期或降解（可能由于高温或光照暴露所致）。如果溶液已过期或怀疑已降解，请重新配制溶液，并确保遵循正确的储存条件。
不同重复组/天之间的死亡率不一致 
昆虫暴露于杀虫剂的时间点可能影响其表现出的抗性水平，尤其是代谢抗性34。每天在相同的时间窗口内重复本实验方案，以避免因时间差异成为导致死亡率变化的潜在变量。其他可能导致重复组间死亡率不一致的因素包括：i) 不同实验间昆虫的饲养条件存在差异。确保所有个体处于相同的年龄范围，并在相同的温度、相似的饲养密度和食物供应条件下培育。ii) 杀虫剂浓度随时间降解&#160;或因丙酮挥发而&#160;导致浓度升高。应重新配制溶液，并确保适当的储存条件。iii) 死亡率评分不一致。应由同一人进行死亡率评分，或制定明确的评分流程供团队成员统一使用。采用盲法评分以减少死亡率判定中的偏倚。
昆虫粘附在分拣托盘表面的问题： 
丙酮会与本实验方案中使用的塑料材料（如培养皿）发生反应。若在培养皿或类似的塑料表面使用丙酮，标本很可能粘附于表面。可通过在分拣托盘内铺垫称量纸或使用非塑料材质的分拣托盘来避免此类粘附现象。此外，分拣托盘或盛放杯的塑料表面产生冷凝水，也可能导致昆虫粘附在水珠上；或者标本温度过低，可能冻结在表面。应调整击晕方法，以减少冷凝水的形成，同时防止&#160;标本温度过低或冻结（例如，在标本与塑料分拣托盘之间放置称量纸）。
R 分析错误： 
收集死亡率数据后，在分析过程中可能会出现多种问题。导致 R 代码无法对数据文件执行操作的最常见原因是数据格式与代码不匹配（例如，列标题和/或空单元格）。如果出现更严重的问题，请参考 Rstudio 内置的 R 帮助页面35。
上述局部施药方法的局限性： 
通过局部施药方式吸收杀虫剂无法模拟自然暴露情况： 
在昆虫主要体表进行局部施药并非杀虫剂吸收的自然途径。在实际环境中，昆虫主要通过足部在接触杀虫剂处理表面的整个过程中吸收药剂，或通过翅膀接触微小的气溶胶颗粒47,48，而非通过腹面快速暴露。然而，直接施加已知剂量的杀虫剂能够准确建立昆虫对杀虫剂的表型反应，这对于遗传学和进化研究，或在不同空间和时间尺度上比较昆虫对杀虫剂的敏感性至关重要。因此，该方法适用于检测技术性抗性，但无法直接衡量实际抗性（即在田间条件下实际干预工具的有效性15）。但需要注意的是，目前的标准方法（例如 WHO 试管试验和 CDC 瓶式生物测定）同样无法捕捉或模拟田间气溶胶（如喷雾）杀虫剂暴露的情况。
局部施用试验仅可用于评估具有接触吸收作用的杀虫剂： 
该方法适用于通过接触和吸收起效的杀虫剂，不适用于胃毒型杀虫剂，例如常用于诱杀性毒糖饵中的硼酸49。
该方法的意义： 
局部施用法通过计算致死剂量（而非浓度）并测量技术性（而非实用性）抗性，进一步拓展了杀虫剂生物测定中已确立的标准15。以下是该方法相较于现有杀虫剂敏感性测定方法的优势与局限性。
致死剂量计算： 
该方法用于确定杀虫剂的致死剂量，而非美国疾病控制与预防中心（CDC）和世界卫生组织（WHO）生物测定中用于确定区分剂量的致死浓度11。致死剂量更具意义，因为它是已知可引发死亡反应的杀虫剂量化剂量。相比之下，致死浓度并未考虑生物体实际摄入的杀虫剂量。在使用致死剂量计算时，可更准确地观察和量化不同性别或体型依赖的敏感性差异，使该测量方法具有更高的适用性。
技术抗性： 
该方法用于评估技术抗性，即在标准化、受控环境中测得的抗性。此类测量适用于监测杀虫剂抗性的传播情况，并将表型抗性与潜在的抗性标志物相关联15。由于采用点滴法生物测定所导致的死亡率变异较小，因此更有利于识别新的抗性标志物。然而，由于该方法使蚊虫接触杀虫剂的方式不符合自然暴露条件，因此不适用于评估特定干预措施在特定人群中的实际效果。对于此类实际抗性的测定，需要采用其他生物测定方法15。
样本适用性： 
该方法可通过简单调整击倒方式和/或杀虫剂剂量、体积和/或浓度（如上所述），应用于其他重要的节肢动物，例如农业害虫（如科罗拉多马铃薯甲虫）、家居害虫（如蟑螂和床虱）或传粉昆虫（如蜜蜂）。其易于调整的特性有助于在不同研究领域之间类比杀虫剂抗性研究。采用半数致死剂量（LD50）而非半数致死浓度（LC50）进行评估，可实现不同物种间的准确比较。
成本： 
与美国疾病控制与预防中心（CDC）瓶饲生物测定法和世界卫生组织（WHO）管测试类似，表面施用测定法的运行成本极低（参见材料表）。所需关键设备为注射器（约70美元）和分配器（约100美元），这些设备可在多次测定中重复使用。
所需样本数量： 
每次进行点滴法测定实验时，每个处理杯中至少应使用 20–25 个样本。建议每项实验至少测试五种杀虫剂浓度，每种浓度至少设置三个重复。总体而言，完成一次完整的测试至少需要 300–375 个样本，这一数量与使用 WHO 筒法或 CDC 瓶法进行抗药性强度测试所需的样本量相当。然而，若点滴法生物测定能够实现更小的变异度，则相同数量的样本可能提供更强的统计效能，用于比较不同空间或时间下的敏感性数据。

蚊子因传播疾病每年导致超过70万人死亡，其中仅疟疾所致死亡就占一半以上1。目前预防疟疾及其他虫媒传播疾病的主要方法是使用杀虫剂，通常以长效杀虫蚊帐或室内滞留喷洒的形式应用2。然而，杀虫剂抗性在蚊子及其他媒介昆虫中普遍存在，农业害虫中也广泛存在此类抗性3,4。为了有效管理抗性问题，监测工作至关重要5。为此，亟需高准确性和高通量的抗性检测方法。目前，用于蚊子杀虫剂抗性监测最广泛使用的方法是WHO管试验6和CDC瓶式生物测定法7。对于果蝇，残留接触施药法（类似于CDC瓶式生物测定法）&#160;是一种常用的杀虫剂生物测定方法8,9,10。然而，这些方法的数据变异性通常较高，当暴露于亚致死剂量时，同一实验室蚊子品系在CDC瓶式测定中的死亡率范围约为20–70%，在WHO管试验中为0–50%11。这种变异令人意外，因为大多数实验室品系的遗传变异有限，理论上应导致种群中杀虫剂敏感性的变异较小。尽管如此，生物测定结果中仍观察到较高水平的变异。
这种变异的潜在来源可能包括：在生物测定过程中，由于通过表面间接接触杀虫剂，导致样本间杀虫剂暴露不均、环境效应异质性、相同基因型个体之间的正常生物学差异，以及同一种群中个体质量的差异12。一种较少使用但可重复性更高的方法是点滴法生物测定。在此方法中，杀虫剂被直接施用于每只昆虫13,14，从而消除了同次测定中不同样本暴露程度不一致的影响因素。然而，由于该方法通量较低，通常不被用作蚊虫种群杀虫剂敏感性监测的常规工具。本文提出了一种改良的点滴法生物测定方案，可在实现较高通量处理的同时，校正昆虫个体质量差异带来的影响——这一参数与杀虫剂敏感性的变化密切相关12。减少因杀虫剂暴露不均导致的死亡率数据中的噪声和与质量相关的变异，将有助于更准确地开展技术性抗性监测11,15。此类数据可用于更精确地将表型抗性与遗传标记、适合度参数和/或媒介能力相关联。此外，我们还展示了如何通过在果蝇（一种体型较小的昆虫物种）上应用点滴法生物测定，轻松将该方法适配于其他昆虫物种。
上述残留接触检测方法的主要局限性在于，在同一次实验中，不同样本所接触的杀虫剂暴露量可能存在差异。在CDC瓶式生物测定和接触法中，同一次实验的不同重复之间，昆虫接触的杀虫剂暴露量也可能存在差异。昆虫暴露于分布在玻璃瓶内壁（CDC瓶式生物测定和接触法）或浸渍纸张（WHO管式试验）上的杀虫剂。玻璃和纸张表面的杀虫剂浓度是已知的，并通过筛选已知基因型的不同物种预先确定。然而，昆虫实际可吸收的杀虫剂量可能因所用表面材料、杀虫剂混合物的成分以及杀虫剂在表面材料上分布的均匀程度而存在显著差异16,17。在CDC瓶式生物测定中，瓶内壁的杀虫剂涂层依赖于各实验室和操作人员所采用的操作流程。在WHO管式试验中，经杀虫剂处理的纸张为集中生产，因此在不同实验室之间很可能具有较高的均一性。然而，在WHO管式试验中，暴露管允许样本停留在未接触杀虫剂的金属网表面，从而导致每次测试中不同样本之间的杀虫剂暴露可能存在不均一性。通过上述每种方法实际被样本摄取和吸收的杀虫剂量仍需进一步研究18。
此外，CDC瓶法生物测定、WHO管法试验和接触法通常作为阈值测定方法，仅测试一种预设的杀虫剂浓度。该方法可准确检测抗性的存在，在抗性监测中具有重要价值（尤其是在抗性扩散期间）。然而，阈值测定无法量化抗性的强度，而抗性强度可能更能够预测干预措施的效果。若在这些方法中使用多种杀虫剂浓度，则可将其用作强度测定。针对CDC瓶法生物测定和WHO管法试验，已有研究通过测试预设鉴别剂量的5倍和10倍浓度来弥补监测中的这一不足6,19。尽管使用多个剂量有助于更好地区分不同抗性种群，但3至5个（预设）剂量所提供的分辨率仍有限，难以精确计算致死浓度。此外，此类测定中常使用不同体型的蚊虫。然而，个体质量至关重要，因为较大的个体可能需要更高的剂量才能致死，其单位质量的有效剂量将远低于较小个体12。计算基于质量归一化的致死剂量（单位昆虫质量所对应的杀虫剂用量）将比常用的致死浓度（例如，单位表面积所对应的杀虫剂用量）更具参考价值，因为它考虑了不同性别、种群和基因型之间昆虫质量的差异。此类数据有助于弥合实验室与野外研究中基因型抗性与表型抗性之间的差距，同时也可为计算针对已知平均质量昆虫种群所需的施用浓度提供简便方法。
使用基于单位质量标准化的半数致死剂量（LD50）还具有多项其他优势。在人类和兽医毒理学中，以 mg/kg（= ng/mg）表示特定化合物毒性的评估是标准做法14，且 LD50 值通常可在材料安全数据表中找到。致死剂量还可实现不同化学物质对同一物种，或同一化学物质对不同物种毒性的直接比较20，并有助于对新型杀虫剂和化学品进行高质量评价13。此外，与基于诊断剂量致死率结果得出的抗性比值相比，LD50 能提供更具意义且更准确的抗性比值，后者可能高估种群中存在的抗性水平。因此，该检测方法适用于常规监测项目，可通过基于更多样本量计算得出的单位质量标准化致死剂量，实现比其他生物测定推荐样本量更严格的抗性监测21。
局部施用法已被用于蚊虫和蝇类的杀虫剂敏感性监测，作为在已知或怀疑存在抗性情况下的标准杀虫剂敏感性生物测定的替代方法22,23，同时也用于某些害虫昆虫的监测24，以更准确地评估抗性特征和杀虫剂的内在毒性21。在局部施用生物测定中，杀虫剂被直接施加于每只昆虫个体，从而最大程度减少杀虫剂暴露量的变异。本文介绍了一种经过轻微改进和优化的方法，可在短时间内对大量昆虫施加杀虫剂处理，同时控制昆虫体重因素22。这种高通量且具有良好重复性的方法，可作为常规杀虫剂敏感性监测的有力补充工具。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Thomas Scientific</td><td>20A00L068</td><td>丙酮分装储存</td></tr><tr><td>1.5 mL 螺口管</td><td>Thomas Scientific</td><td>1182K23</td><td>杀虫剂稀释液储存</td></tr><tr><td>15 mL 锥形管</td><td>VWR</td><td>339651</td><td>杀虫剂稀释液储存</td></tr><tr><td>20 mL 玻璃闪烁瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>0334125D</td><td>果蝇称重</td></tr><tr><td>25 &amp;mu;L 注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>14815288</td><td>局部施药器</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC423240040</td><td>ACS 级，纯度 99.6%，4 L</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Aedes aegypti&lt;/em&gt;（IICC 品系）</td><td>USDA CMAVE</td><td>NA</td><td>杀虫剂抗性</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Aedes aegypti&lt;/em&gt;（Rockefeller 品系）</td><td>CDC</td><td>NA</td><td>杀虫剂敏感</td></tr><tr><td>分析天平</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-557-409</td><td>精度达 0.1 mg</td></tr><tr><td>吸虫器</td><td>Amazon</td><td>6.49986E+11</td><td>蚊虫采集装置</td></tr><tr><td>实验台纸</td><td>VWR</td><td>89126-794</td><td>置于工作台面下方</td></tr><tr><td>棉签</td><td>Amazon</td><td>B092S8JVQN</td><td>用于昆虫分选</td></tr><tr><td>脱脂棉球</td><td>Amazon</td><td>B0769MKZWT</td><td>用于蔗糖溶液</td></tr><tr><td>移液器分配器</td><td>Fisher Scientific</td><td>1482225</td><td>重复移液器</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Drosophila melanogaster&lt;/em&gt;（Canton-S 品系）</td><td>威斯康星大学麦迪逊分校</td><td>NA</td><td>杀虫剂敏感</td></tr><tr><td>细头毛笔</td><td>Amazon</td><td>B07KT2X1BK</td><td>用于昆虫分选</td></tr><tr><td>果蝇培养瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS355</td><td>用于果蝇饲养与分选</td></tr><tr><td>手持式 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 麻醉装置</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1710679</td><td>用于击倒昆虫</td></tr><tr><td>暂存杯</td><td>Amazon</td><td>B08DXG7V1S</td><td>透明塑料杯</td></tr><tr><td>冰袋</td><td>Amazon</td><td>B08QDWMMW5</td><td>用于击倒果蝇</td></tr><tr><td>制冰盒</td><td>Amazon</td><td>9301085269</td><td>用于击倒昆虫</td></tr><tr><td>昆虫镊子</td><td>Amazon</td><td>B07B4767WR</td><td>昆虫镊子</td></tr><tr><td>杀虫剂</td><td>Sigma-Aldrich Inc</td><td>45423-250MG</td><td>溴氰菊酯</td></tr><tr><td>标签贴纸</td><td>Amazon</td><td>B07Q4X9GWX</td><td>3/4&quot; 彩色圆点贴纸</td></tr><tr><td>标签胶带</td><td>Amazon</td><td>B00X6A1GYK</td><td>白色胶带</td></tr><tr><td>网布</td><td>Amazon</td><td>B07F2PHHWV</td><td>用于覆盖暂存杯及昆虫操作帐篷</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712H371</td><td>100 mm × 15 mm</td></tr><tr><td>PVC 管</td><td>Lowe&amp;rsquo;s</td><td>23971</td><td>昆虫操作帐篷材料</td></tr><tr><td>橡皮筋</td><td>Amazon</td><td>B00006IBRU</td><td>用于固定杯口网罩</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Amazon</td><td>B01J78INO0</td><td>白砂糖</td></tr><tr><td>称量纸</td><td>VWR</td><td>12578-165</td><td>4&quot; × 4&quot;</td></tr></tbody></table>

用于量化蚊虫和果蝇杀虫剂毒性的局部施用生物测定法

Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies

杀虫剂在公共卫生和农业中的持续使用已导致广泛的杀虫剂抗性，阻碍了防控措施的有效性。蚊虫种群杀虫剂抗性监测通常通过美国疾病控制与预防中心（CDC）瓶法生物测定或世界卫生组织（WHO）管式试验进行。然而，由于昆虫与杀虫剂接触程度存在差异，这些方法可能导致死亡率数据变异性较高&#160;昆虫、测试生物数量相对较少、种群间质量差异显著以及环境条件持续变化，导致结果存在变异性。本文介绍了经改进的表面施用生物测定法，作为一种高通量表型生物测定方法，适用于蚊虫和果蝇，可用于大量昆虫的检测&#160;一系列杀虫剂浓度
该检测方法具有以下优势：1）确保每种生物个体均接受一致的处理并充分接触杀虫剂；2）生成高度特异的剂量-反应曲线，能够校正不同品系及性别间平均质量的差异（对于野外采集的生物样本尤为重要）；3）可计算具有严格统计学意义的半数致死剂量（LD50），这对于抗性倍数比较至关重要——这是一种区别于诊断剂量致死率检测的替代性监测方法，后者也常用于幼虫杀虫剂抗性监测。本检测方法可作为精确表型鉴定蚊虫种群的有力补充工具，并且如以果蝇为例所示，该方法可轻松适配于其他昆虫物种。我们认为，该检测方法将有助于弥合多种昆虫中杀虫剂抗性的基因型与表型之间的差距。

这些代表性结果包括两种不同的埃及伊蚊（Ae. aegypti）品系：洛克菲勒（ROCK）品系，以及来自佛罗里达州的已知具有击倒抗性突变 F1534C 和 V1016I（IICC 基因型）的野外分离品系。此外，还包含黑腹果蝇（Drosophila melanogaster，Canton-S 品系）。
图2 和 图3 展示了根据上述实验方案测试的不同品系及性别的每种生物体的剂量-反应关系。在每个蚊虫品系内，雄蚊与雌蚊之间的剂量-反应曲线未观察到显著差异（ROCK 品系：t = 1.70，p = 0.098；IICC 品系：t = 0.64，p = 0.527），因此将每个蚊虫品系中两性别的数据合并分析。ROCK 和 IICC 品系的质量标准化 LD50 分别为 0.008 ng/mg（95% CI：0–0.104）和 0.336 ng/mg（95% CI：0.235–0.438）。这些值的 95% 置信区间无重叠，表明两个品系的剂量反应存在显著差异。IICC 品系相对于 ROCK 品系的抗性比（RR）为 41.7，根据世界卫生组织（WHO）标准，属于高度抗性5。对于 Canton-S 果蝇，其质量标准化 LD50 为 0.213 ng/mg（95% CI：0–0.490）。
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63391/63391fig02.jpg" /> 
图2：通过点滴法生物测定获得的蚊虫代表性数据。 根据上述方案使用溴氰菊酯和蚊虫进行点滴法生物测定所获得的代表性剂量-反应数据：（A）雌性 Ae. aegypti ROCK（n = 880）和 IICC（n = 550）品系；（B）雄性 Ae. aegypti ROCK（n = 880）和 IICC（n = 569）品系。溴氰菊酯测试浓度范围为 0.00075 ng/µL 至 9.68705 ng/µL，x 轴表示每只蚊虫平均质量（mg）所施加的溴氰菊酯剂量（ng）。y 轴以比例形式显示死亡率。每组数据点群中穿过数据的黑线代表对应品系和性别特异性的线性回归曲线。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/63391fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63391/63391fig03.jpg" /> 
图3：通过局部施用生物测定法获得的果蝇代表性数据。 根据上述方案，使用溴氰菊酯和果蝇（D. melanogaster Canton-S 品系，n = 1014）进行局部施用生物测定所得到的代表性剂量-反应数据。溴氰菊酯的测试浓度范围为 0.00499 至 5.02876 ng/µL，横轴表示每单位平均果蝇质量（mg）所施加的溴氰菊酯剂量（ng）。纵轴显示死亡率的比例。黑色线条代表线性回归结果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/63391fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充图 S1：台式昆虫操作帐篷。 台式昆虫操作帐篷用于在进行表面施用实验时更方便地捕捉逃逸的蚊子或苍蝇。图中结构在 A 中为关闭状态，在 B 中为打开状态。该结构由聚氯乙烯（PVC）管和细网眼织物制成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_Figure1.Final.V1.pdf" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充图 S2：注射器与重复加样装置单元。 用于昆虫给药的注射器与重复加样装置单元。主要部件包括 1）针头，2）注射器筒体，3）推杆，4）重复加样器，以及 5）重复加样按钮。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_Figure2.Final.V1.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 1：随机化脚本：用于为每次实验的所有杯子生成无偏标签的随机化脚本。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File1_Randomization.Script.Final.V1.docx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 2：死亡率评分表：用于辅助死亡率评估的死亡率评分表。该表格还包含用于记录方案中提及的所有其他重要信息的位置，例如杀虫剂施用的开始和结束时间。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File2_Mortality.Score.Sheet.Final.V1 (1).docx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 3：示例死亡率数据：用于生成图 2的示例数据文件。各列标题说明如下：“id” = 每个数据点的识别代码；“species” = 物种名称（例如，Aedes aegypti）；“insecticide” = 局部施用的杀虫剂名称（例如，Deltamethrin）；“strain” = 蚊株名称（例如，ROCK）；“date” = 局部施用开始日期；“sex” = 蚊虫性别；“age” = 蚊虫年龄（young = 3–5 日龄；old = 4 周龄）；“total.mosq” = 批次中称重的蚊虫总数；“weight” = 批次内所有蚊虫的总重量（mg）；“concentration” = 杀虫剂浓度（µg/mL）；“syringe” = 注射器液滴体积（mL）；“dose” = 施用于每只蚊虫的杀虫剂有效成分含量（ng）；“total” = 每杯中蚊虫数量；“dead” = 每杯中死亡蚊虫数量。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File3_Example.Data.Final.V1 (1).txt" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 4：R 分析代码：可用于完成概率分析（参见方案第 8 步所述）的示例 R 代码。该 R 代码可配合代表性结果（可通过补充示例数据文件获取）一起使用。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File4.Final.V3 (1).R" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

我们描述了用于测定蚊虫和果蝇杀虫剂敏感性的局部施用生物测定法的方法学及其重要性。本方法通量高，利用昆虫的总质量——从而能够计算基于质量归一化的致死剂量而非浓度——且相较于其他类似方法可能具有更低的变异性。

杀虫剂在公共卫生和农业中的持续使用已导致广泛的杀虫剂抗性，阻碍了防控措施的有效实施。

通过直接将杀虫剂施用于昆虫体内，而非通过表面接触，可最大限度减少杀虫剂暴露的变异，从而更准确地测定蚊虫种群的敏感性特征。该技术的主要优势在于，能够计算基于质量标准化的杀虫剂致死剂量，而非致死浓度，从而显著提高抗性比值的可比性。务必注意妥善保存杀虫剂，避免工具污染，并确保注射器各部件处于良好状态。这将有助于获得一致的实验结果。首先，从冷冻箱中取出所需的杀虫剂溶液。立即涡旋振荡溶液或倒置混匀五次，并将其置于避光容器中，在室温下放置，使杀虫剂升温至室温后再使用。准备五个微型离心管，每管中加入0.5毫升丙酮。用第一个管中的丙酮将注射器筒完全充满，然后迅速推动活塞，将丙酮排入废液容器中。重复此操作四次，共使用同一份丙酮完成五次洗涤。然后，将注射器筒完全充满空气，并将空气及可能残留的丙酮排入废液容器中。重复此操作两次，共完成三次空气清洗。通过将活塞向筒内拉动约五毫米，在注射器筒内、活塞与针头顶部之间形成一个空气腔。使用随机编号标记塑料盛放杯，用于盲法死亡率评估。使用由吸气驱动的吸虫器，吸取所需数量的三至五日龄成蚊。将吸虫器的尖端插入装有棉塞的试管中，棉塞应包裹在吸虫器尖端周围。轻轻呼气，轻敲吸蚊器，将蚊虫转移至锥形管中。移除吸蚊器吸头后，立即用棉塞堵住管口，然后盖上管盖。将装有蚊虫的锥形管置于4摄氏度环境中至少10分钟，或将其埋入冰盒的冰中，以短暂击倒蚊虫。将击倒的蚊子转移至昆虫操作帐篷中。将蚊子小心倾倒至置于冰上的塑料托盘中，每次倾倒约50只，确保每只蚊子均接触下方低温托盘，以维持其击倒状态。使用镊子轻轻夹住蚊子的足或翅，按性别进行分选，将不同性别的蚊子分别放入各自的暂存杯中，达到所需数量后停止操作。分选时，剔除受伤或体型过大或过小的蚊子。为记录蚊子容器的重量，将一个空容器加上培养皿作为盖子放在天平上，将天平归零。将蚊子倒入容器中，并盖上盖子。将容器置于天平上，记录最终重量及蚊虫数量。立即将装有样本的杯子放回冰上，以保持其处于麻痹状态，直至所有样本杯均完成称重。将准备好的蚊虫分成5至10份，分别置于冰上的杯子中，并用随机编号标记。使用镊子和手持计数器，每杯放入20至25只蚊子。分选果蝇时，用二氧化碳麻醉果蝇7秒，然后将果蝇倒入包裹在实验台纸中的冰袋上。使用尖头画笔将雄性和雌性分开并计数。用画笔轻轻挑起选定的果蝇，放入干净的空培养瓶中。在挑选出数量相等的雄性和雌性果蝇后，用菌株名称和果蝇总数标记培养瓶。用二氧化碳麻醉果蝇瓶7秒钟。将果蝇倒在称量纸上，利用称量纸作为漏斗，将果蝇转移至已去皮并标记有随机编号的样品瓶中。将培养皿盖盖在装有果蝇的样品瓶上后，置于天平上。在记录表上记下总重量及标本数量。立即将装有果蝇的试剂瓶放入冰盘中，瓶盖保持盖紧，以防止果蝇逃逸。使用适当浓度的杀虫剂填充注射器，从最低浓度剂量开始，对每组生物依次逐步增加至最高浓度剂量。将样本倾倒至铺在冰盘上的称量纸上。使用干净且无杀虫剂的画笔或棉签将靠在一起的标本分开，以便于对每个标本进行给药操作。使用注射器将一滴杀虫剂溶液施加到蚊子的腹胸部及腹部区域，或施加到果蝇的背部。随后立即将标本倒回已标记的塑料杯中。用网罩和橡皮筋盖住杯子。若在此过程中有标本死亡、受损或逃逸，需在杯子上注明更新后的标本数量。将处理完毕的杯子放入盛放托盘中。对于第一个杯子，记录给药完成的时间。对每个杯子重复给药操作，直至所有样本均已被施加适当的杀虫剂浓度，并记录所有样本完成给药的结束时间。通过湿润的棉球向每个杯子提供10%蔗糖溶液，并将蚊子和果蝇置于所需的温度和湿度条件下饲养。在开始杀虫剂暴露后24小时记录样本死亡率。根据世界卫生组织（WHO）的描述，若蚊虫能够飞行并保持直立，则归为存活；若无法移动或出现共济失调，则归为死亡。对果蝇采用相同的死亡率评估标准。完成生物测定后，获得了针对埃及伊蚊的Rockefeller和IICC基因型雌雄个体的剂量反应数据。Rockefeller和IICC基因型的相对质量中位致死剂量分别为0.008和0.336纳克每毫克。结果表明，在每种基因型内，雌蚊与雄蚊的剂量反应曲线之间无显著差异。因此，合并两性别的数据以计算半数致死剂量值。由于这两种品系半数致死剂量的95%置信区间无重叠，认为这些值具有显著差异。此外，在计算抗性倍数时，IICC品系的抗性超过敏感型Rockefeller品系40倍以上。还获得了果蝇（Drosophila melanogaster）Canton-S品系的剂量反应数据，其质量归一化的半数致死剂量为0.213纳克每毫克。实验过程中保持一致性至关重要，尤其是在储存和施用杀虫剂以及评估死亡率时。此外，在处理样本时需格外小心，以避免造成非杀虫剂引起的伤害或死亡。通过该方法，我们现在能够准确测定蚊虫种群的技术抗性，以及环境条件对技术抗性的影响，或技术抗性如何预测实际抗性。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

局部应用生物测定以量化蚊子和果蝇的杀虫剂毒性

本文展示并讨论了用于调查节肢动物害虫对触杀型和内吸型杀虫剂的敏感性及检测其抗药性的技术。...

监测昆虫抗药性的生物测定方法

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在本视频中，我们演示了通过点滴法检测潜在杀虫剂对成年雌性蚊虫的毒性。该方法利用一种多巴胺受体拮抗剂，该拮抗剂可导致蚊虫神经传递发生致死性抑制，从而评估杀虫剂经体表施用后的毒理效应。...

局部施用测试实验：通过局部施用评估多巴胺受体拮抗剂对成年雌性蚊虫杀虫潜力的技术方法

本视频展示了一种通过血液饲喂来评估具有新型作用机制的测试化合物对雌性蚊虫致死率和生殖力影响的实验方法。该技术有助于筛选新型杀虫剂，以杀灭抗药性蚊虫种群并控制疾病传播。...

蚊媒喂食实验：一种评估测试化合物对成年雌性蚊虫死亡率和繁殖力影响的方法

本文描述了用于评估化学物质对幼蚊和成蚊毒性的实验方案，旨在开发新型的杀幼蚊剂、杀成蚊剂和内吸杀虫剂。这些方案支持对多种化学物质在单一剂量条件下进行高通量测试，并可通过剂量反应实验进一步评估其通过接触或摄食途径产生的毒性效应。...

测试新型杀虫化学物质对蚊虫毒性的实验方案

针对有害生物和病媒昆虫的公共卫生杀虫剂在不同生态区域中的效果并不一致。本文介绍了一套利用圈养病媒昆虫作为杀虫剂效果监测哨兵的技术体系，以生成电子地图，支持在多种环境中对杀虫剂进行标准化评估。...

在野外可视化评估杀虫剂对病媒蚊虫的防治效果

本方案描述了一种我们已标准化并多年用于将特定量的核酸直接递送至蚊子和家蝇血淋巴的显微注射方法。该方案可实现极低的注射死亡率，并允许进行与剂量相关的繁殖力测定。...

蚊虫与家蝇中可重复的dsRNA显微注射及产卵生物测定

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研究果蝇（Drosophila）中的攻击行为

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埃及伊蚊胚胎显微注射获得转基因蚊子

Fopius arisanus 是一种寄生在实蝇科果实蝇卵和幼虫阶段的寄生蜂，已被成功用于这些重要热带害虫的生物防治。本文介绍了一种利用 readily available materials 小规模人工繁殖 F. arisanus...

一种优化的饲养方案 Fopius arisanus，一种寄生性天敌，针对实蝇科果实蝇

学习局部应用生物测定法以量化埃及伊蚊和果蝇的杀虫剂毒性。该方法通过直接施药减少暴露变异，实现质量相对化致死剂量计算，提高抗性比率比较的准确性，为病媒管理和抗性监测提供更可靠的技术支持。

用于量化蚊虫和果蝇杀虫剂毒性的局部施用生物测定法

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