Name: 原代人鼻上皮细胞:精准医学背景下的生物样本库 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-22T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: 了解原代人鼻上皮细胞的分离、扩增与气液界面分化技术，建立生物样本库用于囊性纤维化精准医学研究。该方法支持CFTR功能评估及个体化治疗反应分析。

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我们衷心感谢所有参与本研究的患者及其家属。本研究得到了法国囊性纤维化战胜协会（Vaincre la Mucoviscidose）、法国ABCF 2协会以及Vertex Pharmaceuticals创新奖的资助。

所有实验均遵循《赫尔辛基宣言》和人类研究伦理的 Huriet-Serusclat 法律所描述的指南和规定进行。
1. 锥形瓶和不同培养基的准备
<ol>
	<li>按照表1中所述方法配制扩增培养基、气液相培养基和冻存培养基。</li>
	<li>通过将50 mg胶原蛋白IV溶解于100 mL 0.2%冰醋酸中，制备人胶原蛋白IV的储备液。使用磁力搅拌器搅拌至少1小时，并对溶液进行过滤除菌。置于4 °C避光保存于玻璃瓶中，可保存长达6个月。</li>
	<li>将储备液用双蒸水按1:5比例稀释，制备胶原蛋白IV的工作液。4 °C保存，可保存长达6个月。</li>
	<li>用胶原蛋白IV工作液对塑料细胞培养瓶或Transwell小室滤膜进行包被。在培养瓶整个生长表面均匀分布以下体积：0.33 cm2 Transwell滤膜使用100 µL，25 cm2培养瓶使用500 µL，75 cm2培养瓶使用1 mL。 
	注意：可通过轻轻倾斜培养瓶使其左右晃动以实现均匀分布。或者，为便于包被，可使用更大体积，待整个表面均匀覆盖后，吸出多余胶原溶液，仅保留上述指定体积。所吸出的胶原溶液可立即用于下一个培养瓶的包被（例如，对于三个75 cm2培养瓶，先在第一个瓶中均匀分布3 mL胶原溶液，吸出2 mL用于下一个瓶，依此类推）。</li>
	<li>将细胞培养瓶置于培养箱中孵育至少2小时或过夜。彻底吸除胶原溶液后，将培养瓶在培养箱或超净台中干燥至少20分钟或过夜。</li>
	<li>用10 mL无Mg2+和Ca2+的DPBS洗涤，于培养箱中干燥，然后用铝箔包裹避光保存。室温（RT）下可保存长达6个月。</li>
</ol>
2. 鼻腔刷取
注意：确保在受试者无急性感染时进行鼻腔刷取。若囊性纤维化（CF）患者存在肺部感染，应参考患者的抗生素敏感性图谱，并在扩增培养基中添加额外的抗生素。人鼻腔上皮细胞通过鼻腔刷取法从F508del/F508del患者中采集，方法如前所述9。
<ol>
	<li>让患者擤鼻，然后使用浸有5%利多卡因与萘甲唑啉溶液的棉网对双侧鼻孔的黏膜进行局部麻醉。</li>
	<li>用细胞刷轻轻刷取双侧鼻孔的鼻中隔内侧壁和下鼻甲，将刷子浸入含2 mL市售灌洗液的15 mL离心管中，轻轻振荡以使细胞脱落。在另一侧鼻孔重复刷取操作。</li>
	<li>在灌洗液中加入以下抗生素：青霉素（100 U/mL）、链霉素（100 µg/mL）、他唑西林（10 µg/mL）、两性霉素B（2.5 µg/mL）和多黏菌素（Colimycin，16 µg/mL）。 
	&#8203;注意：鼻刷样本可在室温下运送至专用实验室进行扩增和培养，且最迟可在刷取后72小时内接种。</li>
</ol>
3. HNE 的分离
注意：HNE 通过细胞学刷取法分离，用无 Mg2+ 和 Ca2+ 的 DPBS 洗涤后，以 0.25% 胰蛋白酶消化解离，并按先前所述方法接种至 25 cm2 塑料培养瓶中10。
<ol>
	<li>通过将细胞刷反复穿过1000 µL移液器吸头，并用2 mL无Mg2+和Ca2+的DPBS冲洗，从细胞刷上解离细胞。在4 °C下以500 × g离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>将沉淀重悬于0.25%胰蛋白酶中消化8–12分钟以解离细胞。加入5 mL扩增培养基终止酶反应。</li>
	<li>在4 °C下以500 × g离心5分钟，弃去上清液。将沉淀重悬于8 mL扩增培养基中，接种至一个25 cm2的胶原蛋白包被培养瓶中。于37 °C、5% CO2条件下培养。此为第0代。</li>
	<li>次日，更换为5 mL新鲜扩增培养基，每日观察细胞贴壁情况、形态（细胞应呈紧密的鹅卵石样外观）及数量。 
	&#8203;注意：初始接种密度取决于鼻腔刷取样本的质量及上皮细胞所占比例。新鲜分离的人鼻上皮细胞通常在3–10天内达到80%–90%融合度。若细胞生长缓慢，提示样本中上皮细胞不足，应弃用该样本。</li>
</ol>
4. 人鼻腔上皮细胞的扩增与传代
<ol>
	<li>将人鼻上皮细胞接种于经胶原蛋白包被的培养瓶中，在 37 °C、5% CO2 条件下使用扩增培养基培养至 80%–90% 汇合度，每 48–72 小时更换一次培养基。对于 25 cm2 培养瓶，使用 5 mL 扩增培养基；对于 75 cm2 培养瓶，使用 10 mL。</li>
	<li>当细胞达到 80%–90% 汇合度时，用 10 mL 无 Mg2+ 和 Ca2+ 的 DPBS 洗涤细胞，吸除并弃去洗涤液。</li>
	<li>向 25 cm2 培养瓶中加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶（或向 75 cm2 培养瓶中加入 2 mL 胰蛋白酶），放回培养箱（37 °C，5% CO2）孵育 8–12 分钟。</li>
	<li>用手掌用力轻拍培养瓶，以促进细胞脱落。</li>
	<li>加入 10 mL 扩增培养基以终止酶反应。使用 10 mL 移液管反复吹打，将扩增培养基在培养瓶表面反复冲洗，以充分冲洗并悬浮细胞。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>将沉淀物重悬于 5–10 mL 扩增培养基中。</li>
	<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数。 
	&#8203;注意：此时可将细胞冻存（参见步骤 5.1–5.3）。如需进一步扩增，可将细胞重新接种至胶原蛋白包被的培养瓶中（一个 25 cm2 培养瓶的细胞可扩增至三个 75 cm2 培养瓶，不建议更高倍数的稀释）。</li>
</ol>
5. 原代鼻上皮细胞的冷冻保存
注意：在进行生物样本保藏前，需将 HNE 细胞培养至第 1 代，以确保冻存后复苏时有足够的细胞量支持细胞生长。然而，也可在初始第 0 代或第 2 代进行生物样本保藏。以下冷冻保存步骤适用于所有代次。
<ol>
	<li>细胞计数后，在 4 °C 条件下以 500 x g 离心 5 分钟，弃去上清液</li>
	<li>用加富冷冻培养基（表 1）重悬细胞沉淀，使每毫升每冻存管含有 3 x 106-5 x 106 个细胞。</li>
	<li>将细胞缓慢冷冻，使用合适的冻存容器在 -80 °C 下以约每分钟 1 °C 的速率降温。次日，将保存的样本转移至液氮储存容器中进行长期保存（本研究最长保存时间为 17 个月）。</li>
</ol>
6. 解冻冻存的扩增后HNE细胞
<ol>
	<li>将水浴锅预热至 37 °C。按照表 1 所述配制扩增培养基，并将培养基预热至 37 °C。</li>
	<li>从液氮储存罐中取出冻存管，迅速放入水浴锅中，注意不要将整个冻存管浸入水中。当冻存管内仅剩少量冰晶时，将其从水浴中取出。用 70% 酒精擦拭管身，擦干后置于生物安全柜中。</li>
	<li>使用 1 mL 移液器将解冻后的细胞转移至一个空的 15 mL 离心管中。</li>
	<li>以逐滴方式加入 1 mL 预热的扩增培养基。1 分钟后，再加入 1 mL 扩增培养基，继续静置 1 分钟。</li>
	<li>加入 10 mL 扩增培养基，以 500 x g 离心 2 分钟。</li>
	<li>吸除并弃去上清液。将细胞沉淀重悬于适量扩增培养基中，调整细胞密度至至少 1 x 106 个细胞/mL。</li>
	<li>将细胞接种至含扩增培养基的胶原蛋白包被培养瓶中。
	<ol>
		<li>若冻存管中细胞数量超过 4 x 106 个，则接种至 75 cm2 培养瓶中，加入 10 mL 扩增培养基</li>
		<li>若冻存管中细胞数量少于 4 x 106 个，则接种至 25 cm2 培养瓶中，加入 5 mL 扩增培养基</li>
	</ol>
	</li>
	<li>于 37 °C、5% CO2 条件下培养，在接下来的 2–3 天内观察细胞增殖情况。</li>
	<li>随后，按照第 4 节所述进行细胞扩增。 
	&#8203;注意：若在步骤 4.7 中收获的细胞数量较少（例如在扩增前的第 0 代即进行冻存），则可省略步骤 6.5 和 6.6，直接将细胞接种至 25 cm2 胶原蛋白包被培养瓶中，无需离心。次日必须更换培养基以去除二甲基亚砜（DMSO）。</li>
</ol>
7. 人鼻腔上皮细胞在气液界面的分化
注意：HNE 在气液界面的分化方法如前所述10。
<ol>
	<li>将细胞以每0.33 cm2胶原蛋白包被的多孔滤膜330,000个细胞的密度接种，在顶端加入300 µL扩增培养基，在基底侧加入900 µL气液界面培养基。</li>
	<li>3天后，吸除顶端培养基，将细胞在气液界面培养基中于气液界面条件下培养3-4周，以建立分化的上皮层。每48-72小时更换一次基础培养基。</li>
</ol>
8. CFTR 调节剂
<ol>
	<li>配制含有CFTR调节剂的气液相培养基。使用VX-445、VX-661和VX-809，终浓度为3 µM，VX-770的终浓度为100 nM。使用校正剂ABBV-2222，终浓度为1 µM，增效剂ABBV-974，终浓度为10 µM。所有CFTR调节剂均用100% DMSO溶解。</li>
	<li>配制含有与校正剂培养基中等量100% DMSO的气液相培养基。</li>
	<li>将含有药物或DMSO的培养基加入在气液界面培养的极化人鼻上皮（HNE）细胞的基底外侧，于37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。</li>
	<li>24小时后，吸除并弃去培养基，更换为按步骤8.1–8.2配制的新鲜培养基，继续在37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。</li>
</ol>
9. 尤斯灌流室研究
<ol>
	<li>按照先前所述方法9，在电压钳制条件下测量短路电流（Isc）。 
	注意：使用手持式伏特计测量培养物的跨上皮电阻（TEER），仅选用电阻值达到至少 200 Ω·cm2 的培养物进行后续实验。将极化的人鼻上皮（HNE）细胞滤膜安装于尤辛室（Ussing chamber）中，并在电压钳制条件下测定短路电流（Isc）。</li>
</ol>
10. 免疫细胞化学
<ol>
	<li>按照先前所述方法进行免疫检测9。 
	&#8203;注意：CFTR 免疫检测使用抗 CFTR C 末端（24-1）单克隆抗体，以 1/100 稀释度在 4°C 下孵育过夜。在其他滤膜上分别进行 Zona-occludens-1（ZO-1）（1/500 稀释）、α-微管蛋白（alpha-tubulin）（1/300 稀释）、Muc 5AC（1/250 稀释）和角蛋白 8（cytokeratin 8）（1/250 稀释）染色。用含 0.1% Triton X-100 的 PBS 洗涤后，加入与 Alexa 488 或 594 偶联的山羊二抗，在 10% 山羊血清中室温孵育 30 分钟（1/1000 稀释）。最终洗涤后，将滤膜从支撑物上切下，用含 DAPI 的 Vectashield 封片剂封片。使用共聚焦显微镜（63x/1.4 油镜微分干涉相差 λ 蓝色 PL APO 物镜）采集图像，并用 ImageJ 软件进行分析。</li>
</ol>
11. 统计分析
<ol>
	<li>使用适当的软件进行统计分析。 
	注：统计分析使用 S.A.S 软件完成。由于每位患者在每种条件下获得了多个 HNE 滤器，定量参数以每位患者的中位数（± SEM）表示。组间比较（均值 ± 标准差）采用 Wilcoxon 配对符号秩检验或非配对 t 检验进行。</li>
</ol>

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<li>Veit, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+folding+correction+of+F508del+and+rare+CFTR+mutants+by+elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor+%28Trikafta%29+combination%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Allosteric folding correction of F508del and rare CFTR mutants by elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor (Trikafta) combination.</a> JCI Insight. 5 (18), 139983(2020).</li>
<li>Dale, T. P., Borg D'anastasi, E., Haris, M., Forsyth, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rock+Inhibitor+Y-27632+enables+feeder-free%2C+unlimited+expansion+of+Sus+scrofa+domesticus+swine+airway+stem+cells+to+facilitate+respiratory+research%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Rock Inhibitor Y-27632 enables feeder-free, unlimited expansion of Sus scrofa domesticus swine airway stem cells to facilitate respiratory research.</a> Stem Cells International. 2019, 1-15 (2019).</li>
<li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+multiple+class+II+CFTR+mutations+by+elexacaftor%2Btezacaftor%2Bivacaftor+mediated+in+part+by+the+dual+activities+of+elexacaftor+as+both+corrector+and+potentiator%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Rescue of multiple class II CFTR mutations by elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor mediated in part by the dual activities of elexacaftor as both corrector and potentiator.</a> The European Respiratory Journal. 57 (6), 2002774(2021).</li>
<li>Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+inhibitor+improves+survival+of+cryopreserved+serum%2Ffeeder-free+single+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells.</a> Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2008).</li>
<li>Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+primary+cultures+of+human+bronchial+epithelial+cells+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+for+the+pre-clinical+testing+of+CFTR+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators.</a> Methods in Molecular Biology. 741, Clifton, N.J. 39-54 (2011).</li>
<li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+pre-clinical+modulators+developed+for+F508del-CFTR+have+the+potential+to+be+effective+for+ORKAMBI+resistant+processing+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cystic+Fibrosis%22%5BJournal%5D)">Emerging pre-clinical modulators developed for F508del-CFTR have the potential to be effective for ORKAMBI resistant processing mutants.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 20 (1), 106-119 (2021).</li>
</ol>

作者声明本出版物或科学视频制作不存在相关的竞争性经济利益。

已有研究提出，在个体化医学背景下，可使用患者来源的鼻上皮细胞作为人支气管上皮（HBE）细胞的替代模型，用于检测CFTR活性，因为HNE细胞在培养中能够重现原代细胞的特性9,11。与HBE细胞培养相比，HNE细胞的主要优势在于其取材简便且无创。通过HNE细胞培养模型进行短路电流检测，可评估上皮细胞中依赖CFTR的Cl-转运功能，该指标已被证明与通过鼻电位差法在不同基因型患者体内测得的CFTR in vivo 活性存在显著相关性9。此外，HNE细胞经VX-809处理后CFTR活性的恢复程度，也与接受lumacaftor-ivacaftor治疗的F508del纯合子患者的临床结局FEV1改善程度显著相关12。
重要的是，本研究表明，新鲜采集的人鼻上皮（HNE）细胞能够很好地耐受运输和常规 shipping 条件（例如...

囊性纤维化（Cystic Fibrosis, CF）是一种常染色体隐性遗传病，由囊性纤维化跨膜传导调节因子（Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator, CFTR）基因突变引起，导致CFTR蛋白缺失或功能障碍。CFTR是一种位于上皮细胞顶膜的阴离子通道1,2。近年来CFTR靶向治疗取得显著进展，改善了该疾病的预后。最新获批的联合使用CFTR校正剂与CFTR增效剂的药物，显著改善了携带最常见突变p.Phe508del（F508del）的CF患者肺功能和生活质量3,4。尽管治疗前景乐观，仍有约10%的CF患者无法从中获益，因其携带的突变类型无法被现有CFTR调节剂挽救。对于这些患者，亟需测试其他药物或药物组合，以寻找针对特定突变最有效的治疗方案，凸显了个体化治疗的重要性。
人鼻上皮（HNE）细胞可通过简单的无创性鼻腔刷取法轻松获取，并可用于量化环磷酸腺苷（cAMP）介导的氯离子（Cl−）转运，作为评估CFTR功能的指标。HNE细胞能够准确模拟人类气道，但其在体外培养中的寿命有限。得益于培养技术的优化，源自患者的原代HNE细胞可在Rho相关激酶抑制剂（ROCKi）作用下进行条件性重编程，扩增后在微孔滤膜上的气液界面（ALI）条件下分化为假复层上皮5,6。目前存在多种HNE细胞的培养方案（包括商业化培养基、无血清培养基、&#34;自制&#34;培养基、与饲养细胞共培养等），已有研究报道培养基和培养条件的选择会影响细胞的生长、细胞群体的分化以及上皮功能7,8。本文所述方案提供了一种简化的、无需饲养细胞的ROCKi扩增方法，可成功获得大量HNE细胞，并进一步在ALI条件下分化，用于CFTR功能检测。
我们已证明，在分化的HNE细胞中，使用CFTR调节剂处理48小时足以诱导CFTR依赖性Cl⁻电生理功能的纠正- 当前以及所观察到的校正 体外 可能与患者的临床改善相关9因此，HNE细胞不仅适用于基础囊性纤维化（CF）研究，也适用于针对患者特异性CFTR调节剂的临床前研究。在此个体化治疗背景下，本方案旨在验证：在我们培养条件下复苏的囊性纤维化患者来源的冻存HNE细胞，可作为CFTR功能校正研究的合适模型，并且在比较CFTR依赖性氯离子（Cl⁻）电流时能够获得与新鲜细胞相似的实验结果。- 评估了使用双重和三重疗法时不同CFTR调节剂的疗效。

<table><tbody><tr><td>ABBV-2222</td><td>Selleckchem</td><td>S8535</td><td></td></tr><tr><td>ABBV-974</td><td>Selleckchem</td><td>S8698</td><td></td></tr><tr><td>高级 DMEM/F-12</td><td>Life Technologies</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 山羊二抗</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 594 山羊二抗</td><td>Invitrogen</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素 B</td><td>Life Technologies</td><td>15290026</td><td></td></tr><tr><td>抗 α-微管蛋白抗体</td><td>Abcam</td><td>ab80779</td><td></td></tr><tr><td>抗 CFTR 单克隆抗体 (24-1)</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB25031</td><td></td></tr><tr><td>抗细胞角蛋白 8 抗体</td><td>Progen</td><td>61038</td><td></td></tr><tr><td>抗 Muc5AC 抗体</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-20118</td><td></td></tr><tr><td>抗 ZO-1 抗体</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-10804</td><td></td></tr><tr><td>环丙沙星</td><td></td><td>由 Necker 医院药房提供</td><td></td></tr><tr><td>Colimycin</td><td>Sanofi</td><td>由 Necker 医院药房提供</td><td></td></tr><tr><td>IV 型胶原</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>C-7521</td><td></td></tr><tr><td>细胞刷</td><td>Laboratory GYNEAS</td><td>02.104</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>肾上腺素</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>E4375</td><td></td></tr><tr><td>F12 营养混合物</td><td>Life Technologies</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Ferticult</td><td>Fertipro NV</td><td>FLUSH020</td><td></td></tr><tr><td>25 cm² 培养瓶</td><td>Thermo Scientific</td><td>156.367</td><td></td></tr><tr><td>75 cm² 培养瓶</td><td>Thermo Scientific</td><td>156.499</td><td></td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>VWR</td><td>20104.298</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>SLCJ0893</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>I0516</td><td></td></tr><tr><td>Mg&lt;sup&gt;2+ &lt;/sup&gt;和 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;-free DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Life Technologies</td><td>15140130</td><td></td></tr><tr><td>Tazocillin</td><td>Mylan</td><td>由 Necker 医院药房提供</td><td></td></tr><tr><td>Transwell 小室滤膜</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>CLS3470-48EA</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶</td><td>Life Technologies</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>含 DAPI 的 Vectashield 封片剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>VX-445</td><td>Selleckchem</td><td>S8851</td><td></td></tr><tr><td>VX-661</td><td>Selleckchem</td><td>S7059</td><td></td></tr><tr><td>VX-770</td><td>Selleckchem</td><td>S1144</td><td></td></tr><tr><td>VX-809</td><td>Selleckchem</td><td>S1565</td><td></td></tr><tr><td>5% 利多卡因-萘甲唑啉</td><td>Aspen France</td><td>由 Necker 医院药房提供</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleckchem</td><td>S1049</td><td></td></tr></tbody></table>

原代人鼻上皮细胞：精准医学背景下的生物样本库建设

Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine

人鼻上皮（HNE）细胞可通过简单的无创性鼻腔刷取法轻松获取。来源于患者的原代HNE细胞可在气液界面条件下扩增并分化为假复层上皮，用于定量检测环磷酸腺苷介导的氯离子（Cl-）转运，以此作为囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）功能的指标。若关键步骤（如鼻腔刷取的质量以及冻存时的细胞密度）操作得当，HNE细胞可成功实现生物样本库保存。此外，短路电流研究表明，冻融过程不会显著改变HNE细胞的电生理特性及其对CFTR调节剂的反应。在本研究采用的培养条件下，若每支冻存管中冻存的细胞数少于2 × 106个，则失败率极高。我们建议每支冻存管至少冻存3 × 106个细胞。我们发现，将CFTR校正剂与CFTR增效剂联合使用的双重疗法，在F508del纯合突变HNE细胞中对CFTR活性的校正效果相当。而三联疗法VX-445 + VX-661 + VX-770相较于双重疗法VX-809 + VX-770，显著提高了对CFTR活性的校正效果。HNE细胞中CFTR活性的测定是一种有前景的临床前生物标志物，可用于指导CFTR调节剂治疗方案的制定。

在气液界面培养的新鲜HNE细胞经免疫染色评估，表现出极化且分化的呼吸道上皮细胞的典型特征图1）。HNE细胞重新分化为一层异质性的上皮细胞（角蛋白8免疫染色阳性），模拟了 体内 假复层呼吸上皮由纤毛细胞（α-微管蛋白染色阳性）和非纤毛的杯状细胞（Muc5Ac 免疫染色阳性，可产生黏液）组成。整个上皮存在紧密连接（通过 ZO-1，即闭锁小带蛋白-1 染色确认）。在野生型（WT）HNE 细胞中可见明显的顶膜 CFTR 染色，而在 F508del/F508del HNE 细胞中，顶膜及胞质内的 CFTR 染色均减弱。
我们将阳性结果定义为样本不仅成功扩增，而且在气液界面培养3周后成功分化为假复层上皮，并且跨上皮电阻（TEER）高于200 Ω·cm2，从而能够进行短路电流测量。由于仅有少数专业实验室通过短路电流测量开展与CFTR相关的Cl-分泌实验，样本通常需要从医院转运至专门设施。
在78份新鲜的HNE细胞样本中，...

本文介绍了在气液界面条件下原代人鼻上皮（HNE）细胞的分离、扩增与分化方法，以及一种可成功冻存并复苏扩增后HNE细胞的生物样本库保存方案。该方案可分析分化后的HNE细胞的电生理特性，以及在不同调节剂处理下CFTR相关的氯离子分泌功能的纠正情况。

人鼻上皮（HNE）细胞可通过简单的无创鼻腔刷取法轻松采集。来源于患者的原代HNE细胞可被扩增并……

本方案重点介绍了原代鼻上皮细胞的扩增、分化及冷冻保存的关键步骤。在我们的培养条件下，原代鼻上皮细胞可模拟肺上皮组织，从而可利用新鲜或生物库储存的细胞建立患者来源的培养体系，开展个体化医学研究。患者来源的鼻上皮细胞培养物可用于评估CFTR活性，并通过评价患者对新疗法的个体反应来辅助囊性纤维化治疗。演示该实验操作的是本实验室的工程师Aurelie Hatton。首先，在10毫升扩增培养基中培养鼻上皮细胞或HNE细胞。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，将细胞置于75平方厘米的胶原蛋白包被培养瓶中培养，直至细胞融合度达到80%至90%。每48至72小时更换一次培养基。随后，用10毫升无镁无钙的DPBS洗涤细胞。吸出并弃去生理盐水。加入两毫升 0.25% 胰蛋白酶后，将培养瓶放回培养箱中孵育 8 到 12 分钟。随后用手掌用力轻拍培养瓶，以促进细胞脱落。加入10毫升扩增培养基以终止酶促反应。使用10毫升移液器反复吸取和排出扩增培养基，充分冲洗培养瓶表面，以冲洗并解离细胞，并将细胞收集至15毫升离心管中。在4摄氏度条件下，以500 × g离心细胞悬液5分钟，弃去上清液。将沉淀物重悬于5至10毫升扩增培养基中。随后使用血细胞计数板对细胞进行计数。细胞计数后，在4°C条件下以500 × g离心5分钟，弃去上清液。然后将沉淀重悬于富含保护成分的冻存液中，调整细胞浓度至每毫升含3×10⁶至5×10⁶个细胞，并转移至冻存管中。将冻存管置于合适的程序降温冻存容器内，在-80 °C条件下以约每分钟降低1 °C的速率缓慢冷冻细胞。次日，将保存的样本转移至液氮储存容器中，进行长期保存。将新配制的扩增培养基置于设定为 37 摄氏度的水浴中预热。从液氮储存罐中取出冻存管，并迅速放入水浴中，注意不要将整个冻存管浸入水中。当冻存管中仅剩少量冰晶时，立即将其从水浴中取出。用70%酒精擦拭小瓶，并将其置于超净台内。使用1毫升移液器将解冻的细胞转移至15毫升离心管中。然后以逐滴方式加入1毫升预热的扩增培养基。一分钟后，再加入一毫升扩增培养基，静置一分钟。加入10毫升扩增培养基，于4°C、500 × g 离心两分钟。吸除并弃去上清液。将沉淀重悬于适量扩增培养基中，以达到每毫升含1×10⁶个细胞的密度。将细胞接种至含有扩增培养基的25平方厘米胶原包被培养瓶中后，在37°C及5%二氧化碳条件下培养细胞。在进行如前所述的细胞扩增操作前，需肉眼观察细胞生长情况2至3天。将细胞以每0.33平方厘米胶原蛋白包被的多孔滤膜接种3.3 × 10⁵个细胞的密度进行培养，在顶端侧加入300 µL扩增培养基，基底侧加入900 µL气液界面培养基。三天后，吸除顶端培养基，将细胞在气液界面培养基中于气液界面条件下继续培养3至4周，以建立分化的上皮层。每48至72小时更换一次基础培养基。在气液界面培养的原代人鼻上皮细胞表现出极化且分化的呼吸道上皮细胞的典型特征。在78例人鼻上皮细胞样本中，比较了鼻刷取后立即接种与在灌洗液中运输1至7天后接种的培养成功率。最初培养成功的平均百分比为82%，而在取样后0至5天内接种的样本中，成功率达到87%。在新鲜条件下成功分化的样本中，有83%在冻存样本中也成功分化。类似地，在新鲜条件下未能分化的样本中，有71%在冻融条件下同样未成功。此外，每支冻存管中细胞数量在2×10⁶至3×10⁶之间冻存的样本，有50%在解冻后未能生长，而细胞数量低于2×10⁶时，该比例达到80%。对于经DMSO处理的HNE细胞，其短路电流在佛司可林刺激下的变化以及在CFTR抑制剂172作用下的短路电流变化，在新鲜HNE细胞与冻融后HNE细胞之间未观察到显著差异。经药物处理后，两种细胞均表现出显著的功能校正，表现为对佛司可林刺激的短路电流变化增加，以及对CFTR抑制剂172反应的短路电流变化降低。与DMSO处理的HNE细胞相比，双联疗法对CFTR功能的校正效果通过检测佛司可林刺激下和CFTR抑制剂172作用下的短路电流变化进行评估，结果显示VX-809联合VX-770以及VX-661联合VX-770均显著改善了上述两项指标。比较了六名F508del纯合子患者来源的人鼻上皮（HNE）细胞中三种不同的CFTR调节剂治疗效果。当联合使用CFTR校正剂和增效剂（均为Vertex公司的CFTR调节剂）时，两者对佛司科林诱导的短路电流变化以及CFTR抑制剂172诱导的短路电流变化的纠正程度相似。在冻存HNE细胞时，每个冻存管中至少应含有300万个细胞，以提高解冻后获得良好结果的概率。研究表明，HNE细胞中的CFTR活性是评估和调整囊性纤维化个体化治疗方案的良好预测模型。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

原代人鼻上皮细胞:精准医学背景下的生物样本库

本文介绍了一种从大鼠和人类鼻腔中获取嗅黏膜活检样本的方法。这些活检样本可用于识别脑部疾病的分子异常，或分离具有多向分化潜能的成体干细胞，后者可在脑损伤/脑疾病动物模型中用于细胞移植研究。...

从啮齿类动物或人类中分离鼻腔嗅觉干细胞

通过人体志愿者浅表刮取活检获得的鼻上皮细胞，在组织培养插件中进行扩增和转移。当细胞达到汇合状态后，于气液界面培养，从而获得纤毛细胞和非纤毛细胞的培养物。分化的鼻上皮细胞培养物为研究呼吸道黏膜提供了可行的实验模型。...

人鼻上皮细胞在气液界面的培养

本出版物展示了从儿童鼻腔上皮黏膜成功采样和培养的方法，并将这些细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）。...

从儿童鼻腔上皮细胞中进行原代培养并重编程为诱导性多能干细胞

皮肤肿瘤在莫氏显微外科手术后通常会被丢弃。本文介绍了一种方案，可使临床辅助人员在不影响临床操作的情况下，有效处理和储存皮肤肿瘤（例如，鳞状细胞癌、基底细胞癌和黑色素瘤）样本，用于后续的实验室应用。...

建立基于临床的生物样本库

本文介绍一种建立人鼻腔上皮细胞三维球状体培养的方法。通过刺激球状体，诱导其产生囊性纤维化跨膜电导调节因子（CFTR）依赖性的离子和液体分泌，并以球状体管腔大小的变化作为CFTR功能的指标进行定量分析。...

用于个体化囊性纤维化跨膜电导调节因子研究的人鼻上皮细胞球体的生成

本文提供了一项详细的实验方案，用于描述一种 体外...

人鼻上皮类器官的培养与成像

本方案描述了鼻上皮细胞的采集、扩增和分化为类器官型气道上皮细胞模型的过程，并通过活细胞成像和自定义脚本对纤毛摆动频率进行定量分析。...

原代人类鼻上皮细胞模型的采集、扩增与分化及其用于纤毛搏动频率的定量分析

近年来，人类诱导性多能干细胞分化技术的进步使得能够逐步获得特定器官的细胞类型。本文详细介绍了由诱导性多能干细胞衍生的气道基底细胞的维持与扩增步骤，以及在气液界面培养条件下将其分化为黏液纤毛上皮细胞的具体方法。...

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鼻腔上皮是所有呼吸道病原体首先接触的主要屏障部位。本文概述了利用气液界面（ALI）培养的原代鼻腔上皮细胞，以在生理相关系统中表征人类冠状病毒与宿主相互作用的方法。...

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