培养与筛选植物寄生线虫 Ditylenchus dipsaci

本方案通过培养技术和中等通量化学筛选，可用于发现能够防治茎线虫（Ditylenchus dipsaci）的新型杀线虫剂。该技术操作简便，每周可筛选数千种化合物，以鉴定具有杀线虫潜力的候选分子。该方法可识别出能够杀灭农作物寄生性线虫的新化合物，从而有助于提高全球粮食供应。

首先，准备 500 毫升营养琼脂（NA 培养基），每升含 23 克 NA 和超纯水。采用无菌操作技术，将 25 毫升经高压灭菌的 NA 培养基倒入 20 个一次性直径 100 毫米、深度 15 毫米的培养皿中。另准备 500 毫升 Gamborg B5（GA 培养基），其中包含每升 3.2 克 GA 基本培养基（含最低量有机成分）、20 克蔗糖、15 克琼脂和蒸馏水。

采用无菌操作技术，将50毫升经高压灭菌的GA培养基倒入10个一次性培养皿中。进行种子灭菌时，在实验台上的本生灯火焰附近，将150粒豌豆种子倒入含搅拌子的无菌2升烧杯中。向种子中加入200毫升95%乙醇，并在搅拌器上剧烈搅拌5分钟。

然后，将乙醇倒入废液容器中。将次氯酸钠溶液倒入烧杯，完全浸没种子。在摇床中剧烈搅拌20分钟。

然后，将次氯酸钠溶液倒入废液容器中。向烧杯中加入蒸馏水以浸没种子，并在摇床上剧烈搅拌20分钟。最后一次水洗后，将已灭菌的种子倒入玻璃培养皿中。

为检测污染，使用灭菌镊子在超净工作台中将六粒种子转移至每个10厘米的NA培养基平板上。将种子沿平板边缘均匀排列。用实验室封口膜逐个包裹平板，并在26摄氏度避光条件下培养三天。

在超净工作台中，使用灭菌镊子将两粒无污染的种子接种到每个 GA 培养基平板上。于室温下培养 7 至 10 天，使种子发芽。配制 50 毫升浓度为 20 克/升的蔗糖溶液。

将蔗糖溶液过滤除菌，备用。在超净工作台中，从现有的培养皿中切取含有根组织的一小块琼脂。用移液器吸取500 µL蔗糖溶液，滴加到含有豌豆幼苗的新制GA培养基平板上，然后将琼脂块置于蔗糖溶液上方。

将培养物置于室温下、内衬铝箔的盒子中进行保存。为维持培养物，每八到九周需将线虫转接至新的GA平板上进行传代培养。线虫培养约八周后即可进行提取。

在超净工作台中，使用无菌解剖刀将琼脂和根组织切成一厘米见方的小块。将琼脂块转移至铺有咖啡滤纸的漏斗中，并缓慢倒入蒸馏水润湿咖啡滤纸。将铺有咖啡滤纸的漏斗从烧杯中取出，向烧杯中加入蒸馏水，直至重新放回漏斗后，液面刚好接触滤纸底部。

用铝箔覆盖装有咖啡滤纸的漏斗和烧杯。为收集线虫，取下装有咖啡滤纸的漏斗，并用移液器吸取收集烧杯中上层40毫升的水，注意不要扰动已沉淀的线虫。使用10毫升塑料刻度移液管将剩余液体收集至15毫升锥形离心管中。

为准备检测板，将经高压灭菌的蒸馏水倒入无菌槽中，使用多通道移液器从槽中向平底96孔板的每个孔内加入40 µL蒸馏水。通过将金属针在96孔化学储存板中浸入三次，将化学品添加至检测板中，随后将金属针在检测板中转移十次。

将样品点在清洁溶液前方的纸面上。为统计收集到的线虫数量，首先重新悬浮收集的样品，然后使用低吸附枪头吸取5 µL溶液，滴加到载玻片上。利用解剖显微镜计数5 µL溶液中的线虫数量。

然后，使用无菌蒸馏水将浓度调整为每微升含两个线虫。接着，用多通道移液器和储液槽向96孔板的每个孔中加入10微升样品。用湿润的纸巾包裹96孔板，并将其放入盒中。

然后，添加一张额外的湿润滤纸，以稳定并尽量减少培养板的移动，并将其固定在20°C、200 rpm的摇床培养箱中的粘性垫上。在第5天于解剖显微镜下观察培养板。计数DMSO溶剂对照组和药物处理孔中移动的和总的D. dipsaci数量。

如果线虫不移动，向孔中加入两微升一摩尔的氢氧化钠，使其终浓度达到40毫摩尔，以刺激其运动。计算可移动线虫的比例。在D.dipsaci筛选中，重复实验中始终产生0%可移动线虫的孔被归类为强阳性结果。

在60微摩尔浓度下筛选了三种不同的药物板，每种药物板均包含三个生物学重复。所有三个药物板均含有6%的DMSO溶剂对照。许多含有小分子文库药物的药物板中，未发现任何对D.dipsaci具有可观察生物活性的分子。

一些培养皿中的结果完全可重复，而另一些含有已知杀线虫剂的培养皿则表现出不同的活性。误差线代表平均值的标准误差。此处，氟吡菌酰胺在该检测中表现出显著的活性。

氟吡菌酰胺对D. dipsaci的活动性表现出明显的剂量依赖性效应，其EC50为9.3 µM。截至120 µM浓度，灭线磷对活动性无显著影响。截至120 µM浓度，灭线磷对活动性无显著影响。

加入氢氧化钠提高了检测不动线虫的检测灵敏度。使用40毫摩尔的氢氧化钠作为检测终点，以刺激尚有活动能力的个体产生运动，从而区分处于静止状态的线虫与病态线虫。该方案已成功用于鉴定针对D.dipsaci及其他物种具有新颖作用机制的化合物。