Name: 使用基于比色细胞的测定法检测针对 AAV 的中和抗体的分步方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: 学习使用基于HT1080细胞的比色测定法检测针对AAV6的中和抗体。该方法成本低廉、操作简便，适用于AAV基因治疗研究中的抗体筛选与中和活性评估。

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本研究由澳大利亚国家健康与医学研究理事会项目资助（JRM 和 CJT，编号 1163732）以及维多利亚州政府运营基础设施支持计划部分资助。SB 获巴克心脏与糖尿病研究所与拉筹伯大学联合博士奖学金支持。KLW 获 Shine On 基金会及澳大利亚心脏基金会未来领袖奖学金（编号 102539）支持。JRM 获澳大利亚国家健康与医学研究理事会高级研究奖学金（编号 1078985）支持。

所有动物护理和实验操作均遵循弗洛里神经科学与心理健康研究所的指南以及《澳大利亚科研用途动物护理与使用规范》，参考文献25。本研究采用1.5至3岁的美利奴母羊。实验方案的示意图见图1。
<img alt="细胞转导抑制实验示意图，显示 HT1080 细胞、稀释方法、孵育、显微镜观察。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63419/63419fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：中和抗体（NAb）检测方案的示意图。（A）NAb 检测的可视化流程图，展示了为期三天的实验方案中的主要步骤。简而言之，细胞在前夜接种并培养过夜；次日，将血清进行系列稀释，与 AAV 混合孵育后，再与细胞共孵育过夜；第三天，细胞经固定、洗涤、与底物孵育后再次孵育，随后进行成像与定量分析。（B）最低信号对照（AAV 完全抑制）、最高信号对照（无抑制）以及一份绵羊血清样本（约 50% 信号抑制）的代表性图像。比例尺 = 0.5 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63419/63419fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
1. 初始准备
<ol>
	<li>用于绵羊的评估：使用8 mL血清分离胶促凝管（见材料表）采集血液，在室温（RT）下静置20–30分钟，随后以2,100 × g 离心15分钟。试管顶部形成的透明上清液即为血清。将透明的水相部分分装至微量离心管中，并在-80 °C下保存。 
	注：在-80 °C下保存的血清可稳定约5年。采血通过颈静脉进行，使用16 G针头（尖端剪除）和注射器从清醒动物中采集。</li>
	<li>将胎牛血清（FBS）置于56 °C水浴中30分钟以进行热灭活，并间歇轻轻摇晃。为确保精确性，在另一个瓶中加入等体积的水并插入温度计，与FBS瓶同时放入水浴中。当温度计显示达到56 °C时开始计时。</li>
	<li>所有在细胞培养超净台中进行的后续操作均应采用正确的无菌技术和细胞培养规范26,27。使用前用70%乙醇喷洒所有物品和超净台表面，操作结束后用1%次氯酸钠清洁。</li>
	<li>通过将高糖（4.5 g/L）DMEM（89%）与热灭活FBS（10%）及青霉素-链霉素溶液（1%）混合，制备完全杜尔伯科改良伊格尔培养基（DMEM）。混合后使用无菌真空过滤系统（孔径0.22 µm，聚醚砜膜）进行过滤（见材料表）。将完全DMEM用铝箔包裹后在4 °C下保存。</li>
	<li>培养HT1080细胞（见材料表），并按照参考文献28所述方法在75 cm2方瓶中传代。建立多个冻存细胞株。细胞传代次数不得超过20代，因过度传代可能影响检测结果。</li>
</ol>
2. 第1天——细胞接种
<ol>
	<li>当 HT1080 细胞融合度达到约 80% 时进行传代。</li>
	<li>将完全 DMEM 培养基（步骤 1.4 中配制）以及 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 和 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）在水浴中预热至 37 °C。使用抽吸系统移除传代细胞的培养基。 
	注意：本实验方案中的所有抽吸操作均使用连接无菌 5 mL 血清移液管的真空系统。</li>
	<li>用 10 mL 预热（37 °C）的 1× PBS 洗涤细胞，然后加入 4 mL 预热的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 消化 3–4 分钟，使细胞从培养瓶表面脱落。</li>
	<li>加入 6 mL 预热的完全 DMEM 培养基以中和胰蛋白酶活性，吹打混匀后将细胞转移至 50 mL 离心管中。使用血细胞计数板和台盼蓝排斥法计算活细胞数量和浓度29。</li>
	<li>将细胞用预热的完全 DMEM 培养基稀释至浓度为 1 × 105 个细胞/mL，每孔加入 100 µL 细胞悬液接种于透明平底 96 孔板中（每孔 1 × 104 个细胞）。将培养板置于 37 °C、5% 二氧化碳（CO2）条件下孵育过夜 16–22 小时。</li>
</ol>
3. 第2天——感染细胞
<ol>
	<li>从培养箱中取出培养板，使用光学显微镜确认细胞在孔内分布均匀，且融合度约为50%。若细胞融合度不在45%–55%范围内，请重复“第1天”操作步骤，并相应调整初始细胞浓度。</li>
	<li>使用预热的完全DMEM作为稀释液，在1.5 mL微量离心管中对目标血清样本进行系列稀释。表1展示了三份重复样本的稀释梯度制备方法。
	<ol>
		<li>为进行三重复实验，通过将病毒储备液用1×PBS稀释，制备浓度为7.5 × 106 拷贝基因组（vg）/µL的工作液（见材料表）。</li>
		<li>向每管含有264 µL血清/培养基稀释液的管中加入66 µL的7.5 × 106 vg/µL病毒工作液（总体积为330 µL/稀释度，见表1）。 
		注意：本实验为稳健性较强的检测，无需完全理想的培养条件。但为了准确定量并确保每次实验结果可靠，必须在所有培养板中设置以下对照：（1）仅含病毒和培养基的对照；（2）仅含培养基的对照；（3）中和抗体阳性对照样本，且所有对照需在相同实验条件下进行。上述体积（330 µL）已包含三份重复样本及血清与病毒混合液额外10%的余量。强烈建议进行重复实验，以准确测定中和活性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用移液器吹打混匀病毒/血清稀释液，将装有病毒/血清混合物的离心管置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育30分钟，以允许潜在的中和反应发生。</li>
	<li>向每孔含有1 × 104 个细胞/孔的96孔板中加入100 µL病毒/血清混合液，每个稀释度对应一孔。 
	注意：此操作将使每孔最终病毒感染复数（MOI）达到15,000病毒颗粒/细胞。表2提供了一个评估样本至1/512稀释度的96孔板示例布局。</li>
	<li>用铝箔包裹含有细胞、血清和AAV-hPLAP的96孔板，置于37 °C、5% CO2培养箱中过夜孵育16–24小时，以允许AAV进入细胞。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>稀释梯度标签</td>
			<td>稀释倍数</td>
			<td>3 × 样本 (240 μL) + 10% 缓冲液体积 (24 μL)</td>
			<td>血清:培养基比例</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>稀释1 (D1)</td>
			<td>1/2</td>
			<td>264 μL 血清 + 264 μL 培养基</td>
			<td>50:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>稀释2 (D2)</td>
			<td>1/4</td>
			<td>264 μL D1 + 264 μL 培养基</td>
			<td>25:75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>稀释3 (D3)</td>
			<td>1/8</td>
			<td>264 μL D2 + 264 μL 培养基</td>
			<td>12.5:87.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>稀释4 (D4)</td>
			<td>1/16</td>
			<td>264 μL D3 + 264 μL 培养基</td>
			<td>6.25:93.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>稀释5 (D5)</td>
			<td>1/32</td>
			<td>264 μL D4 + 264 μL 培养基</td>
			<td>3.13:96.87</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>稀释6 (D6)</td>
			<td>1/64</td>
			<td>264 μL D5 + 264 μL 培养基</td>
			<td>1.56:98.44</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>稀释7 (D7)</td>
			<td>1/128</td>
			<td>264 μL D6 + 264 μL 培养基</td>
			<td>0.78:99.22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>稀释8 (D8)</td>
			<td>1/256</td>
			<td>264 μL D7 + 264 μL 培养基</td>
			<td>0.39:99.61</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>稀释9 (D9)</td>
			<td>1/512</td>
			<td>264 μL D8 + 264 μL 培养基</td>
			<td>0.2:99.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>稀释10 (D10)</td>
			<td>1/2048</td>
			<td>132 μL D9 + 396 μL 培养基</td>
			<td>0.05:99.95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>稀释11 (D11)</td>
			<td>1/8192</td>
			<td>132 μL D10 + 396 μL 培养基</td>
			<td>0.01:99.99</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>稀释12 (D12)</td>
			<td>1/32768</td>
			<td>132 μL D11 + 396 μL 培养基</td>
			<td>0.003:99.997</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：为血清样本进行三份平行的系列稀释所需血清与稀释液体积。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">血清样本 #1</td>
			<td colspan="3">血清样本 #2</td>
			<td colspan="3">血清样本 #3</td>
			<td colspan="3">单克隆抗体（mAB）、对照及额外样本</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
			<td>6</td>
			<td>7</td>
			<td>8</td>
			<td>9</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
			<td>12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A</td>
			<td>1/2</td>
			<td>1/2</td>
			<td>1/2</td>
			<td>1/2</td>
			<td>1/2</td>
			<td>1/2</td>
			<td>1/2</td>
			<td>1/2</td>
			<td>1/2</td>
			<td>50 ng MAb</td>
			<td>50 ng MAb</td>
			<td>50 ng MAb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B</td>
			<td>1/4</td>
			<td>1/4</td>
			<td>1/4</td>
			<td>1/4</td>
			<td>1/4</td>
			<td>1/4</td>
			<td>1/4</td>
			<td>1/4</td>
			<td>1/4</td>
			<td>5 ng MAb</td>
			<td>5 ng MAb</td>
			<td>5 ng MAb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C</td>
			<td>1/8</td>
			<td>1/8</td>
			<td>1/8</td>
			<td>1/8</td>
			<td>1/8</td>
			<td>1/8</td>
			<td>1/8</td>
			<td>1/8</td>
			<td>1/8</td>
			<td>0.5 ng MAb</td>
			<td>0.5 ng MAb</td>
			<td>0.5 ng MAb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D</td>
			<td>1/16</td>
			<td>1/16</td>
			<td>1/16</td>
			<td>1/16</td>
			<td>1/16</td>
			<td>1/16</td>
			<td>1/16</td>
			<td>1/16</td>
			<td>1/16</td>
			<td>MO (-C)</td>
			<td>MO (-C)</td>
			<td>MO (-C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E</td>
			<td>1/32</td>
			<td>1/32</td>
			<td>1/32</td>
			<td>1/32</td>
			<td>1/32</td>
			<td>1/32</td>
			<td>1/32</td>
			<td>1/32</td>
			<td>1/32</td>
			<td>VO (+C)</td>
			<td>VO (+C)</td>
			<td>VO (+C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F</td>
			<td>1/64</td>
			<td>1/64</td>
			<td>1/64</td>
			<td>1/64</td>
			<td>1/64</td>
			<td>1/64</td>
			<td>1/64</td>
			<td>1/64</td>
			<td>1/64</td>
			<td>样本 #1 1/512</td>
			<td>样本 #1 1/512</td>
			<td>样本 #1 1/512</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G</td>
			<td>1/256</td>
			<td>1/256</td>
			<td>1/256</td>
			<td>1/256</td>
			<td>1/256</td>
			<td>1/256</td>
			<td>1/256</td>
			<td>1/256</td>
			<td>1/256</td>
			<td>样本 #2 1/512</td>
			<td>样本 #2 1/512</td>
			<td>样本 #2 1/512</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H</td>
			<td>1/512</td>
			<td>1/512</td>
			<td>1/512</td>
			<td>1/512</td>
			<td>1/512</td>
			<td>1/512</td>
			<td>1/512</td>
			<td>1/512</td>
			<td>1/512</td>
			<td>样本 #3 1/512</td>
			<td>样本 #3 1/512</td>
			<td>样本 #3 1/512</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：用于检测初始血清样本的96孔板布局示例，血清稀释度范围为1/2至1/512。若需检测已知含有AAV中和抗体的样本（给药后样本）或需要更高滴度时，可将更高稀释度纳入检测。MO (-C)：仅培养基对照。VO (+C)：仅病毒和培养基对照。mAb：抗AAV单克隆抗体（中和抗体阳性对照）。
第4步 第3天——固定细胞并添加底物
<ol>
	<li>预热一份1x PBS至 37 °C （约25 mL/96孔板）。分别冷却PBS的等分试样（约25 mL/96孔板）和重蒸馏水2O（去离子水，约25 mL/96孔板）至 4 °C. 将一粒 BCIP/NBT 溶解（参见 材料清单在50 mL锥形离心管中，将样品加入10 mL去离子水中，通过涡旋混合（10 mL足以用于2块96孔板）。</li>
	<li>使用连接于负压吸引系统或通风橱真空装置的移液管，吸取96孔板各孔中的培养基。将移液管管尖轻柔插入孔中，小心吸除培养基，避免扰动已贴壁的细胞。
	<ol>
		<li>添加 50 µL 使用移液器向每孔加入4% PFA固定液，在室温下固定细胞10分钟，并用铝箔包裹培养板。 
		警告：多聚甲醛（PFA）可能具有致癌性，且通过皮肤接触、眼睛接触或吸入均具有毒性。应在通风橱中操作，并佩戴适当的个人防护装备以及面罩。用 PBS 新鲜配制 4% 多聚甲醛溶液（每块 96 孔板约需 7 mL）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 PBS 洗涤并吸除细胞 200 µL 室温下用1×PBS缓冲液重复此步骤两次。 
	注意：多通道移液器是移液步骤的高效选择。</li>
	<li>移液器 200 µL 加入预热的 PBS 溶液至每孔，用铝箔包裹培养板，于 65 °C 孵育90分钟以变性内源性碱性磷酸酶活性30.</li>
	<li>吸弃孔内液体，用缓冲液洗涤细胞 200 µL 的冷（4 °C) PBS。再次吸除液体，用 PBS 洗涤 200 µl 加入冷的双蒸水，再次吸弃。</li>
	<li>移液器 50 µL 将已溶解的BCIP/NBT（按步骤4.1制备）加入每孔中。</li>
	<li>用锡箔纸包裹培养板，在室温下孵育 2–24 小时。 
	注意：各次实验之间的孵育时间应保持一致；时间上的灵活性允许用户在第3天或第4天拍摄孔板图像。</li>
	<li>使用光学显微镜相机，采用4倍物镜对每个孔拍照，确保所有检测均使用相同的曝光、白平衡和光照设置。
	<ol>
		<li>将每个孔的位置保持一致，并确保孔的边缘在照片中不可见。以 TIF 格式或类似格式保存照片。 
		注意：不同显微镜的具体设置会有所差异，但为了获得最佳的定量效果，应确保各孔内的背景光照强度高且均匀一致。图1B).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 使用 ImageJ 定量测定中和活性
<ol>
	<li>下载并安装免费软件“ImageJ”（参见材料表）。</li>
	<li>在 ImageJ 中选择 文件 &gt; 打开，以打开待分析的图像（图2）。</li>
	<li>若使用彩色图像，通过选择 图像 &gt; 类型 &gt; 8位 转换为灰度图像。</li>
	<li>点击 图像 &gt; 调整 &gt; 阈值。调节阈值，直至所有着色区域显示为红色，而背景未被着色。加入 NBT/BCIP 后，着色产物将沉积在表达 hPLAP 的细胞周围区域。 
	注意：建议对同一块板上采集的所有图像使用相同的阈值设置。</li>
	<li>点击 分析 &gt; 设置测量项，勾选 面积、限制于阈值范围、面积分数 和 显示标签 复选框，然后点击 确定。</li>
	<li>为测定某一孔的信号读数（着色百分比），点击 分析 &gt; 测量。弹出窗口中的“% Area”列即显示该信号读数。</li>
	<li>对所有样本重复孔进行定量分析。排除任何污染的孔、细胞分布不均的孔，或细胞密度及光照条件存在差异的孔。 
	​注意：参见 补充图1 了解应排除孔的示例。通常，在一块 96 孔板中可能需要排除 3–4 个孔。图2 直观展示了使用 ImageJ 进行定量分析的过程。</li>
</ol>
<img alt="使用阈值调整和覆盖率结果的图像分析软件步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63419/63419fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：使用 ImageJ 软件测定着色百分比的步骤。（A）使用 ImageJ 软件打开待分析的图像。（B）将图像转换为 8 位灰度图像。（C）打开阈值窗口。（D）调整最大阈值，使所有着色区域被覆盖，但背景区域不被覆盖（该阈值应在整块板上保持一致）。（E）选择“分析”下拉菜单，点击“设置测量”，勾选“面积”、“面积分数”、“限制阈值”和“显示标签”，然后点击“确定”。（F）点击“测量”以测定覆盖面积。% 面积表示图像中着色部分所占的比例。随后可结合对照样品用于确定 TI50 滴度。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63419/63419fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
6. 转导抑制（TI50）效价的测定
<ol>
	<li>确定以下各项的重复样本平均读数（使用步骤5中描述的步骤）：（1）仅培养基对照（基线信号读数）；（2）病毒+仅培养基对照（最大信号读数）；（3）病毒+待测血清样本。</li>
	<li>使用以下公式计算抑制百分比： 
	100 - [（待测样本信号读数（病毒+待测血清样本）- 基线信号读数（仅培养基对照））/（最大信号读数（仅含病毒和培养基）- 基线信号读数） × 100] = 转导抑制率（%）13。</li>
	<li>使用6.2中的公式计算所有样本各稀释度重复样本的转导抑制率（%），并确定各稀释度下所有样本及对照的技术重复之间的平均转导抑制率。</li>
	<li>通过确定能使hPLAP活性的转导抑制率达到50%或更高的最低样本稀释度，计算待测样本的50%转导抑制滴度（TI50滴度）。例如，若某样本在1/8稀释度下的转导抑制率根据6.2步骤计算结果大于50%（而1/4稀释度未达到），则报告该样本的TI50滴度为1/8。</li>
</ol>
7. 中和腺相关病毒颗粒的测定
<ol>
	<li>计算每单位中和的 AAV 粒子数量 µL 通过使用以下公式计算给定样本的血清量： 
	((感染复数 × 每孔细胞数) / (血清体积 / TI稀释倍数))50 滴度)) / 2 = 被中和的 AAV 颗粒 / µL 血清的9. 
	注：除以 2 是为了考虑 TI 的影响50 测量中和颗粒的50%。对于产生TI的样本50 1/4滴度（25%血清，75%稀释液）的检测方法 80 μL 未稀释血清及感染复数（MOI）为15k 接种至 1 × 104 细胞，将使用以下计算：((15000 × 10000) / (80/4)) / 2 = 3.75×106 中和的颗粒 µL 血清的</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本报告描述了一种比色法检测技术，通过评估与腺相关病毒（AAV）转导程度相对应的显色反应，来测定特定血清样本中AAV中和作用的程度。 体外 病毒转导。该实验方案的建立基于碱性磷酸酶与NBT/BCIP之间已知的显色反应，该反应已被广泛用作染色工具，以检测免疫组织化学等应用中的蛋白质靶标，或作为报告工具用于评估病毒转导。24,33,34,35其优势在于操作简便、成本低、耗时短、易于实施，同时仍表现出较高的实验效能。本实验所用的rAAV6（AAV-hPLAP）携带人胎盘碱性磷酸酶（hPLAP）报告基因，并由巨细胞病毒（CMV）启动子驱动表达。34 (补充图2NBT/BCIP 是一种hPLAP底物，最初被碱性磷酸酶去磷酸化，随后依次发生氧化反应形成二聚体，产生一种呈鲜明紫色的不溶性产物。<sup...

腺相关病毒（AAV）正越来越多地被用作基因治疗载体，以开展针对影响心血管、肺部、循环、眼部及中枢神经系统等多种健康状况的治疗试验1,2,3,4,5。AAV载体作为领先的基因治疗平台，其受欢迎程度源于其良好的安全性、长期的外源基因表达能力以及广泛的组织特异性趋向性1,6。动物研究中的成功结果已推动五十多项AAV基因治疗的临床试验成功达到疗效终点7，并促成了美国食品药品监督管理局（FDA）批准的首个商业化AAV基因治疗药物的上市8。在取得初步成功后，AAV作为首选载体在基础研究和临床研究领域持续获得广泛应用，目前也是美国和欧洲唯一获批用于临床的体内基因治疗手段9。然而，针对AAV载体衣壳预先存在的中和抗体（NAbs）仍然是限制临床前研究和临床试验疗效的主要障碍。NAbs在未经暴露的人群和动物群体中普遍存在，可在AAV载体体内给药后抑制基因转导过程1。大多数基因治疗试验将AAV血清学阳性列为排除标准，因此在实验室和临床中，对宿主免疫状态进行初步筛查至关重要。建立一种能够检测抗AAV中和抗体的检测方法，是任何基于AAV基因治疗研究项目流程中的关键步骤。本报告聚焦于AAV6，因其在横纹肌（心脏和骨骼肌）中具有高效且特异的转导能力，引起了研究人员的关注1,10,11,12。基因治疗被认为是一种极具前景的心脏靶向治疗策略，因为在不进行侵入性开胸手术的情况下，很难实现对心脏的特异性靶向。
中和活性通常通过基于细胞的检测方法来确定 体外 或 体内 转导抑制实验 体内 中和抗体检测通常包括将受试者（如人或大型动物）的血清注射到小鼠体内，随后给予携带报告基因的腺相关病毒（AAV），再检测报告基因或相应抗原的表达情况。 体外 通过将人或大型动物的血清或血浆进行连续稀释后，与表达报告基因的重组腺相关病毒（rAAV）共同孵育，以测定中和抗体滴度。将细胞感染血清与病毒的混合物，并与对照组比较，评估报告基因表达受抑制的程度。 体外 由于成本相对较低、检测速度快，以及更易于标准化和验证，此类检测方法被广泛用于中和抗体的筛选13,14 与……相比 体内 检测方法 体内 检测方法通常被认为具有更高的灵敏度15,16，但同样的说法也已被提出关于 体外 检测方法14,17.
迄今为止， 体外 中和抗体检测（NAb）主要采用发光法（荧光素酶）作为报告基因来检测中和作用。尽管基于光信号的方法在多种情况下具有优势，但在某些情况下，比色/显色法中和抗体检测可能更具优势。比色法已成功用于评估其他病毒（如流感病毒和腺病毒）的中和作用。18,19其吸引力源于操作简便、成本较低，且仅需常规实验室设备和工具即可完成20基于发光报告基因的中和抗体检测需要昂贵的底物试剂盒、化学发光仪以及相应的分析软件21该比色法检测的优势在于仅需使用光学显微镜和一种成本极低的底物。关于比色法与发光法检测灵敏度的报道结果存在矛盾。一项研究表明，基于发光的ELISA检测具有更高的灵敏度，且重复性与比色法检测相当22而另一项研究发现，基于比色法的ELISA检测具有更高的灵敏度23. 本文提供了一个详细的方案 体外 利用编码碱性磷酸酶（AP）报告基因的腺相关病毒（AAV）与硝基蓝四氮唑/5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐（NBT/BCIP）底物之间的显色反应，建立了一种针对 AAV 的中和抗体（NAb）检测方法。该逐步操作方案基于先前使用人胎盘碱性磷酸酶（hPLAP）报告基因（AAV6-hPLAP）检测抗 AAV 中和活性的研究报告开发而成。24该检测方法成本低、效率高、易于操作，且对技术要求、实验设备和试剂的需求极少。此外，由于该检测方法操作简便，具有优化后广泛应用于不同类型细胞、组织或病毒血清型的潜力。

<table><tbody><tr><td>0.05% 胰蛋白酶/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 锥形离心管</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2 &lt;/sup&gt;方形培养瓶</td><td>Falcon</td><td>353136</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>96孔平底板</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>AAV6-CMV-hPLAP 载体</td><td></td><td></td><td>肌肉研究 &amp;amp; 治疗学实验室（澳大利亚墨尔本大学）可根据要求提供 AAV6-CMV-hPLAP。</td></tr><tr><td>铝箔</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗完整AAV6小鼠单克隆抗体（ADK6）</td><td>PROGEN</td><td>610159</td><td>阳性对照单克隆抗体</td></tr><tr><td>BCIP/NBT</td><td>SIGMAFAST</td><td>B5655</td><td></td></tr><tr><td>细胞和组织培养安全柜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>电子移液器</td><td></td><td></td><td>5 &amp;和10 mL移液管吸头</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）</td><td>Gibco</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>HT1080 细胞</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td></td><td></td><td>免费提供：https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>培养箱</td><td></td><td></td><td>37 &amp;deg;C，5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>带摄像头的光学显微镜</td><td></td><td></td><td>能够使用4倍物镜拍摄照片</td></tr><tr><td>烘箱</td><td></td><td></td><td>对于65 &amp;deg;C孵育</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>MERCK</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器和吸头</td><td></td><td></td><td>20 &amp;mu;L, 200 &amp;mu;L &amp;和1 mL单通道移液器及吸头 &amp;和 200 &amp;mu;多通道移液器</td></tr><tr><td>Stericup 快速释放滤器</td><td>Millipore</td><td>S2GPU10RE</td><td>用于混合培养基试剂</td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>VACUETTE 真空采血管 8 ml CAT 血清分离促凝管</td><td>Greiner BIO-ONE</td><td>455071</td><td>用于血清采集 &amp;和绵羊样品的处理</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

使用比色法细胞检测技术检测抗aav中和抗体的逐步操作方法

A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay

重组腺相关病毒（rAAV）已被证明是在实验室和临床环境中安全有效地递送遗传物质以治疗多种健康状况的载体。然而，针对AAV衣壳的预存中和抗体（NAbs）对在大型动物实验模型和人类群体中成功实施基因治疗构成了持续挑战。为确保以AAV为基础的基因疗法作为研究工具和具有临床可行性的治疗手段的有效性，有必要对宿主针对AAV的免疫反应进行初步筛查。本方案描述了一种比色法 体外 检测针对腺相关病毒6型（AAV6）的中和因子的检测方法。该检测利用编码碱性磷酸酶（AP）报告基因的AAV与其底物NBT/BCIP之间的反应，两者结合后可产生不溶性、可定量的紫色沉淀。 
在本实验方案中，将血清样本与表达碱性磷酸酶（AP）的腺相关病毒（AAV）混合，并进行孵育，以允许潜在的中和活性发生。随后将病毒-血清混合物加入细胞中，使未被中和的AAV进行病毒感染和转导。加入NBT/BCIP底物后发生显色反应，其显色程度对应于病毒转导及中和活性。通过一款免费软件工具对显色面积比例进行定量分析，从而计算出中和滴度。该检测方法的显色程度与病毒浓度之间表现出强烈的正相关性。对绵羊在给予重组AAV6前后采集的血清样本进行检测，结果显示中和活性显著升高（从125倍增至&gt;10,000倍）。该方法具有足够的灵敏度，可检测到稀释至&gt;1:32,000血清样本中的中和活性。本检测提供了一种简单、快速且经济有效的方法，用于检测针对AAV的中和抗体（NAbs）。

用于确定最佳病毒剂量以实现孔板覆盖的转导实验 
本实验选用 HT1080 细胞，这是一种广泛使用的纤维肉瘤细胞系。以每孔 1 × 104 个 HT1080 细胞的浓度接种，可在 96 孔板的每个孔中实现约 50% 的细胞汇合度。为确定实验所需的最佳病毒浓度，使用编码 hPLAP（人胎盘碱性磷酸酶）报告基因的重组腺相关病毒（AAV6-hPLAP）31，在每个孔中以不同病毒基因组颗粒数与细胞数之比（MOI：0、150、500、1500、5000、15000、50000 和 150000）进行三复孔处理（图 3A）。结果显示，MOI 为 15000（每孔 1.5 × 108 vg）时，孔板显色率达到 36%，被选定为最佳病毒剂量。在 MOI 0 至 15000 范围内，显色程度与病毒浓度之间呈现显著正相关（n = 6，r = 0.995，P&lt;0.001）。该浓度可在中和抗体（NAbs）高浓度存在下（孔板显色较弱）...

本文描述了一种全面的实验室方案和分析流程，用于快速、经济且简便的比色法细胞检测，以检测针对AAV6的中和成分。

使用比色法细胞检测技术检测抗AAV中和抗体的逐步操作方法

重组腺相关病毒（rAAV）已被证实是一种安全且有效的基因转移载体，可用于治疗多种健康问题……

预先存在的中和 AAV 的抗体是 AAV 基因治疗发展的一大障碍。本实验是一种用于检测抗 AAV 中和抗体的筛选工具。其主要优势在于成本低、耗时短、操作简便，且对技术人员技能要求低，所需实验设备和试剂较少。第一天开始接种HT1080细胞，将细胞用预热的完全DMEM培养基稀释至浓度为每毫升1 × 10⁵个细胞。然后每孔加入100 µL细胞悬液至透明的96孔平底板中，使每孔细胞浓度为1 × 10⁴个细胞。将培养板置于37°C、5% CO₂条件下孵育过夜，孵育时间为16至22小时。第二天，在1.5毫升微量离心管中使用预热的完全DMEM对目标血清样本进行连续稀释。向每管稀释后的血清样本中加入66微升浓度为7.5×10⁶ 拷贝/微升的病毒工作液。通过移液混匀病毒与血清的稀释液，然后将含有病毒-血清混合物的离心管置于37°C、含5%二氧化碳的培养箱中孵育30分钟，以使可能的中和反应发生。30分钟后，用移液器将100微升病毒血清混合物加入含有每孔1×10⁴个细胞的96孔板的每个孔中，然后用铝箔包裹该板，置于37°C、5%二氧化碳培养箱中过夜孵育16至24小时。第三天，在不破坏贴壁细胞的前提下，使用通风橱中的真空泵吸去96孔板各孔中的培养基，并向每个孔中加入50微升4%多聚甲醛。用铝箔包裹该板后，在室温下静置10分钟。随后，用 200 微升 PBS 在室温下洗涤并抽吸细胞两次。第二次洗涤后，向每孔中加入 200 微升预热的 PBS，用铝箔包裹培养板，于 65 摄氏度孵育 90 分钟，以变性内源性碱性磷酸酶活性；随后，向每孔中加入 50 微升 freshly prepared 溶解的 BCIP/NBT，将包裹好的培养板在室温下避光孵育 2 至 24 小时。之后，使用光学显微镜相机的 4X 物镜拍摄每孔的照片，确保所有检测均采用一致的曝光、白平衡和光照设置。要在 ImageJ 中分析图像，请选择文件并点击打开。对于彩色图像，依次选择图像、类型和 8 位选项，将其转换为灰度图像。然后转到图像选项卡，选择调整和阈值，调整阈值直至所有着色区域显示为红色，而背景不受影响。单击“分析”（Analyze），选择“设置测量值”（Set Measurements），勾选“面积”（Area）、“面积分数”（Area fraction）、“限定于阈值”（Limit to threshold）和“显示标签”（Display label）的复选框，然后点击“确定”（OK）。要确定某个孔的信号读数，请单击“分析”（Analyze）并选择“测量”（Measure），此时弹出窗口中的“百分比面积”（percent area）列将显示该信号读数。本研究通过在细胞中以不同浓度的病毒基因组添加AAV6-hPLAP报告基因，确定了最佳病毒感染剂量。感染复数（multiplicity of infection）为15,000时，可实现36%的孔板着色率，因此被选定为最佳病毒感染剂量。代表性分析展示了着色程度与感染倍数之间的相关性。获得的是不影响着色程度与病毒浓度之间线性关系的最高测试浓度。在对针对腺相关病毒或AAV6的抗AAV6单克隆抗体进行的中和活性研究中，当以10倍对数稀释时，该抗体在浓度为每毫升10纳克时可实现对AAV6转导的50%抑制，即TI50。在中和抗体（NAb）检测中，不同初治样本群体对AAV的中和程度存在差异，TI50滴度值范围为1/2至1/80。检测结果显示，在给予AAV前，AAV抑制的TI50滴度值范围为1/4至1/80。给予AAV后，TI50滴度升高至1/2000至高于1/32,000的水平，显示出给药前后TI50滴度值的显著差异。拍摄孔板时，重要的是在整个实验过程中始终使用相同的显微镜设置，并确保照片拍摄位置位于孔板正中心。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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在本视频中，我们演示了一种 体外...

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定量微量中和试验的优化

流感中和抗体与预防流感感染的保护作用相关。微量中和试验用于检测人血清中的中和抗体，常用于流感的人体血清学研究。本文描述了一种使用MDCK-SIAT1细胞的微量中和试验，用于检测流感疫苗接种或感染后针对当前流行的3C.2a和3C.3a...

利用MDCK-SIAT1细胞通过微量中和试验测定人血清中针对A(H3N2)流感病毒的中和抗体反应

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本方案介绍了一种快速且有效的检测方法，通过评估恢复期血清样本抑制携带刺突糖蛋白的增强型绿色荧光蛋白标记的水疱性口炎病毒假病毒入侵的能力，来测定针对SARS-CoV-2刺突蛋白的中和抗体水平。...

利用高通量荧光成像检测SARS-CoV-2中和抗体的假病毒侵染

本文描述了一种利用优化的肝素亲和层析方法制备和纯化腺相关病毒载体的详细方案。该方法简单、可放大且成本低廉，无需超速离心步骤。所获得的病毒载体具有高纯度和高生物活性，适用于临床前研究。...

通过单步半自动化肝素亲和层析方案分离腺相关病毒载体

随着基因治疗领域不断发展，人们日益需要创新的方法来应对这些挑战。本文介绍了一种独特的方法，该方法利用细胞工厂平台简化了高产率、高纯度腺相关病毒（AAV）载体的制备流程，可满足临床级质量标准 体内...

利用细胞工厂平台制备高滴度、高质量腺相关病毒载体的简化与标准化流程

学习使用基于HT1080细胞的比色测定法检测针对AAV6的中和抗体。该方法成本低廉、操作简便，适用于AAV基因治疗研究中的抗体筛选与中和活性评估。

使用比色法细胞检测技术检测抗AAV中和抗体的逐步操作方法

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