Name: 植物寄生线虫的培养和筛选 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 学习培养和筛选植物寄生线虫Ditylenchus dipsaci的方法，利用营养琼脂和Gamborg B5培养基进行中通量化合药物筛选。该技术可快速鉴定具有杀线虫活性的新型化合物，为提高农业产量和保障粮食安全提供有效工具。

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作者感谢加拿大农业与农业食品部的 Qing Yu 博士提供 Ditylenchus dipsaci 培养及培养方法的建议；感谢 Benjamin Mimee 博士（加拿大农业与农业食品部）和 Nathalie Dauphinais（加拿大农业与农业食品部）提供的建议 体外 植物寄生线虫的培养；感谢安德鲁·伯恩斯博士和肖恩·哈灵顿对本项目及稿件提出的宝贵建议。JK 获加拿大自然科学与工程研究理事会亚历山大·格雷厄姆·贝尔加拿大研究生奖学金资助。PJR 获加拿大卫生研究院项目基金（313296）支持。PJR 为加拿大化学遗传学领域一级研究主席。

本研究所用的D. dipsaci菌株G-137采自爱德华王子县Fish Lake 4号品种大蒜，由加拿大农业与农业食品部提供。若需建立新培养物，请参考Poirier等人的接种方法15。
1. 拟松材线虫（D. dipsaci）的培养
<ol>
	<li>按照先前报道的方法15准备培养基和培养皿。
	<ol>
		<li>使用23 g/L的营养琼脂（NA）（见材料表）和超纯水配制500 mL NA培养基。采用无菌操作技术，将25 mL经高压灭菌的NA培养基倒入20个一次性培养皿（直径100 mm × 深15 mm）中。盖上皿盖，在室温（22 °C）下静置约2小时使琼脂凝固，随后备用。</li>
		<li>使用3.2 g/L Gamborg B-5（GA）基础培养基（低有机物含量）、20 g/L蔗糖、15 g/L琼脂和蒸馏水配制500 mL Gamborg B-5（GA）培养基（见材料表）。采用无菌操作技术，将50 mL经高压灭菌的GA培养基倒入10个一次性培养皿（直径100 mm × 深25 mm）中。盖上皿盖，在室温（22 °C）下静置约5小时使琼脂凝固，然后 upright 存放于无菌袋中，直至进行芽苗转移。 
		注：制备多余的培养基平板以应对可能发生的污染。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>参照先前研究修改的方法进行种子灭菌15。
	<ol>
		<li>将一个2 L烧杯、一根搅拌子、两把镊子、一个玻璃培养皿和1 L蒸馏水进行高压灭菌。另准备200 mL 95%乙醇溶液和200 mL 15%商用次氯酸钠溶液。</li>
		<li>使用豌豆种子（见材料表）。在实验台上的本生灯火焰附近，将150粒种子倒入已灭菌的2 L烧杯中，并放入搅拌子。</li>
		<li>向烧杯中的种子加入200 mL 95%乙醇，在搅拌器上剧烈搅拌5分钟，然后将乙醇倒入废液容器中。</li>
		<li>将次氯酸钠溶液倒入烧杯，完全浸没种子，在搅拌器上剧烈搅拌20分钟，随后将次氯酸钠溶液倒入废液容器中。</li>
		<li>向烧杯中加入蒸馏水浸没种子，在搅拌器上剧烈搅拌20分钟。重复水洗三次，每次水洗后均将蒸馏水倒出。最后一次水洗完成后，将已灭菌的种子倒入玻璃培养皿中。</li>
		<li>为检测污染情况，使用已灭菌的镊子在超净工作台内将6粒种子转移至每个10 cm NA平板（步骤1.1.1中制备）。将种子沿培养皿边缘排列（饱满种子效果更佳）。用实验室封口膜 individually 包裹各培养皿，并在26 °C黑暗条件下培养3天。 
		注：接种比所需数量更多的种子，以便后续选择未受污染的种子使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照以下步骤进行芽苗转移。
	<ol>
		<li>在超净工作台内，使用已灭菌的镊子将2粒无污染的种子接种到每个GA平板（步骤1.1.2中制备）上。用实验室封口膜 individually 包裹各培养皿，并在室温下培养7–10天，使种子发芽。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>参照先前研究修改的方法进行体外培养15。
	<ol>
		<li>配制50 mL 20 g/L蔗糖溶液。经滤膜灭菌后备用。</li>
		<li>在超净工作台内，从现有培养平板中切取一块含有根组织的琼脂（约2 cm3）。用移液器将500 µL蔗糖溶液滴加至新的GA平板（含豌豆幼苗）上，并将琼脂块置于蔗糖液滴上方。用实验室封口膜 individually 包裹各培养皿，并将培养物置于内衬铝箔的盒子中，在室温（约22 °C）下维持培养。</li>
		<li>每8–9周将线虫转接至新鲜GA平板以维持培养。约8周后，线虫即可用于提取。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. D. dipsaci 的提取与收集
<ol>
	<li>按照以下步骤提取 D. dipsaci。
	<ol>
		<li>将一个 50 mL 烧杯、一个 80 mm 漏斗、150 mL 蒸馏水和咖啡滤纸进行高压灭菌。将漏斗放入烧杯中，并用无菌咖啡滤纸衬垫漏斗内壁。</li>
		<li>在超净工作台中，使用无菌解剖刀将琼脂和根组织切成 1 cm3 的小块。将琼脂块转移至衬有无菌咖啡滤纸的漏斗中，并缓慢倾倒蒸馏水润湿滤纸。</li>
		<li>将衬有咖啡滤纸的漏斗从烧杯中取出，向烧杯中加入蒸馏水，直至重新放回漏斗后液面刚好接触滤纸底部。</li>
		<li>用铝箔覆盖装有咖啡滤纸的漏斗和烧杯。室温静置过夜（16 小时），使线虫穿过咖啡滤纸进入收集烧杯。 
		注：在解剖显微镜下观察到线虫已爬入琼脂时，表明线虫培养皿已准备好进行提取。通常，在初次接种后 6–8 周，培养皿即可用于提取。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行 D. dipsaci 的收集。 
	注：次日，D. dipsaci 线虫将沉降至收集烧杯底部。
	<ol>
		<li>移除衬有咖啡滤纸的漏斗，用移液器吸除收集烧杯中上层 40 mL 水液，注意不要扰动已沉降的线虫。使用 10 mL 塑料刻度移液管将剩余液体转移至 15 mL 圆锥形离心管中。 
		&#8203;注：此收集物可直接用于实验分析。若 24 小时内不使用，可置于 4 °C 保存。线虫在 4 °C 下可存放 3 天，活动能力无明显下降。移除漏斗时可能扰动烧杯中的线虫，应待其重新沉降至底部后再进行收集。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 体外 小分子筛选
<ol>
	<li>按照以下步骤准备检测板。
	<ol>
		<li>将灭菌蒸馏水倒入无菌槽中，使用多通道移液器从槽中吸取蒸馏水，向每列平底96孔板的每个孔中加入40 µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备固定工具并添加化学试剂
	<ol>
		<li>设置针板托盘（参见 材料表) 在实验台上的本生灯火焰附近进行。依次向各个针具托盘中加入：25 mL 针具清洗液、35 mL 50% DMSO（溶于水）、45 mL 蒸馏水、55 mL 70% EtOH 和 65 mL 95% EtOH。在每个托盘前方各放置一张吸水纸</li>
		<li>将固定针浸入清洗液中，上下移动固定针三次（3x）。本方案中，“3x”和“10x”分别定义为将点样针在溶液中上下移动三次或十次。用吸水纸轻压固定针以吸去液体。重复此步骤一次。
		<ol>
			<li>接下来，用蒸馏水将针冲洗3次，然后吸干针上的液体。重复此步骤一次。</li>
			<li>最后，将点样针在95% EtOH中冲洗3次，随后用吸水纸吸干。重复此步骤一次。用火焰灼烧点样针，并使乙醇完全挥发。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>从96孔化学试剂储备板中，通过将针头插入化学板3次，然后将针头转移至检测板中10次，将试剂加入检测板。在清洁液前方的纸巾上进行点样。</li>
		<li>在各培养板之间使用以下顺序清洗固定针工具，并在每次清洗之间用吸水纸吸干：50% DMSO 中清洗 3 次（一次），蒸馏水中清洗 3 次（一次），75% EtOH 中清洗 3 次（一次），95% EtOH 中清洗 3 次（两次）。将固定针过火灭菌，并待乙醇完全挥发后再使用。</li>
		<li>完成所有固定步骤后，重复步骤 3.2.2。 
		注意：筛选实验在终浓度为 60 µM 的条件下进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>添加线虫
	<ol>
		<li>使用低吸附枪头将收集的线虫重悬后吸取5 µL滴加至载玻片上，在解剖显微镜下观察并计数5 µL中的线虫数量。
		<ol>
			<li>用无菌蒸馏水将浓度调整至2条/µL。使用多通道移液器和试剂槽，向96孔板的每个孔中加入10 µL（约20条）。 
			&#8203;注：约 15,000 D. dipsaci 线虫将根据所述的培养和收集方法从每个培养板中收集。每孔使用20条线虫，因为数量较少有助于清晰观察和统计活动与不活动的个体。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用实验室封口膜密封培养板，并用湿润的纸巾包裹。将培养板放入盒子中，置于设定为200 rpm的20 °C振荡培养箱内的粘性垫上。通过添加额外的湿润纸巾确保盒子内的培养板保持稳定，以尽量减少移动。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 数据收集与分析
<ol>
	<li>在第5天于解剖显微镜下观察平板，计数DMSO溶剂对照组和药物处理孔中活动的和总的D. dipsaci数量。
	<ol>
		<li>若线虫活动性较低，可向孔中加入2 µL的1 M NaOH，使其终浓度达到40 mM，以刺激其运动19, 20。 
		注意：加入NaOH后，线虫将立即开始运动，需在5分钟内完成观察。活动线虫数量与总线虫数量将用于计算活动线虫的比例。根据筛选目的的不同，实验持续时间可相应调整。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算活动线虫的比例。在D. dipsaci筛选实验中，重复实验中活动线虫比例稳定为0%的孔被归类为强阳性结果。 
	注意：应避免将平板长时间放置在解剖显微镜载物台上，因为光源可能加热平板，从而对生物测定产生可变影响。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

关键步骤 
尽管该实验方案较为简单，但仍有一些关键步骤需要特别注意，以最大程度确保实验成功。首先，种子过度漂白会破坏其生长能力，因此必须将种子在漂白液中的处理时间控制在20分钟或以内。其次，正如Storelli等先前所述，线虫在4 °C储存期间，其表观健康状况会随着时间推移而下降16。因此，在收集线虫后尽快使用，有助于确保获得最佳的筛选条件。若需长期储存，应确保离心管盖子不要拧紧，以允许氧气交换。第三，确保豌豆在NA平板上按照建议时间生长，以便实验者判断哪些种子已被污染。第四，在加入线虫之前若豌豆在GA平板上生长过度，将削弱感染效果并降低线虫产量。最后，许多难以控制的因素可能影响筛选结果，因此必须在不同日期进行多次独立的重复实验，理想情况下应使用来自不同培养平板的PPN（植物寄生线虫），以确保实验结果的可重复性。
方法的局限性 
本方案的一个局限性在于其无法同步收集到的线虫的发育阶段，这些线虫从幼虫到成虫均有分布。因此，任何筛选中发现的显著有效化合物可能在多个发育阶段均起作用。然而，该方案增加了遗漏具有阶段特异性效果的阳性结果的风险。第二个需要考虑的因素是，体外筛选应被视为杀线虫剂发现流程的第一步；基于土壤的实验是该流程中极好的补充环节，可用于验证阳性化合物的实际可转化性。
该方案的意义与应用 
本文所述方案操作简便，易于重复。此外，本方案在实验室中已成功应用于其他植物寄生线虫（PPN），仅需稍作修改即可用于Pratylenchus penetrans等物种。开发新型且安全的植物寄生线虫防控措施，对于保障全球粮食安全至关重要。对于D. dipsaci这类通常对多种现有可用化学杀线虫剂具有广泛耐受性的物种而言，尤其如此13,14。因此，本文所概述的方案有望在全球范围内对人类健康作出重要贡献。

据估计，植物寄生性线虫（PPNs）导致全球粮食产量损失达12.3%，每年造成约1570亿美元的经济损失1,2,3。遗憾的是，由于人类健康和环境安全方面的担忧，许多高效的化学杀线虫剂已被禁用或正面临日益严格的限制，导致对PPNs的防控能力不断下降。这主要是因为上一代农药对线虫的选择性较差4。在过去25年中，仅有六种新型化学杀线虫剂被试点或投入市场5。其中一种已在欧洲被禁用，另一种因正在评估其对人类健康的影响而被停产6,7。因此，迫切需要开发出对植物寄生性线虫具有高度选择性的新型杀线虫剂。
茎线虫和鳞茎线虫， Ditylenchus dipsaci (D. dipsaci) 是一种具有重要经济影响的植物寄生线虫4D. dipsaci 感染近500种植物，跨越30个生物型，且靶向多种最重要的农作物，如黑麦、燕麦、大蒜、洋葱和韭菜8,9例如， D. dipsaci 最近在安大略省和魁北克省的蒜田中肆虐，导致高达90%的损失10,11其地理分布几乎遍布全球，包括美洲（含加利福尼亚和佛罗里达）、欧洲、亚洲大部分地区（含中国）以及大洋洲。9. D. dipsaci 是一种迁徙性内寄生菌，通过叶片上的气孔或伤口及皮孔侵入，在其中释放酶以降解细胞壁12. 加重了影响 D. dipsaci 在作物上，植物寄生性线虫（PPN）造成的损伤会使植物易于发生继发性感染11不幸的是， D. dipsaci 与其他线虫品系相比，对当前使用的杀线虫剂表现出较高的耐受性13,14.
本方案描述了对D. dipsaci的培养方法及其在小分子候选杀线虫剂大规模筛选中的应用。&#160;简言之，D. dipsaci种群在无菌的Gamborg B-5（GA）培养基中培养的豌豆植株上进行维持和扩增15。在将种子接种于GA培养基前，需通过一系列洗涤对种子进行灭菌，并将其接种于营养琼脂（NA）平板以检测污染情况。种子灭菌对于检出可能存在的细菌和真菌污染物至关重要。经确认无污染的种子随后被转移至GA平板，在其中萌发成幼苗以备接种线虫。通过将含有根组织的一小块琼脂从前期培养的平板转移至新鲜的含幼苗GA平板，实现线虫接种。6–8周后，从GA培养基中提取线虫，并通过铺有咖啡滤纸的漏斗过滤至收集烧杯中。收集到足够数量的线虫后，即可用于多种生物测定。本方案所述技术每块培养平板可获得约15,000条D. dipsaci。已有其他D. dipsaci培养方案发表16,17。
一个 体外 基于前期研究的小分子筛选实验18&#160;此处也进行了描述。&#160;作为线虫健康状况的替代指标，在小分子暴露5天后检测每孔20条线虫的运动能力。为了更清晰地观察线虫运动，加入NaOH以增强活体线虫的活动。19,20.&#160;该方案可实现中等通量筛选，并提供有价值的数据用于评估小分子的杀线虫潜力。若采用不同的线虫收集技术16,17尽管如此，本文所述的小分子筛选方法仍然可以实施。

<table><tbody><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td></td></tr><tr><td>2 把镊子</td><td>Almedic</td><td>7747-A10-108</td><td></td></tr><tr><td>2L 烧杯</td><td>Pyrex</td><td>CLS10002L</td><td></td></tr><tr><td>50mL 烧杯</td><td>Pyrex</td><td>CLS100050</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Sarstedt</td><td>83.3924</td><td></td></tr><tr><td>铝箔</td><td>Alcan Plus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>细菌学琼脂</td><td>BioShop</td><td>AGR001.5</td><td></td></tr><tr><td>咖啡滤纸</td><td>无品牌</td><td>716</td><td></td></tr><tr><td>市售漂白剂 6%</td><td>Lavo Pro 6</td><td>DIN102358107</td><td></td></tr><tr><td>一次性培养皿 (10cm × 1.5cm)</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>一次性培养皿 (10cm × 2.5cm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z358762</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Leica</td><td>Leica MZ75</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301-500ML</td><td></td></tr><tr><td>漏斗</td><td>VWR</td><td>414004-270</td><td></td></tr><tr><td>Gamborg B5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5893-10L</td><td></td></tr><tr><td>玻璃培养皿</td><td>VWR</td><td>75845-546</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>MAGNA</td><td>60-1200</td><td></td></tr><tr><td>无尘吸水纸</td><td>V&amp;P Scientific</td><td>VP 522-100</td><td></td></tr><tr><td>低吸附移液器吸头 (200μL)</td><td>LABFORCE</td><td>1159M44</td><td></td></tr><tr><td>多通道移液器</td><td>Eppendorf research plus</td><td>3125000036</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-500G</td><td></td></tr><tr><td>营养琼脂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70148-100G</td><td></td></tr><tr><td>封口膜</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>豌豆种子</td><td>Ontario Seed Company</td><td>D-1995-250G</td><td></td></tr><tr><td>点样针清洗液</td><td>V&amp;P Scientific</td><td>VP110A</td><td></td></tr><tr><td>点样针</td><td>V&amp;P Scientific</td><td>VP381N</td><td></td></tr><tr><td>点样针冲洗槽</td><td>V&amp;P Scientific</td><td>VP 421</td><td></td></tr><tr><td>带盖试剂槽（用于多通道移液器）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR703459</td><td></td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>I26</td><td></td></tr><tr><td>无菌手术刀片</td><td>MAGNA</td><td>sb21-100-a</td><td></td></tr><tr><td>搅拌子</td><td>Fisherbrand</td><td>2109 - 1451359</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>BioShop</td><td>SUC507.1</td><td></td></tr></tbody></table>

培养与筛选植物寄生线虫 ditylenchus dipsaci

Culturing and Screening the Plant Parasitic Nematode Ditylenchus dipsaci

植物寄生性线虫（PPN）每年破坏全球超过12%的粮食作物，相当于每年造成约1570亿美元（USD）的经济损失。随着全球人口不断增长以及可耕地资源日益有限，控制PPN侵染对粮食生产至关重要。然而，由于现有杀线虫剂普遍缺乏对线虫的选择性，导致有效农药的使用正面临越来越多的限制，这进一步加剧了提高作物产量的挑战。因此，开发新型且安全的化学杀线虫剂对于保障粮食安全至关重要。本实验方案展示了植物寄生性线虫物种 Ditylenchus dipsaci 的培养与收集方法。D. dipsaci 不仅具有显著的经济危害性，而且对大多数现代杀线虫剂具有较强的抗性。本研究还详细说明了如何利用这些线虫进行新型小分子杀线虫化合物的筛选，并介绍了数据采集与分析的方法。该实验流程每周可实现数千种化合物的高通量筛选，并可轻松适配于其他PPN物种，例如 Pratylenchus penetrans。本文所述技术可用于发现新的杀线虫剂，这些候选化合物有望进一步开发为高度选择性的商业化产品，以安全有效地防控植物寄生性线虫，助力解决日益严峻的全球粮食需求问题。

独立重复实验揭示可重复的阳性结果 
为说明重复筛选实验之间的预期差异，本文展示了最近一次筛选中三个代表性培养板的样本迁移率的均值及变异情况（图1）。该筛选实验在三个不同的日期进行了三次重复。所有三个培养板均包含阴性对照（仅溶剂对照，深色柱状图），且每组样本中均含有已知的杀线虫剂。其余化合物来自Roy实验室目前正在表征的一个定制化合物文库。与使用相同化合物对C. elegans开展的类似筛选实验相比（SC、JK、PJR，未发表结果），D. dipsaci的阳性命中率显著更低，且许多药物板未显示任何活性（图1A）。部分培养板显示出完全可重复的阳性结果（图1B、C），而另一些则在活性上存在差异（图1C）。与其他已筛选物种（未展示）相比，D. dipsaci对化合物的反应变异性更小。尽管如此，进行重复实验仍被视为识别可重复阳性结果的必要条件。
杀线虫剂在抑制线虫活动能力方面存在差异 Ditylenchus dipsaci 
在测试的七种已表征的杀线虫剂中 D. dipsaci, 只有氟吡菌酰胺在本文所述的检测中表现出显著的活性（图1C）。这与先前的研究结果一致，表明 D. dipsaci 耐受杀线虫剂13,14氟吡菌酰胺以线虫选择性方式抑制电子传递链中的复合体II，是一种用于防治多种植物寄生性线虫的商品化杀线虫剂，包括 Rotylenchulus reniformis 和 南方根结线虫4,21,22氟吡菌酰胺和一种在测试浓度下无活性的杀线虫剂（灭多威）23 通过剂量-反应分析进行了更深入的研究 D. dipsaci氟吡菌酰胺对 D. dipsaci EC50 为的迁移率 9.3 μM （95% 置信区间为 8.2 至 10.5 μM) (图 2A，B。这一结果与已发表的文献报道相符 体外 Storelli 等人，2020 年的研究结果13. 灭多威在浓度达到以下水平时对活动能力无显著影响 120 µM (p = 0.3632，非配对 t 检验）（图2C，D).
氢氧化钠可提高检测灵敏度 
与近似持续的游泳活动相比 秀丽隐杆线虫 在液体培养中18, D. dipsaci 动物的活动能力显著下降。这在培养的寄生性线虫中并不罕见。16为帮助区分“静止”线虫与病态线虫，在检测终点加入 40 mM NaOH 以刺激仍具活动能力的个体产生运动图3)19,20该技术能够清晰地鉴定出可固定线虫的小分子，因为在阴性对照孔中的所有线虫均保持运动，从而使筛选过程中的假阳性背景信号极低。
<img alt="平板检测结果；图表显示不同活性水平下孔位坐标与可移动比例的关系。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63438/63438fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：筛选结果示例。 针对所示三个平板中的每个小分子（60 µM），均使用D. dipsaci进行了三次生物学重复实验（空心圆圈）。三个平板均含有0.6% DMSO的溶剂对照组（颜色较深的柱状图）。除非另有注明使用溶剂对照或已知杀线虫剂，否则这三个平板的孔中均含有从供应商购买的、尚未充分表征的类药物化合物（参见 Burns 等，2015）18。(A) 来自小分子文库的一个96孔板中，未发现任何对D. dipsaci具有可观测生物活性的分子。( B) 来自小分子文库的另一个96孔板中，存在一种可重复抑制D. dipsaci运动能力的分子。( C) 一个含有已知杀线虫剂的96孔药物板，其中包括氟吡菌酰胺（fluo）、异菌脲（ipro）、阿维菌素（abam）、氟硫菌酯（flue）、噻唑砜（tiox）、灭多威（oxam）和 wact-11。误差线表示平均值的标准误差。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63438/63438fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="氟吡菌酰胺和涕灭威对线虫的影响；浓度梯度、显微镜图像、柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63438/63438fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：使用运动性检测法获得的阳性与阴性结果示例。 （A）在加入 NaOH 前，D. dipsaci 经 5 天不同浓度氟吡菌酰胺处理后的终末表型示例。（B）D. dipsaci 在指定浓度氟吡菌酰胺中暴露 5 天后的运动剂量反应分析。（C,D）同 A、B，但使用涕灭威。每个图表展示了在两天内分别进行的两次试验，每天三个重复。每个图表的 y 轴表示每孔中可移动线虫的比例，计算方法为移动个体数占该孔中总个体数的比例。两个图表中的误差线均表示平均值的标准误。比例尺代表 1 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63438/63438fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="线虫运动性检测；显微图像；NaOH对DMSO、噻唑芬、氟吡酰胺的影响" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63438/63438fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 3"> 
图3：添加40 mM NaOH后D. dipsaci的运动性。 在仅含溶剂的对照组（A）、噻唑芬（B）或氟吡酰胺（C）存在条件下，共孵育5天后NaOH对D. dipsaci样品运动性的影响。比例尺代表1 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63438/63438fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本实验方案描述了一种可靠且简便的Ditylenchus dipsaci培养、收集与筛选方法。

培养与筛选植物寄生线虫 Ditylenchus dipsaci

植物寄生线虫每年破坏全球超过12%的粮食作物，造成约1570亿美元（USD）的年经济损失。随着……

本方案通过培养技术和中等通量化学筛选，可用于发现能够防治茎线虫（Ditylenchus dipsaci）的新型杀线虫剂。该技术操作简便，每周可筛选数千种化合物，以鉴定具有杀线虫潜力的候选分子。该方法可识别出能够杀灭农作物寄生性线虫的新化合物，从而有助于提高全球粮食供应。 首先，准备 500 毫升营养琼脂（NA 培养基），每升含 23 克 NA 和超纯水。采用无菌操作技术，将 25 毫升经高压灭菌的 NA 培养基倒入 20 个一次性直径 100 毫米、深度 15 毫米的培养皿中。另准备 500 毫升 Gamborg B5（GA 培养基），其中包含每升 3.2 克 GA 基本培养基（含最低量有机成分）、20 克蔗糖、15 克琼脂和蒸馏水。采用无菌操作技术，将50毫升经高压灭菌的GA培养基倒入10个一次性培养皿中。进行种子灭菌时，在实验台上的本生灯火焰附近，将150粒豌豆种子倒入含搅拌子的无菌2升烧杯中。向种子中加入200毫升95%乙醇，并在搅拌器上剧烈搅拌5分钟。然后，将乙醇倒入废液容器中。将次氯酸钠溶液倒入烧杯，完全浸没种子。在摇床中剧烈搅拌20分钟。然后，将次氯酸钠溶液倒入废液容器中。向烧杯中加入蒸馏水以浸没种子，并在摇床上剧烈搅拌20分钟。最后一次水洗后，将已灭菌的种子倒入玻璃培养皿中。为检测污染，使用灭菌镊子在超净工作台中将六粒种子转移至每个10厘米的NA培养基平板上。将种子沿平板边缘均匀排列。用实验室封口膜逐个包裹平板，并在26摄氏度避光条件下培养三天。在超净工作台中，使用灭菌镊子将两粒无污染的种子接种到每个 GA 培养基平板上。于室温下培养 7 至 10 天，使种子发芽。配制 50 毫升浓度为 20 克/升的蔗糖溶液。将蔗糖溶液过滤除菌，备用。在超净工作台中，从现有的培养皿中切取含有根组织的一小块琼脂。用移液器吸取500 µL蔗糖溶液，滴加到含有豌豆幼苗的新制GA培养基平板上，然后将琼脂块置于蔗糖溶液上方。将培养物置于室温下、内衬铝箔的盒子中进行保存。为维持培养物，每八到九周需将线虫转接至新的GA平板上进行传代培养。线虫培养约八周后即可进行提取。在超净工作台中，使用无菌解剖刀将琼脂和根组织切成一厘米见方的小块。将琼脂块转移至铺有咖啡滤纸的漏斗中，并缓慢倒入蒸馏水润湿咖啡滤纸。将铺有咖啡滤纸的漏斗从烧杯中取出，向烧杯中加入蒸馏水，直至重新放回漏斗后，液面刚好接触滤纸底部。用铝箔覆盖装有咖啡滤纸的漏斗和烧杯。为收集线虫，取下装有咖啡滤纸的漏斗，并用移液器吸取收集烧杯中上层40毫升的水，注意不要扰动已沉淀的线虫。使用10毫升塑料刻度移液管将剩余液体收集至15毫升锥形离心管中。为准备检测板，将经高压灭菌的蒸馏水倒入无菌槽中，使用多通道移液器从槽中向平底96孔板的每个孔内加入40 µL蒸馏水。通过将金属针在96孔化学储存板中浸入三次，将化学品添加至检测板中，随后将金属针在检测板中转移十次。将样品点在清洁溶液前方的纸面上。为统计收集到的线虫数量，首先重新悬浮收集的样品，然后使用低吸附枪头吸取5 µL溶液，滴加到载玻片上。利用解剖显微镜计数5 µL溶液中的线虫数量。然后，使用无菌蒸馏水将浓度调整为每微升含两个线虫。接着，用多通道移液器和储液槽向96孔板的每个孔中加入10微升样品。用湿润的纸巾包裹96孔板，并将其放入盒中。然后，添加一张额外的湿润滤纸，以稳定并尽量减少培养板的移动，并将其固定在20°C、200 rpm的摇床培养箱中的粘性垫上。在第5天于解剖显微镜下观察培养板。计数DMSO溶剂对照组和药物处理孔中移动的和总的D. dipsaci数量。如果线虫不移动，向孔中加入两微升一摩尔的氢氧化钠，使其终浓度达到40毫摩尔，以刺激其运动。计算可移动线虫的比例。在D.dipsaci筛选中，重复实验中始终产生0%可移动线虫的孔被归类为强阳性结果。在60微摩尔浓度下筛选了三种不同的药物板，每种药物板均包含三个生物学重复。所有三个药物板均含有6%的DMSO溶剂对照。许多含有小分子文库药物的药物板中，未发现任何对D.dipsaci具有可观察生物活性的分子。一些培养皿中的结果完全可重复，而另一些含有已知杀线虫剂的培养皿则表现出不同的活性。误差线代表平均值的标准误差。此处，氟吡菌酰胺在该检测中表现出显著的活性。氟吡菌酰胺对D. dipsaci的活动性表现出明显的剂量依赖性效应，其EC50为9.3 µM。截至120 µM浓度，灭线磷对活动性无显著影响。截至120 µM浓度，灭线磷对活动性无显著影响。加入氢氧化钠提高了检测不动线虫的检测灵敏度。使用40毫摩尔的氢氧化钠作为检测终点，以刺激尚有活动能力的个体产生运动，从而区分处于静止状态的线虫与病态线虫。该方案已成功用于鉴定针对D.dipsaci及其他物种具有新颖作用机制的化合物。

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Biology

生物学

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培养与筛选植物寄生线虫 Ditylenchus dipsaci

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