原代人鼻上皮细胞：精准医学背景下的生物样本库建设

本方案重点介绍了原代鼻上皮细胞的扩增、分化及冷冻保存的关键步骤。在我们的培养条件下，原代鼻上皮细胞可模拟肺上皮组织，从而可利用新鲜或生物库储存的细胞建立患者来源的培养体系，开展个体化医学研究。

患者来源的鼻上皮细胞培养物可用于评估CFTR活性，并通过评价患者对新疗法的个体反应来辅助囊性纤维化治疗。演示该实验操作的是本实验室的工程师Aurelie Hatton。首先，在10毫升扩增培养基中培养鼻上皮细胞或HNE细胞。

在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，将细胞置于75平方厘米的胶原蛋白包被培养瓶中培养，直至细胞融合度达到80%至90%。每48至72小时更换一次培养基。随后，用10毫升无镁无钙的DPBS洗涤细胞。

吸出并弃去生理盐水。加入两毫升 0.25% 胰蛋白酶后，将培养瓶放回培养箱中孵育 8 到 12 分钟。随后用手掌用力轻拍培养瓶，以促进细胞脱落。

加入10毫升扩增培养基以终止酶促反应。使用10毫升移液器反复吸取和排出扩增培养基，充分冲洗培养瓶表面，以冲洗并解离细胞，并将细胞收集至15毫升离心管中。在4摄氏度条件下，以500 × g离心细胞悬液5分钟，弃去上清液。

将沉淀物重悬于5至10毫升扩增培养基中。随后使用血细胞计数板对细胞进行计数。细胞计数后，在4°C条件下以500 × g离心5分钟，弃去上清液。

然后将沉淀重悬于富含保护成分的冻存液中，调整细胞浓度至每毫升含3×10⁶至5×10⁶个细胞，并转移至冻存管中。将冻存管置于合适的程序降温冻存容器内，在-80 °C条件下以约每分钟降低1 °C的速率缓慢冷冻细胞。次日，将保存的样本转移至液氮储存容器中，进行长期保存。

将新配制的扩增培养基置于设定为 37 摄氏度的水浴中预热。从液氮储存罐中取出冻存管，并迅速放入水浴中，注意不要将整个冻存管浸入水中。当冻存管中仅剩少量冰晶时，立即将其从水浴中取出。

用70%酒精擦拭小瓶，并将其置于超净台内。使用1毫升移液器将解冻的细胞转移至15毫升离心管中。然后以逐滴方式加入1毫升预热的扩增培养基。

一分钟后，再加入一毫升扩增培养基，静置一分钟。加入10毫升扩增培养基，于4°C、500 × g 离心两分钟。吸除并弃去上清液。

将沉淀重悬于适量扩增培养基中，以达到每毫升含1×10⁶个细胞的密度。将细胞接种至含有扩增培养基的25平方厘米胶原包被培养瓶中后，在37°C及5%二氧化碳条件下培养细胞。在进行如前所述的细胞扩增操作前，需肉眼观察细胞生长情况2至3天。

将细胞以每0.33平方厘米胶原蛋白包被的多孔滤膜接种3.3 × 10⁵个细胞的密度进行培养，在顶端侧加入300 µL扩增培养基，基底侧加入900 µL气液界面培养基。三天后，吸除顶端培养基，将细胞在气液界面培养基中于气液界面条件下继续培养3至4周，以建立分化的上皮层。每48至72小时更换一次基础培养基。

在气液界面培养的原代人鼻上皮细胞表现出极化且分化的呼吸道上皮细胞的典型特征。在78例人鼻上皮细胞样本中，比较了鼻刷取后立即接种与在灌洗液中运输1至7天后接种的培养成功率。最初培养成功的平均百分比为82%，而在取样后0至5天内接种的样本中，成功率达到87%。

在新鲜条件下成功分化的样本中，有83%在冻存样本中也成功分化。类似地，在新鲜条件下未能分化的样本中，有71%在冻融条件下同样未成功。此外，每支冻存管中细胞数量在2×10⁶至3×10⁶之间冻存的样本，有50%在解冻后未能生长，而细胞数量低于2×10⁶时，该比例达到80%。

对于经DMSO处理的HNE细胞，其短路电流在佛司可林刺激下的变化以及在CFTR抑制剂172作用下的短路电流变化，在新鲜HNE细胞与冻融后HNE细胞之间未观察到显著差异。经药物处理后，两种细胞均表现出显著的功能校正，表现为对佛司可林刺激的短路电流变化增加，以及对CFTR抑制剂172反应的短路电流变化降低。与DMSO处理的HNE细胞相比，双联疗法对CFTR功能的校正效果通过检测佛司可林刺激下和CFTR抑制剂172作用下的短路电流变化进行评估，结果显示VX-809联合VX-770以及VX-661联合VX-770均显著改善了上述两项指标。

比较了六名F508del纯合子患者来源的人鼻上皮（HNE）细胞中三种不同的CFTR调节剂治疗效果。当联合使用CFTR校正剂和增效剂（均为Vertex公司的CFTR调节剂）时，两者对佛司科林诱导的短路电流变化以及CFTR抑制剂172诱导的短路电流变化的纠正程度相似。在冻存HNE细胞时，每个冻存管中至少应含有300万个细胞，以提高解冻后获得良好结果的概率。

研究表明，HNE细胞中的CFTR活性是评估和调整囊性纤维化个体化治疗方案的良好预测模型。