Name: 福斯特共振能量转移映射:阐明全球结构特征的新方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-16T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: 了解福斯特共振能量转移映射技术，用于识别蛋白质配体结合位点、构象变化及动态运动。该方法在溶液中进行，可自由监测生物分子相互作用，适用于多种生物化学与结构生物学研究。

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本工作由美国国立卫生研究院资助项目R15GM135904（授予IM）和美国国立卫生研究院资助项目GM110552（授予DBO）支持。

作者无任何利益冲突需要披露。

通过使用FRET定位方法，我们确定了信号序列在SecA蛋白上的结合位点。重要的是，该复合物的三维晶体结构的存在极大地促进了我们的研究。这种定位方法的优势在于能够利用已有的结构信息来确定标记位点。该方法不能用于确定三维结构；然而，确定结构元件56、优化已有结构49、确定结合位点位置2,32，或阐明动态运动过程57，均为该方法的可行应用。
在SecYEG-SecA-PhoA复合物中，三个标记位点围绕假定的结合位点形成一个三角形（图1）。利用该三角形顶点至同一残基的多个距离测量值，可像全球定位系统（GPS）导航方法一样，精确定位信息。在SecA和SecY上确定了三个位点：SecA37、SecA341和SecY292；同时在前体蛋白的信号序列及成熟区早期确定了四个位点：Ph...

对于蛋白质而言，结合其三维（3-D）结构信息解析其动态变化，有助于更深入地理解生物分子系统的结构与功能关系。X射线晶体学和冷冻电子显微镜等结构生物学方法通常只能捕捉静态结构，且常常需要测定多个结构才能揭示生物分子结合及动态行为的某些方面1。本文介绍一种基于溶液的方法，用于绘制可能具有短暂性、难以通过静态方法捕获的全局结构特征，例如结合位点或结合相互作用。该方法的理想研究体系是那些已通过X射线晶体学、核磁共振（NMR）波谱法或其他结构生物学方法确定了三维结构的系统。在此案例中，我们利用SecA-SecYEG复合物的X射线晶体结构——该复合物是蛋白质通用分泌途径中的关键组分——在前体蛋白跨膜转运之前，通过荧光共振能量转移（Förster resonance energy transfer, FRET）技术定位信号肽结合位点2。通过基因改造手段对生物系统进行操控，并结合已知的三维结构信息，我们得以确定信号序列及成熟区早期区域在插入转运通道前的构象3。
FRET 涉及能量从一个分子（供体）以依赖于距离的方式通过空间无辐射地转移到另一个分子（受体）4,5。该能量转移的效率可通过供体荧光强度的降低或受体荧光强度的增强来监测。能量转移效率可描述为
E = R06/(R06 + R6)
其中 R0 值是指能量转移效率为 50% 时的距离6。该技术此前被称为分子尺，可有效测定 2.5–12 nm 范围内的距离，具体取决于供体-受体荧光染料的种类4,7,8,9。通过检测有或无受体时供体荧光的强度和寿命，可确定能量转移效率，进而推算出分子间距离5,8。由于该技术具有可及性高、方法灵敏且操作简便等优势，FRET 已广泛应用于单分子荧光光谱学和共聚焦显微镜等领域6。荧光蛋白（如绿色荧光蛋白）的出现，使得细胞内动态过程的观测和活细胞成像变得相对容易10,11。许多此类 FRET 应用在本期虚拟专题中均有详细讨论。
本研究特别关注利用FRET测量获得距离值，以确定结构细节。此前，FRET测量已成功用于确定DNA分子与蛋白质结合时的构象12,13,14、蛋白质内部动力学以及蛋白质结合相互作用15,16,17。该方法的优势在于能够利用相对少量的样品，在溶液中测定柔性及动态的结构元件。需要特别指出的是，该方法在与已有结构信息结合使用时尤为有效，但不能单独用于三维结构的测定。若研究基于已有的结构信息，并常与计算模拟相结合，则该方法可提供最佳的结构洞察与精修效果18,19。本文描述了如何利用稳态和时间分辨FRET测量获得的距离，来定位SecA-SecYEG复合物晶体结构上一个未知的结合位点；SecA-SecYEG复合物是通用分泌途径中的主要蛋白质3。
一般分泌途径是一种从原核生物到真核生物乃至古菌中都高度保守的系统，介导蛋白质穿过或插入膜结构，将其运输至细胞内的功能位点。对于革兰氏阴性细菌（例如本研究所用的 E. coli），蛋白质被插入或转运穿过内膜进入周质空间。细菌的 SecY 通道复合物（称为转位子）与其他蛋白质协同作用，通过通常位于新生肽链 N 末端的信号序列，将新合成的蛋白质定向转运至细胞内的正确位置20,21。对于靶向周质的蛋白质，ATP 酶 SecA 蛋白在约 100 个氨基酸残基被翻译后，与核糖体的出口通道以及前体蛋白结合22。SecA 与 SecB 分子伴侣蛋白共同作用，使前体蛋白保持未折叠状态。SecA 与 SecYEG 转位子结合，并通过多次 ATP 水解循环，促进蛋白质跨膜转运23,24。
SecA 是一种多结构域蛋白，以胞质可溶形式和膜结合形式存在。在胞质中，SecA 为同源二聚体蛋白，包含前体蛋白结合或交联结构域25、两个核苷酸结合结构域、一个螺旋翼结构域、一个螺旋支架结构域以及双螺旋指（THF）结构域26,27,28,29（图1）。在先前对 SecA-SecYEG 复合物的晶体学研究中，THF 的位置提示其积极参与蛋白质转运过程，后续与信号肽的交联实验进一步证实了该区域在蛋白质转运中的重要作用30,31。以往研究利用 FRET 定位方法表明，外源性信号肽可结合于 SecA 的这一区域2,32。为了全面理解前体蛋白的信号序列及早期成熟区在插入 SecYEG 通道前的构象与定位，研究人员构建了一种蛋白嵌合体，将信号序列及早期成熟区残基通过 Ser-Gly 连接子与 SecA 相连（图1）。利用这一具有生物学活性的构建体，进一步证实前体蛋白的信号序列和早期成熟区以平行方式结合于 THF 结构域2。随后，采用 FRET 定位方法进一步解析了在 SecYEG 存在条件下信号序列与早期成熟区的构象与位置，如下所述3。
SecA-SecYEG复合物的三维结构33,34,35及其可能的结合位点位置的已知信息，使我们能够合理地将供体-受体标记置于特定位置，使得各个FRET距离的交汇点可识别出结合位点的位置。这些FRET定位测量结果表明，前体蛋白的信号序列及其成熟区的起始部分形成一个发夹结构，其顶端位于SecYEG通道的入口处，证明该发夹结构在进入通道之前即已形成模板。

<table><tbody><tr><td>490 nm LED 激光器</td><td>Horiba</td><td>1684-LED</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne</td><td>Life Technologies</td><td>A20347</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Difco</td><td>DF0812</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne</td><td>Life Technologies</td><td>A10254</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne</td><td>Life Technologies</td><td>S10904</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne</td><td>Life Technologies</td><td>S10906</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra&amp;shy;4 离心滤膜（50 kDa 截留分子量）</td><td>Sigma</td><td>UFC805008</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基麦芽糖苷（DDM）</td><td>Anatrace</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 碱性磷酸酶信号肽 SP22</td><td>Biomolecules Midwest</td><td>N/A</td><td>定制合成产品</td></tr><tr><td>延长型信号肽 SP41</td><td>Biomolecules Midwest</td><td>N/A</td><td>定制合成产品</td></tr><tr><td>FluorEssence</td><td>Horiba</td><td>版本 2.4</td><td>Fluoromax4 荧光光谱仪的光谱采集程序</td></tr><tr><td>Fluoromax 4 荧光光谱仪</td><td>Horiba</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>GlobalsWE</td><td>加州大学欧文分校荧光动力学实验室</td><td></td><td>用于时间分辨衰减分析的光谱分析程序</td></tr><tr><td>H&amp;shy;4&amp;shy;叠氮苯丙氨酸（Azido&amp;shy;Phe&amp;shy;OH）</td><td>BACHEM</td><td>4020250.0001</td><td></td></tr><tr><td>LB（Miller）肉汤</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9723</td><td></td></tr><tr><td>Ludox HS-40 胶体二氧化硅（水中 40 wt.% 悬浮液）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>420816</td><td>需稀释以制备合适的散射溶液</td></tr><tr><td>PTI Felix GX</td><td>Horiba</td><td>版本 4.1.0.4096</td><td>PTI Time Master 仪器的光谱采集程序</td></tr><tr><td>PTI Time Master 仪器</td><td>Horiba</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pymol 分子图形程序</td><td>Schrodinger</td><td>版本 2.4</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Thermo Scientific</td><td>NESLAB RTE 10</td><td></td></tr></tbody></table>

荧光共振能量转移定位：一种阐明全局结构特征的新方法

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features

荧光共振能量转移（FRET）是一种成熟的基于荧光的方法，已成功用于测量生物大分子内部及分子间的距离 体外 以及细胞内分子间的距离。在FRET中，能量转移效率通过荧光强度或荧光寿命的变化来测量，其大小与两个荧光分子或标记基团之间的距离相关。通过距离信息推断分子动力学和构象变化，仅是该方法在生物系统中应用的若干实例之一。在特定条件下，该方法可通过提供有关动力学、柔性以及与结合表面相互作用适应性的信息，补充并增强已有的X射线晶体结构数据。本文描述了如何利用FRET及相关的距离测定技术，通过识别结合位点或确定二聚体亚基的取向，来阐明分子的结构特性。通过合理选择标记位点，并常结合多种标记策略，我们已成功将这些定位作图方法应用于蛋白-DNA复合物以及SecA-SecYEG蛋白转运系统中全局结构特性的测定。在SecA-SecYEG系统中，我们采用FRET定位作图方法鉴定了前体蛋白的结合位点，并确定了结合态信号序列区域的局部构象。本研究概述了开展FRET定位作图研究的步骤，包括合适标记位点的筛选、可选标记物（含非天然氨基酸残基）的讨论、标记实验流程、测量操作方法以及数据解析。

本研究旨在确定前体蛋白插入SecYEG通道之前其结合位点在SecA上的位置。为了定位该结合位点，我们在前体蛋白的不同区域与SecA及SecYEG蛋白上的三个不同位置之间进行了FRET实验（图1A-D）。结合所获得的距离数据以及SecA、SecYEG和前体蛋白的三维结构，预测了前体蛋白结合位点的位置。为进行这些测量，未采用三种独立组分（SecA、SecYEG和前体蛋白），而是通过基因改造，在引入Gly-Ser连接肽后，将PhoA信号序列连接至SecA2,3。为了便于染料标记，在PhoA前体蛋白的第2、22、35和45位残基处引入了Cys残基或琥珀突变（图1E）。
结合位点的鉴定与标记 
先前已通过类似的FRET定位方法鉴定出信号序列的一个潜在结...

该研究详细介绍了FRET定位的方法学，包括标记位点的选择、染料的选用、数据采集以及数据分析。该方法在确定蛋白质体系中的结合位点、构象变化和动态运动方面具有显著效果，若与现有的三维结构信息结合使用，则效果更佳。

Förster共振能量转移（FRET）是一种成熟的基于荧光的方法，已成功用于测量分子内及分子间的距离……

我们开发了一种FRET定位方法，可用于鉴定和表征配体结合位点、亚基取向、与配体结合相关的构象变化以及蛋白质的动态运动。该技术的一个优势是可在溶液中进行，分子能够自由移动。该技术所测得的距离适用于生物体系。FRET 可广泛应用于多种系统。如果存在三维结构信息，映射技术能够更有效地监测任何生物分子系统的结构和动态变化。蛋白质纯化后，最具挑战性的步骤是实现高效标记并去除游离染料。进行实验时，应尽量减少游离染料的含量。首先，选择位于目标结合位点 25 至 75 埃范围内且处于蛋白质相对静态区域的标记位点。该距离将决定所使用的特定 FRET 染料组合。在蛋白质中选择彼此相对独立的标记位点，使这些位点构成一个三角形的三个顶点，而待研究的结合位点位于该三角形的中心。为测量 R0 值，根据所需的比色皿尺寸和体积，制备两份总蛋白浓度相同的蛋白质样品。一种是仅用供体染料标记的蛋白质，另一种是仅用受体染料标记的蛋白质。如果使用荧光分光光度计，请打开荧光仪并启动 FluorEssence 软件中的光谱采集与分析程序。单击红色的 M 以连接计算机与仪器，并选择发射光谱。使用“采集实验”菜单项输入扫描参数，例如激发波长、发射扫描范围、温度以及样品位置。通过在染料吸收最大值处设置激发波长，并监测荧光发射峰值，点击RTC并根据文稿中所述优化仪器设置。将标记有供体的蛋白质样品放入样品池中，点击“运行”，在染料吸收最大值处激发样品，并扫描发射峰，从而获得仅标记供体染料的蛋白质的发射光谱。通过将扫描范围在峰终点后延伸25至50纳米来建立扫描基线。按照文本手稿中的描述，对不同浓度的样品进行吸收和荧光测量，以测定仅含供体蛋白的量子产率。制备浓度相同的仅含供体蛋白、仅含受体蛋白以及供体-受体蛋白样品。获取仅含供体的扫描以生成荧光发射光谱。在供体染料吸收最大值处激发溶液，并扫描供体和受体的发射峰。可选择将样品更换为仅含受体的蛋白质，或调整位置至含有仅受体蛋白质的比色皿处。获取仅用受体染料标记的蛋白质的发射光谱扫描。在供体激发波长下激发样品。将样品更换为供体-受体标记的蛋白质样品，或调整位置至含有供体-受体标记蛋白质的比色皿处。使用相同的设置获取供体-受体蛋白样品的发射扫描图谱。对于所有光谱，通过减去在扫描结束时测得的背景计数来校正背景荧光。使用PyMOL等三维图形可视化程序，将距离信息映射到结构上，方法是在命令窗口中直接输入脚本中的命令，并提供相应的距离信息。针对每个测得的距离及其相关误差生成相应的球壳，通过不同球壳的交点确定位置。利用 SecA 和 SecYEG 上的三个不同位点以及信号肽上的四个不同位点，对信号肽结合位点进行定位。通过前体蛋白不同区域与SecA和SecYEG蛋白上三个不同位点之间的FRET实验，可绘制出前体蛋白的结合位点及其取向。信号肽的结合位点先前已被确定为两螺旋指结构，而SecA的C末端尾部则提示其取向与两螺旋指平行。获得了SecA37与PhoA2以及PhoA22之间的稳态FRET光谱。供体荧光强度的降低表明，PhoA22 向受体传递了更多的能量。与位于距离 SecA37 较远位置的 PhoA2 位点相比，该现象更为显著。时间分辨荧光衰减光谱显示，供体-受体复合物具有较短的均相衰减，符合单一距离相关的能量转移特征。在SecA PhoA2残基与三角定位位点之间构建的FRET距离壳层显示，每个壳层均与双螺旋指结构——即假设的结合位点（以绿色显示）相交。相交区域小于每个FRET壳层，并且螺旋支架结构对此区域有较大贡献。由PhoA2残基与标记位点之间确定的FRET距离壳层，描述了一个更小的区域，该区域更靠近双螺旋指的顶端以及SecYEG通道的开口处。该交叉区域位于PhoA2双螺旋指结构的另一端。需要考虑的重要因素包括：合理选择标记位点以定位目标区域，测量每个位点的量子产率，并去除所有游离染料。该方法与通过核磁共振（NMR）或X射线晶体学等方法获得的结构信息相一致。当将FRET结果置于结构背景下时，可以增强现有的信息。

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福斯特共振能量转移映射:阐明全球结构特征的新方法

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