使用比色法细胞检测技术检测抗AAV中和抗体的逐步操作方法

预先存在的中和 AAV 的抗体是 AAV 基因治疗发展的一大障碍。本实验是一种用于检测抗 AAV 中和抗体的筛选工具。其主要优势在于成本低、耗时短、操作简便，且对技术人员技能要求低，所需实验设备和试剂较少。

第一天开始接种HT1080细胞，将细胞用预热的完全DMEM培养基稀释至浓度为每毫升1 × 10⁵个细胞。然后每孔加入100 µL细胞悬液至透明的96孔平底板中，使每孔细胞浓度为1 × 10⁴个细胞。将培养板置于37°C、5% CO₂条件下孵育过夜，孵育时间为16至22小时。

第二天，在1.5毫升微量离心管中使用预热的完全DMEM对目标血清样本进行连续稀释。向每管稀释后的血清样本中加入66微升浓度为7.5×10⁶ 拷贝/微升的病毒工作液。通过移液混匀病毒与血清的稀释液，然后将含有病毒-血清混合物的离心管置于37°C、含5%二氧化碳的培养箱中孵育30分钟，以使可能的中和反应发生。

30分钟后，用移液器将100微升病毒血清混合物加入含有每孔1×10⁴个细胞的96孔板的每个孔中，然后用铝箔包裹该板，置于37°C、5%二氧化碳培养箱中过夜孵育16至24小时。第三天，在不破坏贴壁细胞的前提下，使用通风橱中的真空泵吸去96孔板各孔中的培养基，并向每个孔中加入50微升4%多聚甲醛。用铝箔包裹该板后，在室温下静置10分钟。

随后，用 200 微升 PBS 在室温下洗涤并抽吸细胞两次。第二次洗涤后，向每孔中加入 200 微升预热的 PBS，用铝箔包裹培养板，于 65 摄氏度孵育 90 分钟，以变性内源性碱性磷酸酶活性；随后，向每孔中加入 50 微升 freshly prepared 溶解的 BCIP/NBT，将包裹好的培养板在室温下避光孵育 2 至 24 小时。之后，使用光学显微镜相机的 4X 物镜拍摄每孔的照片，确保所有检测均采用一致的曝光、白平衡和光照设置。

要在 ImageJ 中分析图像，请选择文件并点击打开。对于彩色图像，依次选择图像、类型和 8 位选项，将其转换为灰度图像。然后转到图像选项卡，选择调整和阈值，调整阈值直至所有着色区域显示为红色，而背景不受影响。

单击“分析”（Analyze），选择“设置测量值”（Set Measurements），勾选“面积”（Area）、“面积分数”（Area fraction）、“限定于阈值”（Limit to threshold）和“显示标签”（Display label）的复选框，然后点击“确定”（OK）。要确定某个孔的信号读数，请单击“分析”（Analyze）并选择“测量”（Measure），此时弹出窗口中的“百分比面积”（percent area）列将显示该信号读数。本研究通过在细胞中以不同浓度的病毒基因组添加AAV6-hPLAP报告基因，确定了最佳病毒感染剂量。感染复数（multiplicity of infection）为15,000时，可实现36%的孔板着色率，因此被选定为最佳病毒感染剂量。

代表性分析展示了着色程度与感染倍数之间的相关性。获得的是不影响着色程度与病毒浓度之间线性关系的最高测试浓度。在对针对腺相关病毒或AAV6的抗AAV6单克隆抗体进行的中和活性研究中，当以10倍对数稀释时，该抗体在浓度为每毫升10纳克时可实现对AAV6转导的50%抑制，即TI50。

在中和抗体（NAb）检测中，不同初治样本群体对AAV的中和程度存在差异，TI50滴度值范围为1/2至1/80。检测结果显示，在给予AAV前，AAV抑制的TI50滴度值范围为1/4至1/80。给予AAV后，TI50滴度升高至1/2000至高于1/32,000的水平，显示出给药前后TI50滴度值的显著差异。

拍摄孔板时，重要的是在整个实验过程中始终使用相同的显微镜设置，并确保照片拍摄位置位于孔板正中心。