Name: 光学相干断层扫描在视网膜病变小鼠模型中的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 学习使用光学相干断层扫描技术对小鼠视网膜病变进行非侵入性成像诊断。该方法可实现高分辨率实时断层扫描，定量测量视网膜厚度并识别病变特征，为神经科学与眼科研究提供重要工具。

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项目来源：广东省自然科学基金（2018A0303130306）。作者感谢汕头大学与香港中文大学联合汕头国际眼科中心眼科研究实验室提供的经费和材料支持。

操作遵循视觉与眼科研究协会（ARVO）关于动物在眼科与视觉研究中使用的声明。实验设计已获机构动物伦理委员会（JSIEC 医学伦理委员会，EC 20171213(4)-P01）批准。本研究使用了两个月大的 C57BL/6J 小鼠和 Vldlr 基因敲除小鼠，每组各 7 只，均为雌性，体重为 20 g 至 24 g。
1. 实验条件
<ol>
	<li>将小鼠分为两组：实验组为 Vldlr 基因敲除小鼠，对照组为 C57BL/6J 小鼠。</li>
	<li>常规喂食小鼠食物和水。</li>
	<li>在动物实验室中，将小鼠饲养于温度稳定（22 °C）、湿度（50–60%）、光暗循环（12 小时–12 小时）和光照强度（350–400 lux）恒定的环境中。</li>
	<li>准备实验设备：用于小动物的光学相干断层扫描联合共焦扫描激光检眼镜（cSLO）系统（图 1A）。</li>
	<li>准备实验所需的所有材料（图 1B），并称量小鼠体重（图 1C）。</li>
</ol>
2. 信息记录
<ol>
	<li>记录信息：分组、编号、出生日期、年龄、性别、体重和麻醉剂量。</li>
</ol>
3. 仪器启动与测试
<ol>
	<li>打开计算机并启动软件。</li>
	<li>点击 测试程序 按钮以完成测试程序。</li>
	<li>打开恒温器，并将其预热至 37 °C。</li>
	<li>程序测试完成后，启动 OCT 模块 操作。</li>
	<li>创建新的受试对象，并填写小鼠信息。</li>
	<li>预热电热毯，并用手术巾覆盖。</li>
</ol>
4. 麻醉
<ol>
	<li>使用含有替来他明（Tiletamine）和唑拉西泮（Zolazepam）的冻干麻醉剂粉末配制麻醉混合液。 
	注意：麻醉剂的选择、剂量和给药途径应遵循当地动物伦理委员会的建议。应选用能够使动物保持至少1小时不动且痛觉消失、并在之后迅速恢复的麻醉剂。剂量应根据实验时长、动物体重及其他因素确定。</li>
	<li>使用配制好的麻醉混合液对动物进行麻醉。在整个操作过程中直至动物恢复期间，均应确保其体温维持。</li>
</ol>
5. 散瞳滴眼液的应用
<ol>
	<li>通过抓握小鼠颈背部皮肤进行手动固定，使眼球轻微突出，并旋转小鼠头部，使一侧眼睛朝上。</li>
	<li>滴散瞳药水以扩大瞳孔（图 2A）。</li>
	<li>10 分钟后检查瞳孔是否已散大。</li>
</ol>
6. 小鼠的放置
<ol>
	<li>将小鼠放置在电热毯平台上。</li>
	<li>用医用透明质酸钠凝胶涂抹双眼（图2B）。</li>
	<li>在cSLO设备上安装60 D双球面镜头（预设镜头）（图1A-5, 6）。</li>
	<li>将100 D接触镜置于小鼠角膜上，凹面接触角膜表面的透明质酸钠凝胶（图2C, D 和 图3A-II）。</li>
	<li>将小鼠放置在小型恒温动物平台上，并使眼睛距离cSLO设备镜头1-2 mm（图3A）。</li>
	<li>使用镊子调整接触镜的角度，使瞳孔位于镜头中心。</li>
	<li>微调头部位置，使眼睛正对前方。</li>
</ol>
7. 共焦扫描激光检眼镜（cSLO）
<ol>
	<li>点击 OCT 按钮，选择 小鼠 模块，启动 cSLO 程序（图 4B）。</li>
	<li>选择 红外 模式（光源：红光），并调节参数（范围：2047，图 4D）。</li>
	<li>选择待检查的眼（右眼：图 4C-1；左眼：图 4C-2）。</li>
	<li>控制操纵杆，缓慢将预设镜头移向接触镜。</li>
	<li>调节屈光度值，直至后极部成像清晰（图 4E）。</li>
	<li>进一步调整，使视网膜后极部图像对齐，并以视神经乳头为中心。</li>
</ol>
8. 光学相干断层扫描（OCT）
<ol>
	<li>启动OCT程序（图4G）。</li>
	<li>上下点击进度条，直至OCT图像出现（图4H）。</li>
	<li>调整参数：Range Min（图4I）= 0–20，Range Max（图4J）= 40–60。</li>
	<li>调整预设镜头距离和位置方向，直至获得理想的OCT图像。</li>
	<li>通过移动cSLO中的标准线来选择扫描位置（图4M）。</li>
	<li>从视神经乳头开始进行扫描。</li>
	<li>对每只眼睛按相同顺序采集图像：水平线：视神经乳头 → 上方 → 下方；垂直线：视神经乳头 → 鼻侧 → 颞侧。</li>
	<li>从四个方向采集图像。</li>
	<li>点击 Average 以叠加cSLO与OCT图像信号（图4F 和 图4O）。</li>
	<li>点击 shot 按钮以获取SLO-OCT图像（图4P）。</li>
	<li>保存并导出所有图像（图4Q、R）。</li>
</ol>
9. 实验结束（OCT 检查后）
<ol>
	<li>将小鼠放置在电热毯上以保持其体温，直至苏醒。 
	注意：应持续监测小鼠，直至其恢复足够的意识以维持胸卧位。术后应尽量避免暴露于强光下。</li>
	<li>取下100 D的接触镜。</li>
	<li>涂抹左氧氟沙星眼用凝胶以保护角膜。</li>
	<li>待小鼠苏醒后将其放回笼中。 
	注意：确保受检小鼠在完全恢复之前不与其他小鼠合笼。</li>
	<li>关闭软件并关闭计算机。</li>
	<li>用水清洁100 D接触镜，并将镜片擦干。</li>
	<li>清洁并消毒环境。</li>
</ol>
10. 图像分析
<ol>
	<li>比较 Vldlr 基因敲除小鼠与 C57BL/6J 小鼠的 OCT 图像。</li>
	<li>观察多个位置：通过视乳头的垂直和水平扫描；上方、下方、鼻侧和颞侧扫描；以及异常反射部位的扫描。</li>
	<li>观察每张图像中视网膜的厚度、形态、层次结构及异常反射性病灶，以及视网膜的玻璃体界面和玻璃体本身。</li>
	<li>记录病灶的位置、特征和数量。</li>
</ol>
11. 视网膜分层校正
<ol>
	<li>在 OCT 界面上点击加载检查（图 5A）。</li>
	<li>在弹出窗口中调出小鼠的 OCT 图像。</li>
	<li>选择图像：通过视乳头的 OCT 图像，可为横向或纵向扫描。</li>
	<li>在媒体容器中双击图像，将其显示在屏幕上（图 5C）。</li>
	<li>点击层检测，完成视网膜的自动分层（图 5D）。</li>
	<li>选择待分析层次两侧的分界线（图 6D-10）。</li>
	<li>选择一条独立的分界线（图 6B-6），点击编辑层（图 6A-1），当出现红色圆圈时激活该线（图 6B-7）。</li>
	<li>调整间距 （图 6A-4，例如 50）和限制范围（图 6A-5，例如 50）。</li>
	<li>通过移动红色圆圈来修改分界线（比较图 6B和图 6C中的绿色分界线；图 6C显示修改后的结果）。</li>
</ol>
12. 视网膜层状结构厚度
<ol>
	<li>单击 测量标记 按钮（图6D-9).</li>
	<li>选择待分析层的分界线（例如，在外核层中，选择第4条分界线）th 和 5th 在列表中划分线以在OCT图像上显示该层的边界图6D-10).</li>
	<li>选择 连接至图层 (图6D-11）和 保持联系，随时移动 (图6D-12).</li>
	<li>选择要显示结果的区域（所选列将被着色）， 图6D-13).</li>
	<li>在 OCT 图像上点击待分析位置，使测量线显现（垂直于横轴，且颜色与结果区域一致）图6D-14).</li>
	<li>单击下一列以进行下一次测量，并显示先前的数据（图6E-15).</li>
	<li>阅读 垂直方向 测量位置的值（厚度）在 长度在 &#181;m（组织） 行图6E红色矩形).</li>
	<li>点击 删除标记 (图6E-16）和 新标记物 (图 6E-17）以重新测试，使结果能够覆盖原始数据（如需重新测量）。</li>
	<li>新闻 打印屏幕 在键盘上按以保存截图，或单击 保存检查 直接保存图5H).</li>
	<li>将数据输入电子表格或统计软件进行统计分析。</li>
</ol>
13. 全层视网膜厚度的测量
<ol>
	<li>在右上角的列表中选择线1（ILM，内界膜，图7B）和线7（OS-RPE，OS：外光感受器节段；RPE：视网膜色素上皮层，图7C）。 
	注：全层视网膜厚度是指视网膜神经上皮层的厚度，即OCT图像中ILM与OS-RPE之间的视网膜部分。</li>
	<li>在视乳头两侧以特定间隔测量视网膜厚度。
	<ol>
		<li>例如：从视乳头边缘出现视网膜结构处开始，使用水平标尺以200 µm间距测量4个数值（图7G、H）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将所有测量值记录在电子表格中。</li>
	<li>对两组中每个对应位置的测量值，分别使用多个t检验（每行一个）进行比较。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在潜在的利益冲突。

本研究采用小动物视网膜成像系统进行光学相干断层扫描（OCT）成像，以评估视网膜的变化 Vldlr 敲除小鼠表现出不完全的后玻璃体脱离、视网膜下新生血管形成以及视网膜变薄。OCT 是一种非侵入性成像方法，用于检查视网膜状况。 体内大多数OCT设备专为人类眼部检查而设计，其硬件尺寸、焦距设置、系统参数设定以及受检者的定位要求均基于人眼特征。使用专为人眼设计的OCT设备检查小型动物时，需对镜头和系统设置进行相应调整。本文介绍了适用于小型动物的OCT检查流程。
在对眼球大小不同的不同小型动物进行成像扫描时，焦距各不相同。这种焦距差异至关重要，必须予以解决，才能获得清晰且准确的眼底图像。一种有效的方法是更换物镜，使用不同曲率的透镜。由于小鼠的眼球较小，除光学相干断层扫描（OCT）设备预设的60 D双球面透镜外，还需在角膜前加装100 D的接触透镜。
OCT 只能提供线性扫描，覆盖视网膜的范围有限。因此，为了对不同组别的 OCT 结果进行定性和定量比较，必须对 OCT 扫描的方案进行标准化。本研究中进行...

光学相干断层扫描（optical coherence tomography, OCT）是一种成像技术，可对组织进行in vivo高分辨率横断面成像1,2,3,4,5,6,7,8，尤其适用于视网膜的无创检查9,10,11,12。该技术还可用于定量一些重要的生物标志物，例如视网膜厚度和视网膜神经纤维层厚度。OCT的原理是光学相干反射测量法，通过检测样品反射光的相干性获取组织的横断面信息，并经由计算机系统将其转化为图像或数字形式7。在眼科临床中，OCT被广泛用作诊断、随访和管理视网膜疾病患者的重要工具，同时也有助于深入了解视网膜疾病的发病机制。
除了临床应用外，OCT 还被用于动物研究。尽管病理学是形态学表征的金标准，但 OCT 具有无创 体内 成像和纵向随访的优势。此外，已有研究表明，在视网膜病变动物模型中，OCT 结果与组织病理学具有良好的相关性11,13,14,15,16,17,18,19,20。小鼠是生物医学研究中最常用的动物，但其眼球较小，给小鼠 OCT 成像带来了技术上的挑战。
与最初用于小鼠视网膜成像的光学相干断层扫描技术21,22相比，小动物用OCT在硬件和软件系统方面现已得到优化。例如，结合追踪器的OCT可显著降低信噪比；OCT软件系统的升级使得更多视网膜层次能够被自动识别；集成的DLP投影仪有助于减少运动伪影。
极低密度脂蛋白受体（Vldlr）是内皮细胞中的一种跨膜蛋白，表达于视网膜血管内皮细胞、视网膜色素上皮细胞以及外界膜周围23,24。视网膜下新生血管形成是Vldlr基因敲除小鼠的表型23。因此，Vldlr基因敲除小鼠被用于研究视网膜下新生血管形成的发病机制及潜在治疗方法。本文展示了光学相干断层扫描（OCT）成像技术在检测Vldlr基因敲除小鼠视网膜病变中的应用，旨在为小型动物模型中的视网膜病变研究提供一定的技术参考。

<table><tbody><tr><td>100-Dpt 接触镜</td><td>Volk Optical,Inc, Mentor, OH</td><td></td><td>RETImap 的附件</td></tr><tr><td>双非球面 60-Dpt 玻璃镜片</td><td>Volk Optical,Inc, Mentor, OH</td><td></td><td>RETImap 的附件</td></tr><tr><td>电热毯</td><td>POPOCOLA</td><td>CW-DRT-01</td><td>50 x 35 cm</td></tr><tr><td>注射器（1 mL）</td><td>Kaile</td><td></td><td>0.45 x 16RWLB</td></tr><tr><td>盐酸左氧氟沙星眼用凝胶</td><td>EBE PHARMACEUTICAL Co.LTD</td><td></td><td>5 g: 0.015 g</td></tr><tr><td>医用透明质酸钠凝胶</td><td>Alcon</td><td>16H01E</td><td></td></tr><tr><td>微量注射器</td><td>上海高鸽工贸有限公司</td><td>Q31/0113000236C001-2017</td><td>50 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>聚维酮碘溶液</td><td>广东美华制药有限公司</td><td></td><td>100 mL</td></tr><tr><td>RETImap</td><td>ROLAND CONSULT</td><td>19-99_50-2.1_1.2E</td><td>cSLO/ERG/VEP/FA/OCT/GFP</td></tr><tr><td>小动物耳钉</td><td>OSMO POCKET OT110</td><td>INS1005-1S</td><td></td></tr><tr><td>复方托吡卡胺滴眼液</td><td>参天制药株式会社</td><td></td><td>5 mg/mL</td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>Sigma</td><td>X1251-5G</td><td>5 g</td></tr><tr><td>Zoletil 50</td><td>Virbac.S.A</td><td>7FRPA</td><td>Tiletamine 125 mg + Zolazepam 125 mg</td></tr></tbody></table>

光学相干断层扫描在小鼠视网膜病变模型中的应用

Application of Optical Coherence Tomography to a Mouse Model of Retinopathy

光学相干断层扫描（OCT）为视网膜病变的诊断提供了一种无创方法。OCT设备能够获取视网膜的横截面图像，并据此计算视网膜厚度。尽管OCT在临床实践中已广泛应用，但其在基础研究中的应用尚不普遍，尤其是在小动物（如小鼠）中。由于小鼠眼球体积较小，对其进行眼底成像检查具有较大挑战性。因此，需要专门的视网膜成像系统以适应小动物的OCT成像需求。本文介绍了一种专用于小动物的OCT检查系统及详细的图像分析方法。文中展示了极低密度脂蛋白受体（Vldlr）基因敲除小鼠与C57BL/6J小鼠的视网膜OCT检查结果。C57BL/6J小鼠的OCT图像显示了清晰的视网膜层次结构，而Vldlr基因敲除小鼠则表现出视网膜下新生血管形成及视网膜变薄。综上所述，OCT检查有助于在小鼠模型中实现对视网膜病变的无创检测与定量分析。

得益于OCT的高分辨率扫描，可以观察到小鼠视网膜的各层结构，并识别异常反射及其确切位置。本研究比较了Vldlr基因敲除小鼠与C57BL/6J小鼠的视网膜OCT图像。所有C57BL/6J小鼠的OCT图像均显示出具有不同反射特性的多种视网膜层次，分界清晰（图8D）。相比之下，所有Vldlr基因敲除小鼠的OCT图像均显示出异常的高反射病灶（图8B）。
不完全玻璃体后脱离（PVD）在 Vldlr 基因敲除小鼠
Vldlr 基因敲除小鼠的OCT结果显示视网膜表面存在一些中等反射性条带（图8B，红色箭头）。这些中等反射性条带附着于视网膜血管（图8B<...

此处，我们描述了一种 体内 利用光学相干断层扫描技术对小鼠视网膜病变进行诊断及定量测量的成像方法

光学相干断层扫描（OCT）为视网膜病变的诊断提供了一种无创方法。OCT设备可获取视网膜的横截面图像……

光学相干断层扫描广泛用于不同视网膜疾病的临床诊断，但在小鼠模型中的应用仍具挑战性。本方案描述了如何在动物中实施OCT技术。该技术可应用于眼球大小不同的动物。它能够实现无创、高分辨率和实时的视网膜横断面成像，并可对视网膜厚度进行定量测量。光学相干断层扫描（OCT）通过识别病变的位置、范围、形状和大小等特征，以及所有可疑的视网膜异常（如视网膜新生血管），辅助视网膜病变的诊断。该方案适用于动物研究或眼底疾病，包括视网膜疾病。开始操作前，应做好准备并逐步遵循实验方案。在动物麻醉状态下进行实验。经过一定练习后，应能够获得高质量的OCT图像。首先，打开计算机并启动软件。点击测试程序按钮以完成测试程序。然后，打开恒温器并将其预热至 37 摄氏度。程序测试完成后，启动OCT模块操作。创建新受试对象并填写小鼠信息。然后，预热电热毯并用手术巾覆盖。将麻醉后的小鼠置于电热毯平台上，并立即在双眼上涂抹医用透明质酸钠凝胶。接着，将一枚100D的接触镜置于小鼠角膜上，凹面朝下，与角膜表面的透明质酸钠凝胶接触。然后，将小鼠放置于cSLO设备的小型恒温动物平台上。使用镊子调整隐形眼镜的角度，使瞳孔位于镜片中心。微调头部位置，使眼睛正对前方。点击OCT按钮，选择小鼠模块，然后启动cSLO程序。然后，使用操作杆缓慢移动预设镜头，使其靠近接触镜。进一步调整，以对齐前后极的图像，并将其居中于视神经乳头处。接着，启动OCT程序，并上下点击进度条，直至OCT图像出现。将最小范围调整至0到20之间，最大范围调整至40到60之间。然后调节预设的镜头距离和位置方向，直至获得理想的OCT图像。通过移动cSLO中的标准线来选择扫描位置。然后，点击“平均”以叠加cSLO和OCT图像信号，并点击拍摄按钮以获取SLO-OCT图像。实验结束后，取下100D接触镜，并涂抹左氧氟沙星眼用凝胶以保护角膜。对于视网膜分层校正，在OCT界面点击“加载检查”，并通过弹出窗口调用OCT图像。然后，双击媒体容器中的图像，将其显示在屏幕上。接着，点击层检测，以完成视网膜的自动分层。在选定待分析层面两侧的分界线后，点击编辑层以调整间距和限定范围。然后，通过移动红色圆圈来调整线条。要测量视网膜分层厚度，请点击测量标记按钮，并选择待分析层的分界线，以在OCT图像上显示该层的边界。接着，选择“与层连接”并勾选移动时保持连接。接下来，选择用于显示结果的区域，然后在OCT图像上点击待分析的位置，以显示测量线。点击下一列以进行后续测量并显示先前的数据。要测量全视网膜厚度，请在右上角列表中选择第一条线和第七条线。然后，根据视乳头边缘处视网膜结构的形态，在水平标尺上以200 µm为间隔测量四个数值。C57BL/6小鼠的OCT图像显示了具有清晰分界的多种视网膜层次。相比之下，Vldlr基因敲除小鼠则显示出异常的高反射性病灶。OCT 图像显示，Vldlr 基因敲除小鼠的视网膜表面存在一些中等反射带。这些条带附着于视网膜血管，与不完全玻璃体脱离的 OCT 特征相符。在视网膜下腔出现一处高反射病灶，并延伸至外核层，但未突破外丛状层。该病灶的OCT表现与病理学结果一致。病理切片显示，新生血管穿透视网膜色素上皮层、光感受器内-外节以及外界膜，侵入外核层，但未累及外丛状层。另一条高反射病灶位于视网膜下间隙，未累及外核层。与病理学发现一致，这种视网膜下新生血管未穿透外部限制膜。比较两组小鼠后极部颞侧、鼻侧、上方和下方区域右眼的视网膜厚度，结果显示 Vldlr 基因敲除小鼠的视网膜厚度显著低于 C57BL/6J 小鼠。在执行该方案时，应将一个100D的接触镜正确放置于角膜上，然后调整图像位置。选择扫描位置并在拍摄前叠加图像。按照此操作步骤，可进行眼前节OCT检查，需调整预设镜头与角膜之间的距离。该方法能够显示角膜、前房、虹膜、睫状体以及晶状体。该技术为小型动物模型中的视网膜病变研究提供了重要工具，有助于在基础研究中实现视网膜病变的无创检测与定量分析。

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光学相干断层扫描在视网膜病变小鼠模型中的应用

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来源： Jagodzinska, J., et. al.，活体小鼠视网膜神经节细胞的光学相干断层扫描成像。 J. Vis. Exp. (2017)...

使用光学相干断层扫描技术对小鼠视网膜进行活体成像

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可见光光学相干断层扫描光纤图像与同一小鼠视网膜共聚焦图像的配准

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