Name: 用于同步光遗传学调制和电神经记录的光驱阵列 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: 了解用于同步光遗传学调制和电神经记录的LED光驱阵列系统。该技术利用表达channelrhodopsin-2的转基因小鼠模型，实现光刺激与神经信号采集的同步进行，为神经科学研究提供高效工具。

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本研究由融合技术研究计划（Convergent Technology R）资助。&amp;#38;D 计划（由韩国国家研究基金会（NRF）通过科学技术信息通信部资助，项目编号：NRF-2019M3C1B8090805）以及韩国国家研究基金会（NRF）由韩国政府（MSIT）资助的项目（编号：2019R1A2C1088909）提供支持。我们感谢韩国大田市韩国科学技术院（KAIST）生命科学系李承熙（Seung-Hee Lee）实验室慷慨提供转基因小鼠。

动物护理和手术程序已获得梨花女子大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准（编号：20-029）。
1. 光电极阵列的制备（图1 和 图2）
<ol>
	<li>连接带微透镜阵列的光纤。
	<ol>
		<li>去除光纤的钝化涂层，并使用精密光纤切割器将其切割成5 mm长的片段。</li>
		<li>将光纤浸入透明紫外固化树脂中，然后将其放置在微透镜阵列上。</li>
		<li>使用紫外灯固化树脂。</li>
		<li>使用环氧树脂将微透镜阵列固定到3D打印的外壳上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对齐聚四氟乙烯（PFA）涂层钨丝。
	<ol>
		<li>将4根30 mm长的PFA钨丝和1根银丝焊接到5针、1.27 mm间距的母连接器上。使用银丝作为参考电极。</li>
		<li>将1.27 mm间距的母连接器连接到前置放大器头级。</li>
		<li>小心地将钨丝穿过硅材料上的孔（图1B），以辅助钨电极的精细对准。</li>
		<li>将对齐后的钨丝剪短至比光纤长度短1 mm。</li>
		<li>使用环氧树脂将连接器固定到3D打印的外壳上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LED安装
	<ol>
		<li>将LED放置在3D打印的外壳中。</li>
		<li>将LED连接至生成脉宽调制（PWM）信号的驱动电路。 
		注意：PWM脉冲由微控制器生成。</li>
		<li>考虑到LED驱动电路引起的噪声，确保记录电极与LED驱动电路之间的距离为50 mm。</li>
		<li>使用光电二极管测量光纤末端的光强。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将钨电极和光纤浸入酒精中15分钟，然后将系统浸入无菌去离子水中，并用环氧乙烷气体进行灭菌。</li>
</ol>
2. 植入手术（图3 和 图4）
注意：手术过程中必须遵循无菌操作技术。
<ol>
	<li>制备转基因动物，这些动物经过基因改造，可在特定类型的神经元细胞中表达光敏感的视蛋白。 
	注意：一只2个月大的雄性转基因小鼠，在Ca中表达通道视紫红质-2（ChR2）2+本研究使用了钙调蛋白依赖性蛋白激酶II阳性神经元小鼠（CaMKIIα::ChR2小鼠）41.</li>
	<li>通过腹腔注射给予小鼠氯胺酮-赛拉嗪混合物（氯胺酮100 mg/kg，赛拉嗪10 mg/kg）进行麻醉。
	<ol>
		<li>每30分钟通过监测胡须运动及对足垫夹捏的反应来检查麻醉动物的状态。</li>
		<li>如果需要额外麻醉，可注射初始剂量一半的氯胺酮-赛拉嗪混合物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>剃除小鼠头部皮肤的毛发，将麻醉后的小鼠置于立体定位仪中。 
	注意：进行手术部位皮肤准备并覆盖手术巾。皮肤准备包括去除毛发，随后使用抗菌剂清洁皮肤。
	<ol>
		<li>将头部置于立体定位仪框架内，并将耳杆插入外耳道。</li>
		<li>在立体定位仪中通过反复松紧耳杆来精确调整，使小鼠头部居中。</li>
		<li>将切牙杆放置好，使上切牙钩住其前内侧边缘。</li>
		<li>调节切牙杆以设定其高度，并将鼻夹紧固在吻部。</li>
		<li>提前开启立体定位仪中嵌入的加热垫，以维持体温在 37 °C 在整个手术过程中。</li>
		<li>将温控探头插入小鼠直肠以维持恒温。 
		注意：必须通过轻轻握住并摆动吻部来检查耳杆的位置。如果吻部侧向移动超过约4 mm，则必须重新调整耳杆。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用凡士林覆盖眼睛（参见 材料表以防止干燥。</li>
	<li>在头皮内注射1%利多卡因。用镊子提起头部皮肤，固定注射空间，将利多卡因注射至头皮下方。</li>
	<li>使用手术刀和精细剪刀做矢状切口。用显微钳夹住切开的皮肤以扩大手术区域的视野。 
	注意：切口长度为 &lt;前囟上方1 cm及顶间骨的尾侧边缘。</li>
	<li>使用棉签去除骨膜。若出现出血，使用电凝器灼烧颅骨以封闭血管。</li>
	<li>用生理盐水清洁颅骨，并使用操纵臂标记开颅位置：海马体前后方向（AP）−1.8 至 −2.8 mm，内外侧方向（ML）0.5–2.5 mm，背腹方向（DV）−1 至 −2 mm。 
	注意：考虑到小鼠颅骨的厚度，将光探针阵列插入暴露的脑区下方 -1.2 至 -2.2 mm 处。由于海马通路的解剖结构，CA3 区的锥体细胞将其轴突投射至 CA1 区。因此，光学纤维比记录电极长 1 mm，以便将光学纤维置于 CA3 区，而记录电极置于 CA1 区。</li>
	<li>在小脑上方钻孔，并植入一根接地螺钉。使用精密螺钉将接地螺钉置入深度0.5 mm，直至到达小脑顶部。 
	注意：确保螺钉紧密插入，该螺钉将用作接地电极及支撑结构，以增强植入后的长期稳定性，因其可增加牙科水泥附着的三维表面积。</li>
	<li>钻孔标记区域，并用镊子取下一块颅骨。</li>
	<li>将26 G针头尖端顺时针弯曲 120°，通过将针头斜面朝上插入以暴露脑区。注意不要损伤脑组织和血管。</li>
	<li>用生理盐水清洗暴露的脑组织，以去除骨粉和其他异物。</li>
	<li>将光阵列固定在操纵臂上，并移近暴露区域。 
	注意：放置装置时，从前囟重新计算目标区域可提高放置的准确性。</li>
	<li>缓慢插入光探针阵列，并将接地螺钉连接到系统附带的银线上42. 
	注意：在此过程中，阵列必须牢固固定在操纵臂上，以最大限度减少晃动，防止插入过程中因微小移动造成脑组织损伤。插入操作必须缓慢进行，并在插入后留出10分钟的静置时间，以应对可能因插入压迫引起的脑组织肿胀。插入速度应低于 1 µm/s 进入脑组织有助于获得高质量的信噪比以及更多可分离的单个神经元信号42.</li>
	<li>如有出血，应用干燥棉签直接压迫出血部位止血，或使用电灼法。必须待出血完全停止后，方可进行后续步骤。</li>
	<li>在暴露的大脑与装置之间插入明胶海绵，以防止化学物质直接接触脑组织。 
	注意：凝胶泡沫还有助于止血并保持脑组织湿润。</li>
	<li>用棉签擦拭颅骨，尽可能去除水分，然后进行下一步固定操作。</li>
	<li>仔细将牙科水泥涂抹于颅骨上以固定装置并覆盖明胶海绵。在牙科水泥完全硬化前，若头皮与牙科水泥粘连，应将其分离。使用镊子牵拉切开的皮肤以覆盖已硬化的牙科水泥，并缝合头皮。随后，将装置从操纵臂上松解。 
	注意：确保牙科水泥不接触皮肤，仅覆盖颅骨区域。当皮肤生长时，可能会将水泥推开，最终导致装置脱落。这将对长期实验造成严重问题 体内 实验。</li>
</ol>
3. 植入物取出与护理
<ol>
	<li>将小鼠从立体定位仪中取出。</li>
	<li>使用26 G针头注射卡洛芬溶液。手术前注射一次，并在术后12小时（若为下午手术，则于次日上午）和24小时再次注射，以减轻疼痛。 
	注意：药品瓶中浓度为50 mg/mL，储存于4 °C。卡洛芬具有黏性，需用无菌水按1:10比例稀释。若保持无菌状态，稀释后溶液可保存最多4周。为维持药物有效作用时间，应每隔12小时注射一次卡洛芬溶液。</li>
	<li>将小鼠置于加热垫上，并观察其从麻醉状态恢复情况。 
	注意：在动物恢复足够意识之前，不得将其单独留置。</li>
	<li>术后7–10天拆除缝合线。</li>
	<li>让动物恢复1周时间。在此期间监测其食物和水的摄入情况。给予镇痛剂，并观察是否存在不适或疼痛的迹象。 
	注意：术后动物在完全恢复前不得与其他动物同笼饲养。
	<ol>
		<li>恢复期间，每天称量小鼠体重以监测体重变化。若体重较同龄同性别对照动物减少20%，则处死小鼠（参见第6节）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 光遗传学刺激与电生理记录
<ol>
	<li>麻醉小鼠，并将麻醉后的小鼠固定于立体定位仪中。</li>
	<li>设置刺激参数。
	<ol>
		<li>将光脉冲程序设置为4%占空比和10 Hz频率43。在神经信号记录期间进行持续2 s（20个脉冲）的光刺激。</li>
		<li>使用50 mA电流驱动，使光纤尖端的光强达到3 mW/mm2。使用光电二极管和功率计测量光功率，并将光功率除以光纤端面面积以计算光强。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取下塑料保护盖，安装包含光传递系统的上部组件，该组件带有可重复使用的LED和电路。</li>
	<li>将头戴式前置放大器连接至植入的5针连接器。</li>
	<li>打开软件以记录神经信号。</li>
	<li>设置软件滤波器。使用0.1–20 kHz的带通滤波器和60 Hz的陷波滤波器。将放大器采样率设置为20 kHz。</li>
	<li>在记录前，检查是否检测到神经峰电位信号。 
	注意：噪声消除至关重要，因为神经信号非常微弱。如果噪声水平过高，神经信号可能被噪声掩盖而无法识别。应采用适当的接地和电磁屏蔽措施以降低噪声。</li>
	<li>完成信号检查后，先在无光刺激条件下记录神经信号，作为基线数据。</li>
	<li>给予LED光照，同时记录神经元反应（图5 和 图6）。 
	​注意：每次刺激后，必须间隔至少5分钟再进行下一次刺激实验，以避免前一次刺激诱发的神经元活动对后续实验造成影响。</li>
</ol>
5. 数据分析
<ol>
	<li>使用 MATLAB 程序加载采集的数据。</li>
	<li>使用“Wave-Clus”尖峰分类算法获取单个神经元活动44,45。通过幅度阈值检测每个通道中的尖峰信号，如公式（1）所示45。 
	阈值 = 5 × median <img alt="数学表达式插图中的分数公式 |x|/0.6745。" src="/files/ftp_upload/63460/63460eq01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 1"> （1） 
	​其中 x 为带通滤波后的信号。
	<ol>
		<li>如需安装“Wave-Clus”，请参见材料表中的下载链接。</li>
		<li>在 MATLAB 命令行窗口中输入 wave_clus，以打开图形用户界面（GUI）。</li>
		<li>对于准备用于尖峰检测的文件扩展名，输入Get_spikes('filename.ext')函数，然后运行Do_clustering('filename_spikes.mat')进行尖峰分类。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在光刺激前、刺激期间和刺激后，使用特定的时间区间对已分类的尖峰进行计数。分析时采用 0.2 s 和 2 s 的时间区间。</li>
	<li>绘制每个记录通道的尖峰数量。 
	​注：对 8 次重复实验结果的数据计算其均值及均值标准误（SEM），并进行绘图。</li>
</ol>
6. 安乐死
<ol>
	<li>所有实验结束后，通过吸入二氧化碳（CO2）处死小鼠。</li>
	<li>将小鼠放入透明的安乐死舱内，不要预先充入气体，并确保无 CO2 供应和/或泄漏。</li>
	<li>打开 CO2 气体，以每分钟置换安乐死舱空气体积的 30 - 50% 的速率进行置换。 
	注意：必须将流量计连接至 CO2 气瓶，以确保空气置换速率为每分钟安乐死舱体积的 30-50%。</li>
	<li>观察小鼠是否停止呼吸以及眼球颜色是否改变。 
	注意：通常安乐死所需时间在 10 至 15 分钟内。</li>
	<li>观察到死亡征象后，将小鼠从安乐死舱中取出。</li>
	<li>为完成安乐死程序，需确认呼吸和心跳停止以验证死亡。</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

已验证该系统在同步进行光遗传学刺激和电生理记录方面的可行性（图6）。光刺激期间出现的大尖峰为光电伪迹，其发生时间与光刺激同步（图6A）。在红色虚线框内波形的放大视图中可清晰观察到这一现象（图6A）。如图6A所示，光电伪迹可从记录的波形中明显区分出来，且由光遗传学刺激海马信号通路所诱发的神经元反应也被清晰识别。图6B、C展示了脉冲数量，清楚地反映了刺激效果。图6A是用于生成图6B、C中直方图的波形之一，因为记录结果来自8次重复记录实验。
图6A ...

记录和控制神经活动对于理解大脑在神经网络层面和细胞层面的功能至关重要。传统的电生理记录方法包括使用微移液管的膜片钳技术1,2,3,4，以及使用微神经电极的细胞外记录技术5,6,7,8。作为一种神经调节方法，电刺激常用于通过直接或间接去极化神经元细胞来直接刺激特定脑区。然而，由于电流会向各个方向扩散，电学方法无法区分用于记录或刺激的神经元细胞类型。
作为一种新兴技术，光遗传学为理解神经系统的工作机制开辟了新时代9,10,11,12,13,14,15,16。光遗传学技术的核心是利用光来控制经基因改造细胞所表达的光敏视蛋白的活性。因此，光遗传学能够在复杂的神经回路中对特定基因选择的细胞进行精细的调控或监测14,17。随着光遗传学方法的广泛应用，需要同步进行神经记录以直接验证光学神经调控的效果。因此，集成了光刺激与记录功能的一体化装置将极具价值16,18,19,20,21,22,23,24,25。
传统的基于激光的光遗传学刺激存在局限性，其需要庞大且昂贵的光递送系统26,27,28,29,30。因此，一些研究团队采用基于µLED的硅探针以缩小光递送系统的尺寸31,32,33,34。然而，由于LED的能量转换效率较低，µLED直接接触可能导致脑组织热损伤。为避免热损伤，已采用光波导（如光纤、SU-8和氮氧化硅（SiON））进行光传输30,35,36,37,38,39。然而，该策略也存在缺陷，即光源与波导之间的耦合效率较低。
微透镜阵列此前已被引入，用于提高LED与光纤之间的光耦合效率40。一种基于微机电系统（MEMS）技术的光探针系统已被开发，用于实现微尺度上的光学刺激与电生理记录40。在LED与光纤之间加入微透镜阵列后，光效率提高了3.13 dB。如图1所示，一个2×2光纤阵列与一个4×4微透镜阵列对齐，LED位于微透镜阵列下方。为减少对脑组织的损伤，仅安装了2×2光纤而非4×4阵列。钨电极阵列通过硅通孔紧邻光探针阵列放置，用于电生理信号记录（图1B）。
该系统由顶部一次性部件和可拆卸的底部部件组成。顶部一次性部件包含光纤阵列、微透镜阵列和钨电极阵列，专为体内实验而设计，可永久植入大脑。底部部件包括一个LED光源和外部电源线，可轻松拆卸并重复用于其他动物实验。当可拆卸部件被移除时，一个可附加的塑料盖可保护一次性部件。
通过将系统植入在Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II阳性神经元中表达通道视紫红质-2（ChR2）的转基因小鼠（CaMKIIα::ChR2小鼠）脑内，验证了该系统的可行性。在对神经元进行光刺激期间，使用记录电极采集单个神经元的神经活动。

<table><tbody><tr><td>5针连接器</td><td>NW3</td><td>HD127K</td><td>1.27 mm (.050&quot;) 间距</td></tr><tr><td>Bovie</td><td>精细科学工具公司（Fine Science Tools, F.S.T）</td><td>18010-00</td><td>高温电凝套件</td></tr><tr><td>数据采集软件</td><td>Intan Technologies, LLC</td><td>USB接口板软件</td><td>与RHD USB接口板配合使用</td></tr><tr><td>牙科水泥</td><td>Lang Dental Manufacturing Company, Inc.</td><td>1223CLR</td><td>使用Jet义齿修复包中的Jet液体和粉末</td></tr><tr><td>数字操纵臂</td><td>Stoelting Co.</td><td>51904/51906</td><td>左侧、右侧各一个数字操纵臂，三轴，附加组件</td></tr><tr><td>明胶海绵</td><td>Cutanplast</td><td>标准规格（70×50×10 mm）</td><td>无菌可再吸收明胶海绵，具有止血作用</td></tr><tr><td>前置放大器头级</td><td>Intan Technologies, LLC</td><td>#C3314</td><td>RHD 16通道记录头级</td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Stoelting Co.</td><td>53800R</td><td>Stoelting啮齿类动物保温仪X1配大鼠加热垫</td></tr><tr><td>LED</td><td>OSLON</td><td>GB CS8PM1.13</td><td>&amp;lambda; 典型值 470 nm，视角 80 &amp;deg;，正向电压 2.85 V</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks, Inc.</td><td>R2019a</td><td></td></tr><tr><td>微型夹钳</td><td>SURGIWAY</td><td>12-1002-04</td><td>直型，Serre-fine DIEFFENBACH 直钳 3.5 cm</td></tr><tr><td>光纤</td><td>Thorlabs, Inc.</td><td>FT200UMT</td><td>数值孔径0.39，&amp;Oslash; 200 &amp;micro;m 芯径多模光纤，高OH含量，适用于300–1200 nm波长</td></tr><tr><td>聚对二甲苯涂层钨丝</td><td>A-M System</td><td>定制订购</td><td>杆状，&amp;Oslash; 101.6 &amp;mu;m (.004&quot;）</td></tr><tr><td>光电二极管</td><td>Thorlabs</td><td>S121C</td><td></td></tr><tr><td>功率计</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>精密光纤切割器</td><td>FITEL</td><td>S326</td><td>光纤切片工具</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td>5.01版本</td><td></td></tr><tr><td>手术刀</td><td>Feather&amp;trade;</td><td>#20</td><td>配100 mm长刀柄的手术刀片</td></tr><tr><td>螺丝</td><td>Nasa Korea</td><td>不锈钢</td><td>直径：1.2 mm，长度：3 mm</td></tr><tr><td>银丝</td><td>The Nilaco Corporation</td><td>AG-401265</td><td>&amp;Oslash; 200 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>立体定位仪框架</td><td>Stoelting Co.</td><td>51500D</td><td>数字新型标准立体定位仪，适用于大鼠和小鼠</td></tr><tr><td>缝合线</td><td>ETHICON</td><td>W9106</td><td>缝合线规格：4-0，长度：75 cm，线径：4-0</td></tr><tr><td>凡士林</td><td>Unilever PLC</td><td>原装</td><td>100%纯石油冻</td></tr><tr><td>Wave_Clus</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>https://github.com/csn-le/wave_clus</td></tr></tbody></table>

用于光遗传学调控与神经电生理记录同步进行的光极阵列

Optrode Array for Simultaneous Optogenetic Modulation and Electrical Neural Recording

在过去的十年中，由于光遗传学具有选择性神经调节或监测的独特能力，它已成为研究神经信号传导的一项重要工具。通过基因改造，特定类型的神经元细胞可表达视蛋白，从而实现对选定神经元的光学刺激或抑制。在光遗传学的光学系统方面，已有多项技术进步。最近，有研究提出将用于光传递的光波导与电生理记录相结合，以同时监测神经元对光遗传学刺激或抑制的反应。在本研究中，开发了一种植入式光探针阵列（2×2 光纤），其集成了多通道电极。
采用发光二极管（LED）作为光源，并集成微加工的微透镜阵列，以在光纤末端提供足够的光功率。光探针阵列系统包括一次性部分和可重复使用部分。一次性部分包含光纤和电极，而可重复使用部分包含LED以及用于光控制和神经信号处理的电子电路。随附视频中介绍了新型可植入光探针阵列系统的设计，以及光探针植入手术、光遗传学光刺激和电生理神经记录的操作流程。体内实验结果成功展示了由光刺激诱发的小鼠海马兴奋性神经元产生的时间锁定神经放电。

成功制备了光遗传电极系统，可提供足够的光功率以激活目标神经元。通过微加工硅片上的通孔，实现了钨电极的精确定位。当施加50 mA电流时，测得光纤端面的光强为3.6 mW/mm2。微透镜使光效率提高了3.13 dB。由于微透镜阵列增强了光耦合效率，所需施加的电流约为不使用微透镜阵列系统时达到相同光强所需电流的一半。由于LED在电流增大时会产生更多热量，因此采用微透镜阵列以降低器件热负荷具有明显优势。4个电极在1 kHz频率下的平均阻抗为71.39 kΩ，该值足够低，可用于动作电位的检测。此外，该光遗传电极阵列由一次性使用部分和可重复使用部分组成，以降低成本并减轻植入总重量。一次性使用部分的重量约为0.58 g。
使用 CaMKIIα::ChR2 小鼠直接刺激表达 ChR2 的神经元，并成功记录到诱发的神经放电，如图所示 图6我们展示了在精确条件下记录的完整波形，包括中间2秒的光照期（图6A）。使用定制的 MATLAB 源代码对原始数据信号进行分选...

本文介绍了用于光传递的光纤和用于神经记录的电极阵列组成的光遗传探针系统的制备方法。体内实验利用表达通道视紫红质-2的转基因小鼠，验证了该系统实现光遗传学刺激与电生理记录同步进行的可行性。

在过去的十年中，光遗传学因其能够选择性地调控神经活动的独特能力，已成为研究神经信号传导不可或缺的工具。

本方案包括构建一种用于同步进行光遗传学刺激和电生理记录的光探针系统。该基于LED的系统通过微透镜阵列提高了光耦合效率。与激光光源相比，LED光源具有更简单的照明设置，因此该系统可便捷地应用于无线系统。光遗传学是一种用于理解神经系统疾病病理及治疗机制的前沿技术。光遗传学可应用于治疗脊髓损伤、癫痫、帕金森病和阿尔茨海默病。我们的基于LED的设备可进一步开发为无线系统，具有系统复杂度低、成本效益高和功耗低等多项优势。首先，将1.27毫米间距的母接头连接到头级前置放大器上。将LED放入3D打印的外壳中。使用光电二极管测量光纤尖端末端的光强度。将钨电极和光纤浸入酒精中15分钟，随后自然晾干。剃除小鼠头部皮肤的毛发，将麻醉后的小鼠置于立体定位仪中。调整小鼠头部在立体定位仪中的位置，并将耳杆插入外耳道。打开立体定位仪框架中嵌入的加热垫，并在整个手术过程中将体温维持在37摄氏度。调节切口杆以设定其高度，并将鼻夹紧固在鼻部。用凡士林覆盖眼睛以防止干燥。用镊子提起头部皮肤，固定注射位置，在头皮下注射1%利多卡因。使用手术刀和精细剪刀做矢状切口。用微型钳夹住切开的皮肤，以扩大手术区域的视野。使用棉签去除骨膜。如果出现出血，使用电凝器灼烧颅骨以封闭血管。用生理盐水清洁颅骨，并使用操纵臂标记开颅位置。在小脑上方钻孔，并植入接地用的螺钉。使用精密螺钉，将接地螺钉旋入0.5毫米深，直至到达小脑顶部。在标记区域钻孔，并用镊子移除一块颅骨。将26号针头尖端顺时针弯曲成120度角，并将针头斜面朝上插入以暴露脑区。将光探针阵列固定在操纵臂上，并移至暴露区域附近。缓慢插入光探针阵列，并将接地螺钉连接至系统附带的银丝上。在暴露的大脑与装置之间插入凝胶泡沫，以防止化学物质直接接触脑组织。将牙科水泥小心地涂抹于颅骨上，以固定装置并覆盖凝胶泡沫。在牙科水泥完全硬化之前，若头皮与牙科水泥粘连，应将其分离。用镊子牵拉切开的皮肤以覆盖固化的牙科水泥，并缝合头皮。将麻醉后的小鼠置于立体定位仪中。将光脉冲参数设置为10赫兹频率、4%占空比。在神经信号记录期间设置持续两秒的光刺激。取下塑料盖，将带有可重复使用LED的光传递系统上部与电路连接。将头戴式前置放大器连接到植入的五针连接器。打开软件并设置软件滤波器。接着，点击并设置放大器采样率。然后点击更改带宽。设置放大器的下限带宽和放大器的上限带宽。启用软件 DAC 高通滤波器。打开 Spike Scope，并通过电压阈值检查神经信号。单击停止并记录。使用 MATLAB 加载采集的数据并检查原始数据，然后运行包含 wave clust 算法的 spike sorting 代码。在列阵图中检查已分类的尖峰。现在绘制尖峰计数图，并检查光刺激期间诱发的尖峰。该图显示了完整的记录波形及确切条件，包括中间持续两秒的光照时段。与基线相比，在每次光刺激脉冲后，以2秒和0.2秒两种不同时间窗统计的诱发单个神经放电数量显著增加。该图显示了每个通道在光刺激前、刺激期间和刺激后的脉冲放电直方图。插图显示了植入式光探针阵列的位置。此外，放大图显示了时间分辨率为100毫秒的脉冲发放直方图。蓝色条表示LED光源开启以记录反应的时间段。为最小化LED驱动电流过程带来的伪迹噪声，系统设计时应确保电信号通路与LED电路之间有足够的距离。所提出的基于LED的光遗传电极系统能够研究与动物行为相关的多种神经信号，因为它可传递光遗传刺激并记录诱发的神经反应。LED光遗传电极阵列与无线光遗传接口兼容，可用于自由活动动物的研究。

optrode-array-for-simultaneous-optogenetic-modulation-electrical

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

用于同步光遗传学调制和电神经记录的光驱阵列

本文描述了一种在监测脑电图、肌电图和脑乳酸浓度的同时，利用光遗传学方法调控大脑皮层锥体神经元活性的实验方案。实验记录在带有电缆束缚的小鼠上进行，小鼠处于自然的睡眠/觉醒周期过程中。光遗传学设备由本实验室自行组装，记录设备为 commercially...

同步进行啮齿类动物大脑皮层的脑电图记录、乳酸浓度实时测量与光遗传学神经元活动操控

本视频介绍了一种同时对含有神经元特异性荧光蛋白的转基因脑片进行成像和记录电活动的方法。该方法包括将脑片置于灌流室中，并用充氧的人工脑脊液维持；使用光源激发荧光标记的细胞；并通过多通道探针和膜片钳技术记录电信号。...

脑切片中神经元细胞的同步光学与电生理监测

本视频展示了通过光遗传学刺激内侧前额叶皮层（mPFC）轴突并记录外侧内嗅皮层（LEC）锥体神经元的反应，来研究外侧内嗅皮层（LEC）突触效能的实验方法。该方法结合膜片钳记录与光刺激诱导的突触激活，用于研究突触可塑性。...

光遗传学刺激与大鼠脑片突触事件的电生理记录

神经科学领域近期发展出了一种结合遗传学与光学技术的工具，称为“光遗传学”，该技术能够以前所未有的空间和时间分辨率调控神经环路的活动。本文提供了一种整合光遗传学 体内...

一种用于活体中高保真光遗传学控制单个锥体神经元的方法 in vivo

不同的电极涂层通过改变电化学、化学和机械特性来影响神经记录性能。体外电极的比较相对简单，但体内响应的比较通常因电极与神经元之间的距离差异以及个体动物间的差异而变得复杂。本文提供了一种可靠的神经记录电极比较方法。...

一种系统性电化学与电生理评估神经记录电极的方法

光遗传学已成为行为神经科学研究中的一种强大工具。本方案提供了激光系统设计与搭建的逐步指南，并给出了进行多重且同步实验操作的完整方案 体内...

in vivo 光遗传学刺激啮齿类动物中枢神经系统

本文介绍了我们在麻醉小鼠皮层中从已鉴定的抑制性中间神经元获取稳定且分离良好的单细胞单位记录的策略。表达ChR2的神经元通过其对蓝光的反应来识别。该方法使用标准的细胞外记录设备，是钙成像或视觉引导膜片钳技术的一种经济替代方案。...

光遗传学鉴定皮层抑制性中间神经元的体内单细胞记录指南

本研究介绍了一种使用定制玻璃光导电极在清醒小鼠中可靠地进行光遗传学单细胞记录的方法。...

清醒小鼠中使用玻璃光导电极进行光遗传学鉴定神经元类型

我们开发了一种简化且经济高效的电极制备方法，并在自由活动的小鼠中实现了多个脑区信号的记录。结合光遗传学、多脑区电生理记录和钙信号记录，揭示了癫痫点燃模型中跨脑区的神经元活动特征。...

一种用于多区域体内记录的灵活便捷电生理光导电极的集成制备方法

本文介绍了在大鼠和小鼠中进行高密度微电皮层记录（µEcoG）的两种方案，包括手术、植入和记录方法。µEcoG记录分别与大鼠听觉皮层的层状多通道电极记录或小鼠体感皮层的光遗传学神经活动操控相结合进行。...

通过整合层状多通道电极、光遗传学与微阵列皮层电图在啮齿类动物中进行皮层处理的多尺度研究

本方案提供了一种整合性方法，包括病毒递送、光探针植入、光血栓诱导、星形胶质细胞与神经元活动的同步记录，以及星形胶质细胞的光遗传学刺激。该整合性方法旨在对缺血性脑卒中从急性期到慢性期各个阶段的星形胶质细胞-神经元相互关系进行同步研究。...

一种用于光栓法脑卒中建模的整合方法 在体 内 行为小鼠中神经元和星形胶质细胞活动的光探针记录

了解用于同步光遗传学调制和电神经记录的LED光驱阵列系统。该技术利用表达channelrhodopsin-2的转基因小鼠模型，实现光刺激与神经信号采集的同步进行，为神经科学研究提供高效工具。

用于光遗传学调控与神经电生理记录同步进行的光极阵列

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