植物寄生线虫的培养和筛选

本方案描述了一种可靠而直接的培养、收集和筛选 Ditylenchus dipsaci的方法。

该协议允许通过培养技术和中等通量化学筛选发现新型杀线虫剂以对抗Ditylenchus dipsaci。该技术的简单性允许每周筛选数千种化合物，以鉴定具有线虫电位的化合物。这种技术可以鉴定出杀死作物植物寄生线虫的新化合物，从而增加全球粮食供应。

首先，用每升23克NA和超纯水制备500毫升营养琼脂或NA培养基。使用无菌技术，将25毫升高压灭菌的NA培养基倒入20个一次性100毫米直径，15毫米深的培养皿中。准备500毫升Gamborg B5或GA培养基，每升含有3.2克GA基础培养基，有机物最少，每升蔗糖20克，每升琼脂15克和蒸馏水。

使用无菌技术，将50毫升高压灭菌的GA培养基倒入10个一次性培养皿中。要进行种子灭菌，将150粒豌豆种子倒入无菌的两升烧杯中，搅拌棒靠近实验室工作台上的本生燃烧器火焰。向种子中加入200毫升95%乙醇，并在搅拌板上剧烈搅拌5分钟。

然后，将乙醇倒入废物容器中。将漂白剂溶液倒入烧杯中，使种子完全浸入其中。在搅拌板上剧烈搅拌20分钟。

然后，将漂白剂倒入废物容器中。将蒸馏水倒入烧杯中，将种子浸入其中，并在搅拌板上剧烈搅拌20分钟。最后一次水洗后，将灭菌的种子倒入玻璃培养皿中。

为了检查污染，使用灭菌镊子将六颗种子转移到层流罩中每个10厘米的NA板上。将种子排列在盘子的圆周周围。将板单独包裹在实验室包装膜中，并在26摄氏度的黑暗中孵育三天。

在层流罩中，在每个GA板上用灭菌的镊子板板两个未受污染的种子。在室温下孵育7至10天，以使种子发芽。准备50毫升20克/升蔗糖溶液。

过滤器对蔗糖溶液进行灭菌并放在一边。在层流罩中，从现有培养板中切下一块含有根组织的琼脂。将500微升蔗糖溶液移液到带有豌豆幼苗的新GA板上，并将琼脂块放在蔗糖顶部。

在室温下将培养物保持在衬有铝箔的盒子中。为了维持培养，每八到九周在新鲜的GA平板上传代培养线虫。线虫在大约八周后就可以提取了。

在层流罩中，用无菌手术刀将琼脂和根组织切成一厘米的立方体。将琼脂块转移到咖啡过滤器衬里的漏斗中，然后慢慢将蒸馏水倒在琼脂上以润湿咖啡过滤器。从烧杯中取出咖啡过滤器衬里的漏斗，并用蒸馏水填充烧杯，直到更换咖啡过滤器衬里的漏斗后，水位刚好接触到过滤器的底部。

用铝箔覆盖咖啡过滤器衬里的漏斗和烧杯。要收集蠕虫，请取下咖啡过滤器衬里的漏斗，并从收集烧杯中吸取顶部40毫升的水，而不会破坏沉降的蠕虫。用10毫升塑料血清移液器将剩余的液体收集到15毫升锥形离心管中。

为了制备测定板，将高压灭菌器蒸馏水倒入无菌槽中，并将40微升蒸馏水从槽中分配到带有多通道移液器的平底96孔板的每个孔中。通过将 96 孔化学储备板中的化学品固定到化学板中三次，将化学品添加到测定板中。然后，将针转移到测定板中10次。

在清洁液前的纸张上吸墨。要计算收集中的线虫数量，首先重新暂停收集，然后使用低保留尖端将五微升溶液移液到载玻片上。使用解剖显微镜计算五微升线虫的数量。

然后，使用无菌蒸馏水将浓度调节至每微升两个蠕虫。接下来，用多通道移液管和槽将10微升样品加入96孔板的每个孔中。用湿纸巾包裹盘子，并将它们放在盒子里。

然后，添加一条额外的湿纸巾以稳定并确保板的最小移动，并在设置为200 RPM的20摄氏度振荡培养箱中粘性垫上粘贴。第五天在解剖显微镜下观察板。计算DMSO溶剂对照和药物处理孔中的移动和总D.dipsaci的数量。

如果蠕虫不动，则向孔中加入两微升单摩尔氢氧化钠，最终浓度为40毫摩尔，以刺激运动。计算移动蠕虫的比例。在D.dipsaci筛中，可重复产生0%移动蠕虫的孔被归类为强命中。

以60微摩尔的浓度筛选三种不同的药板，其中每个药板具有三个生物重复。所有三个板都包括6%的DMSO纯溶剂对照。许多含有来自小分子库的药物的平板缺乏任何对D.dipsaci具有可观察到生物活性的分子。

一些板具有完全可重复的命中，而其他含有表征杀线虫剂的板的活性各不相同。误差线表示均值的标准误差。在这里，氟吡仑在测定中表现出强大的活性。

氟吡仑诱导对D.dipsaci迁移率的明显剂量依赖性作用，EC50为9.3微摩尔。氧戊基对高达120微摩尔浓度的迁移率没有显着影响。奥沙米对浓度高达120微摩尔的迁移率没有显着影响。

氢氧化钠的添加提高了检测不动蠕虫的测定灵敏度。使用40毫摩尔氢氧化钠作为测定终点，以刺激有能力的个体的运动，从而区分静息蠕虫和病蠕虫。该协议能够鉴定具有针对D.dipsaci和其他物种的新作用机制的化合物。