Name: 用于组织诊断的小鼠脑实时双色受激拉曼散射成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-01T14:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: 学习使用受激拉曼散射显微镜对小鼠脑组织进行实时双色成像的无标记诊断技术。该方法无需组织处理和染色即可快速生成伪苏木精-伊红图像，适用于神经科学研究中的快速组织学分析。

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本研究由美国国立卫生研究院（NIH）R35 GM133435 项目资助，受资助者为 D.F.。

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<li>Kong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+a+rapidly+tunable+optical+parametric+oscillator%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Multicolor stimulated Raman scattering microscopy with a rapidly tunable optical parametric oscillator.</a> Optics Letters. 38, 145-147 (2013).</li>
<li>He, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-phase+stimulated+Raman+scattering+microscopy+for+real-time+two-color+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Optica%22%5BJournal%5D)">Dual-phase stimulated Raman scattering microscopy for real-time two-color imaging.</a> Optica. 4 (1), 44-47 (2017).</li>
<li>Pence, I. J., Kuzma, B. A., Brinkmann, M., Hellwig, T., Evans, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-window+sparse+spectral+sampling+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Multi-window sparse spectral sampling stimulated Raman scattering microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 12 (10), 6095-6114 (2021).</li>
<li>Wei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+chemical+imaging+by+clearing-enhanced+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (14), 6608-6617 (2019).</li>
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</ol>

作者声明不存在利益冲突。

本方案中介绍的双色SRS成像技术依赖于单色SRS成像的正确实施。在单色SRS成像中，关键步骤包括空间对准、时间对准、调制深度和相位偏移。两束光的空间合并通过二向色镜实现。在将光束导向二向色镜时，使用多个转向镜进行精细调节。一旦光束通过二向色镜合并，可通过用一面镜子分出合并后的光路并投射到墙面来确认空间对准情况 &#62;1 米处，同时检查合束是否与红外卡重叠。通过显微镜完成空间对准后，利用基于后向反射镜的延迟平台调节光程长度，实现时间重叠，该方法的优势在于可保持空间对准不变。本方案中，1,040 nm 光臂为延迟光束。若延迟平台的调节范围不足以使两束光在时间上重叠，则无法实现时间重叠。此时，可能需要将整个延迟平台移至不同位置，以确保时间重叠点位于延迟扫描范围的中部附近。例如，若测得两束光之间的时间差为 6 ns，则需要进行 1.8 米的调节。该调节量表示对较快光束的光路进行延长，或对较慢光束的光路进行缩短的长度。
除了光束对准之外，斯托克斯（Stokes）光束的光斑尺寸匹配和调制也对最大化受激拉曼散射（SRS）信号至关重要。理想情况下，两束光均应在物镜平面处准直，并与物镜后光阑的尺...

传统的组织学诊断依赖于染色方案，随后在光学显微镜下进行观察。病理学家常用的一种染色方法是H&amp;#38;E染色：苏木精将细胞核染成紫蓝色，伊红则将细胞外基质和细胞质染成粉红色。这种简单的染色方法至今仍是多种组织学诊断（尤其是癌症诊断）的金标准。然而，H&amp;#38;E组织病理学检查，特别是在术中环境下使用的冰冻切片技术，仍存在局限性。染色过程繁琐，涉及组织包埋、切片、固定和染色等多个步骤1。通常需要20分钟或更长的周转时间。在术中进行冰冻切片H&amp;#38;E染色时，若需同时处理多个切片，由于必须评估细胞特征或生长模式的三维结构以判断切缘情况，操作可能变得更加困难。此外，术中组织学技术依赖于熟练的技术人员和临床医生。许多医院中具备资质认证的病理学家数量有限，这在很大程度上限制了术中会诊的实施。随着数字病理学和基于人工智能的诊断技术的快速发展，这些限制有望得到缓解2。然而，H&amp;#38;E染色结果具有变异性，其质量依赖于技术人员的经验，这为基于计算机的诊断带来了额外挑战2。
这些挑战有望通过无标记光学成像技术得到解决。其中一种技术是受激拉曼散射（SRS）显微成像。SRS利用同步脉冲激光——泵浦光和斯托克斯光——高效激发分子振动3。近期研究表明，对蛋白质和脂质进行SRS成像可直接在未经处理的新鲜组织上生成与苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色相当的图像（也称为受激拉曼组织学，SRH），无需任何组织处理步骤，显著缩短诊断所需时间，并已成功应用于术中环境4。此外，SRS成像能够提供三维图像，在二维图像信息不足时为诊断提供更多依据5。SRH具有无偏性，可生成便于计算机辅助诊断的数字图像，正迅速成为术中癌症诊断和肿瘤边界分析的潜在解决方案，尤其在脑癌诊疗中表现突出6,7,8。最近的研究还提示，对组织化学变化进行SRS成像亦可提供有价值的诊断信息，有助于临床医生进一步区分不同类型的癌症或判断其发展阶段9。
尽管受激拉曼散射（SRS）成像在组织诊断应用中具有巨大潜力，但由于成像平台结构复杂，目前主要局限于光学专业领域的学术实验室。该平台包括超快激光器、激光扫描显微镜以及复杂的检测电子系统。本实验方案详细描述了如何利用一种常见的飞秒激光光源，对小鼠脑组织进行实时双色SRS成像，并生成类似苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色的伪彩图像。本方案涵盖以下操作步骤：
准直与啁啾优化 
大多数受激拉曼散射（SRS）成像方案使用皮秒或飞秒激光器作为激发光源。在使用飞秒激光器时，其激光带宽远大于拉曼谱线宽度。为克服这一限制，通常采用光谱聚焦方法，将飞秒激光啁啾展宽至皮秒时间尺度，以实现窄的光谱分辨率10。只有当泵浦光和斯托克斯光的群延迟色散（也称为时间啁啾或简称色散）被精确匹配时，才能获得最佳光谱分辨率。本文演示了利用高色散玻璃棒对激光束进行准直以及优化其色散特性的操作流程和具体步骤。
频率校准 
谱聚焦受激拉曼散射（SRS）的一个优势在于，通过改变泵浦光与斯托克斯光激光之间的时间延迟，即可快速调节拉曼激发频率。与调节激光波长相比，这种调谐方式可实现更快的成像速度和更可靠的光谱采集。然而，激发频率与时间延迟之间的线性关系需要进行外部校准。通常使用已知拉曼峰的有机溶剂对谱聚焦SRS的拉曼频率进行校准。
实时双色成像 
在组织诊断应用中，提高成像速度对于缩短分析大尺寸组织样本所需的时间至关重要。同时对脂质和蛋白质进行双色受激拉曼散射（SRS）成像，无需调节激光波长或时间延迟，可使成像速度提高两倍以上。该技术通过采用一种新颖的正交调制方法，并结合锁相放大器进行双通道解调来实现11。本文描述了正交调制与双通道图像采集的实验方案。
反射式SRS成像 
迄今为止展示的大多数SRS成像均采用透射模式进行。反射式（epi-mode）成像则通过检测组织返回散射的光子12。在病理学应用中，手术标本可能相当大。对于透射式成像，通常需要对组织进行切片，这会不必要地增加额外时间。相比之下，反射式成像可以直接用于完整的手术标本。由于使用同一物镜收集背向散射光，因此也无需为透射式成像所必需的高数值孔径聚光镜进行对准。当组织难以切片时（例如骨组织），反射式成像是唯一可行的选择。我们此前已证明，对于脑组织，当组织厚度&#62; 2 mm时，反射式成像可提供更优的成像质量13。本方案采用偏振分束器（PBS）来收集因组织作用而发生去偏振的散射光子。虽然使用环形探测器可收集更多光子，但会增加定制探测器组件的复杂性12。相比之下，PBS方法实现更为简便（类似于荧光检测），且可直接使用透射模式检测中已有的标准光电二极管。
伪H&amp;#38;E图像生成 
在采集双色SRS图像后，可通过重新着色以模拟H&amp;#38;E染色效果。本文展示了将脂质和蛋白质SRS图像转换为用于病理学应用的伪H&amp;#38;E SRS图像的流程。实验方案详细说明了生成高质量SRS图像所需的关键步骤。此处所示方法不仅适用于组织诊断，还可拓展应用于其他多种高光谱SRS成像领域，如药物成像和代谢成像14,15。
通用系统要求 
本实验方案所用的激光系统必须能够输出两束同步的飞秒激光。理想情况下，系统应配备光学参量振荡器（OPO），以实现其中一束激光波长的宽范围调谐。本方案中采用的实验装置使用商用激光系统 Insight DS+，可输出两束激光（一束固定波长为 1,040 nm，另一束基于 OPO 可调谐，波长范围为 680 至 1,300 nm），重复频率为 80 MHz。可用于受激拉曼散射（SRS）成像的激光扫描显微镜既可来自主流显微镜厂商，也可为自行搭建。本实验所用显微镜是在商用正置显微镜框架基础上构建的正置式激光扫描显微镜。采用一对 5 mm 振镜（galvo mirrors）对激光束进行扫描。对于选择自行搭建激光扫描显微镜的用户，可参考先前发表的激光扫描显微镜构建方案16。

<table><tbody><tr><td>100 毫米消色差透镜</td><td>THORLABS</td><td>AC254-100-B</td><td>宽带，650 - 1,050 纳米，消色差透镜焦距，100 毫米</td></tr><tr><td>20 兆赫带通滤波器</td><td>Minicircuits</td><td>BBP-21.4+</td><td>集总LC带通滤波器，19.2 - 23.6 兆赫，50 &amp;Omega;</td></tr><tr><td>200 毫米消色差透镜</td><td>THORLABS</td><td>AC254-200-B</td><td>宽带，650 - 1,050 纳米，消色差透镜焦距，200 毫米</td></tr><tr><td>消色差半波片</td><td>Union Optic</td><td>WPA2210-650-1100-M25.4</td><td>宽带半波片</td></tr><tr><td>消色差四分之一波片</td><td>Union Optic</td><td>WPA4210-650-1100-M25.4</td><td>宽带四分之一波片</td></tr><tr><td>光束取样器</td><td>THORLABS</td><td>BSN11</td><td>10:90 板式分束器</td></tr><tr><td>二向色镜</td><td>THORLABS</td><td>DMSP1000</td><td>可使用其他中心波长约为 1,000 纳米的二向色镜。</td></tr><tr><td>DMSO（二甲基亚砜）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>472301</td><td>用于拉曼位移校准的溶剂。也可使用其他具有已知拉曼峰的溶剂。</td></tr><tr><td>电光幅度调制器</td><td>THORLABS</td><td>EO-AM-NR-C1</td><td>正交调制和双通道成像需要两个电光调制器。建议使用谐振版本，以便使用较低的驱动电压。</td></tr><tr><td>假H&amp;E染色脚本</td><td>Matlab</td><td></td><td>https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining</td></tr><tr><td>扇出缓冲器</td><td>PRL-414B</td><td>Pulse Research Lab</td><td>1:4 TTL/CMOS扇出缓冲器和线路驱动器，用于生成电光调制器驱动频率及锁相参考信号</td></tr><tr><td>快速光电二极管</td><td>THORLABS</td><td>DET10A2</td><td>硅探测器，1 纳秒上升时间</td></tr><tr><td>频率分频器</td><td>PRL-220A</td><td>Pulse Research Lab</td><td>TTL频率分频器（f/2, f/4, f/8, f/16），用于从激光输出生成20兆赫信号。</td></tr><tr><td>高色散玻璃棒</td><td>Union Optic</td><td>CYLROD01</td><td>高色散H-ZF52A棒状透镜120毫米，SF11棒状透镜100毫米</td></tr><tr><td>Insight DS+</td><td>Newport</td><td></td><td>激光系统，可输出两束同步脉冲激光（一束固定波长为1,040纳米，另一束可调谐，波长范围为680-1,300纳米），重复频率为80兆赫。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>锁相放大器</td><td>Liquid Instruments</td><td>Moku Lab</td><td>用于从光电二极管中提取SRS信号的锁相放大器。也可使用Zurich Instrument HF2LI或类似仪器。</td></tr><tr><td>反射镜</td><td>THORLABS</td><td>BB05-E03-10</td><td>宽带介质反射镜，750 - 1,100 纳米。也可使用银镜。</td></tr><tr><td>电动延迟台</td><td>Zaber</td><td>X-DMQ12P-DE52</td><td>用于精细控制泵浦光与斯托克斯光激光时间重叠的延迟台。其他任何电动平台也可使用。</td></tr><tr><td>油浸式聚光镜</td><td>Nikon</td><td>CSC1003</td><td>1.4 数值孔径。也可使用数值孔径&gt;1.2 的其他聚光镜。</td></tr><tr><td>示波器</td><td>Tektronix</td><td>TDS7054</td><td>任何带宽为400兆赫或更高的其他示波器均可使用。</td></tr><tr><td>相位移器</td><td>SigaTek</td><td>SF50A2</td><td>用于调节调制频率的相位</td></tr><tr><td>光电二极管</td><td>Hamamatsu Corp</td><td>S3994-01</td><td>大面积硅PIN二极管（10 x 10 厘米&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;）。也可使用其他大面积且低电容的二极管。</td></tr><tr><td>偏振分束器</td><td>Union Optic</td><td>PBS9025-620-1000</td><td>宽带偏振分束器</td></tr><tr><td>折射率数据库</td><td></td><td></td><td>refractiveindex.info</td></tr><tr><td>后向反射器</td><td>Edmund Optics</td><td>34-408</td><td>宽带增透膜直角棱镜。也可使用其他棱镜或后向反射器。</td></tr><tr><td>射频功率放大器</td><td>Minicircuits</td><td>ZHL-1-2W+</td><td>增益模块，5 - 500 兆赫，50 &amp;Omega;</td></tr><tr><td>扫描反射镜</td><td>Cambridge Technologies</td><td>6215H</td><td>我们使用了一组镀银的5毫米反射镜</td></tr><tr><td>ScanImage</td><td>Vidrio</td><td>ScanImage Basic</td><td>激光扫描显微镜控制软件</td></tr><tr><td>短通滤波器</td><td>THORLABS</td><td>FESH1000</td><td>25.0 毫米优质短通滤波器，截止波长：1,000 纳米。为有效抑制斯托克斯光，可能需要两个滤波器。</td></tr><tr><td>正置显微镜</td><td>Nikon</td><td>Eclipse FN1</td><td>可使用其他任何显微镜框架。如果有激光扫描显微镜，可直接使用；否则，需在显微镜上添加振镜扫描器和扫描透镜。</td></tr><tr><td>水浸物镜</td><td>Olympus</td><td>XLPLN25XWMP2</td><td>多光子25倍物镜的数值孔径为1.05。其他类似的物镜也可使用。</td></tr></tbody></table>

小鼠脑组织诊断的实时双色受激拉曼散射成像

Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis

受激拉曼散射（SRS）显微技术已成为一种强大的光学成像方法，可用于组织病理诊断。近年来，双色SRS被证明能够提供相当于苏木精-伊红（H&amp;E）染色的图像，从而实现脑癌的快速且可靠的诊断。这一能力推动了术中癌症诊断的诸多创新应用。组织的双色SRS成像可采用皮秒或飞秒激光光源实现。飞秒激光的优势在于支持多种灵活的成像模式，包括快速高光谱成像和实时双色SRS成像。通常采用具有啁啾特性的激光脉冲进行光谱聚焦，以配合飞秒激光实现高光谱分辨率。
双色受激拉曼散射（SRS）成像可通过正交调制与锁相检测实现。脉冲啁啾、调制及表征的复杂性是该方法广泛应用的主要瓶颈。本文提供了一套详细的操作方案，用于演示频谱聚焦型SRS的实现与优化，以及在倒置模式下对小鼠脑组织进行实时双色成像。本方案可适用于多种利用SRS高速度和光谱成像能力的SRS成像应用。

优化光谱分辨率： 
材料中的色散效应受色散介质（长度和材料）以及波长的影响。改变色散棒的长度会影响光谱分辨率和信号大小。这是一种权衡关系，可根据具体应用需求进行调整。色散棒可将光束脉冲从频域宽、时域窄的状态展宽为频域窄、时域宽的状态。图7展示了不同色散棒长度对光谱分辨率的影响。图7A显示光谱分辨率极差；该配置未使用玻璃啁啾棒，二甲亚砜（DMSO）的两个拉曼峰完全无法分辨。在图7B、C中，随着玻璃啁啾棒数量的增加，两个拉曼峰开始得以分辨。最后，图7D展示了匹配啁啾如何实现两个峰的完全分辨，并可用于将位移台位置校准至频率。
使用 DMSO 进行校准： 
DMSO 在 C-H 区域具有两个尖锐的拉曼峰，分别位于 2,913 和 2,994 ...

受激拉曼散射（SRS）显微技术是一种强大、无损且无需标记的成像技术。其中一个新兴应用是受激拉曼组织学，该方法利用蛋白质和脂质拉曼跃迁处的双色SRS成像生成类似苏木精和伊红染色的图像。本文中，我们展示了一种用于组织诊断的实时双色SRS成像方案。

受激拉曼散射（SRS）显微技术已成为一种强大的光学成像手段，用于组织病理诊断。近年来，双色SRS已……

本方案将演示光谱聚焦型受激拉曼散射（SRS）显微镜的实施与优化方法，并介绍其在实时受激拉曼组织学应用中的使用。该技术的主要优势在于，一旦仪器正确校准，样品处理速度极快，因为SRS无需进行组织处理和染色。本方案适用于其他SRS应用，不仅限于组织学。此类应用包括小分子、药物、细胞和组织。首先为泵浦光束安装一对消色差透镜，将激光光束尺寸放大两倍作为起始点。将一个100毫米和一个200毫米的透镜彼此相距约300毫米放置。然后将泵浦光束对准两个透镜的中心。接着在第二个透镜后放置一面反射镜，将光束导向一米以外的墙面。使用红外卡从反射镜到墙面追踪光束，并检查光束尺寸是否发生变化。如果光束的尺寸随距离发生变化，则需对光束进行准直。通过安装二向色镜并配合多个转向镜进行调节，将两束激光合并。通过在距离约一米的两个不同位置监测二向色镜后的光束，优化泵浦光与斯托克斯光的空间重叠。依次调整转向镜，然后调整二向色镜，使斯托克斯光束与泵浦光束对准。当扫描镜处于停放位置时，通过调节一对转向镜，确保合束后的光束被导入激光扫描显微镜扫描镜的中心。在聚光镜之后，使用另一对焦距分别为100毫米和30毫米的透镜，将透射光束中继至光电二极管上，确保两束光均落在光电二极管的有效接收区域内。然后安装两个低通滤波器，以阻断调制的斯托克斯光束。在斯托克斯光束光路中放置一个光束取样器，用于拾取光束的10%，并将其引导至快速光电二极管，以检测80兆赫的脉冲序列。从扇出缓冲器的一个输出端取出信号，并通过带通滤波器滤波，获得20兆赫的正弦波。然后使用射频衰减器将输出的峰峰值电压调节至约500毫伏。将调节后的输出信号送入相位调节器，通过电压源对射频相位进行精细调节。再将此输出信号送入射频功率放大器，并将放大器的输出连接至电光调制器（EOM）。解除斯托克斯光束的阻断后，将光电二极管置于光路中，以优化第一个电光调制器（EOM）的调制深度。调节EOM电压和四分之一波片，直至调制深度达到满意效果。在二向色镜后放置一个光电二极管，用于探测激光束。首先阻断斯托克斯光束，然后在示波器上放大其中一个泵浦脉冲峰。使用示波器放置一个垂直光标，标记该峰的时间位置。接着阻断泵浦光束，并解除对斯托克斯光束的阻断。移动延迟阶段，暂时将示波器上的峰值位置与前一步骤中标记的位置对齐。通过计算使两束光对齐所需的延迟距离，随后延长较快光束的光路或缩短较慢光束的光路。接下来，准备一个显微镜载玻片样品，使用DMSO和双面胶作为间隔物，将样品固定在载玻片与盖玻片之间。将样品放置在显微镜上，盖玻片一侧朝向显微镜物镜，在明场照明条件下从 I 片段观察样品。在玻璃胶带界面处的气泡顶层和底层均找到样品的焦平面，然后将焦点移至两层胶带之间。接下来，将可调谐激光束的输出波长设置为 798 纳米。根据聚光镜的光学通量，将泵浦光束和斯托克斯光束在物镜焦点处的光功率分别调节至约 40 毫瓦。然后在 MATLAB 中打开扫描图像，点击标有“focus”的按钮以开始扫描。调节振镜扫描器前的转向镜，使直流信号在通道一的显示中居中。移动电动延迟台，并密切观察通道二显示的锁相放大器输出。最后调节时间延迟以最大化交流信号强度。调节二向色镜，使SRS信号在交流通道上居中。然后调节锁相放大器的相位以最大化信号。将样品载玻片安装到显微镜上后，调节两束光的功率，使在样品焦点处每束光的功率均约为 40 毫瓦，具体操作如前所述。从 MATLAB 中打开扫描图像。然后通过扫描与DMSO的2,913 cm⁻¹拉曼峰相对应的延迟阶段，找到最大的SRS信号。采集对应于DMSO的2,913 cm⁻¹拉曼峰的SRS图像。在ImageJ中打开该图像，并在帧中心选择一个小区域。使用测量功能计算所选区域内数值的平均值和标准差。对于频率访问校准，保存一个高光谱扫描，其中延迟台的扫描范围需覆盖 DMSO 的 2,913 和 2,994 波数拉曼峰。然后保存与该高光谱数据集对应的台位置。对2,913和2,994 cm⁻¹处的载物台位置与拉曼位移进行线性回归。利用线性回归方程，将延迟位置转换为对应的拉曼频率。为校准光谱分辨率，根据先前位置及因插入杆而增加的光程长度，估算载物台位置。由于加入玻璃棒后光束会有轻微偏移，需重新调整光束的空间重叠。在第一个电光调制器（EOM）之后的探测光路中，安装一个偏振分束器、一个四分之一波片和第二个EOM。断开第二个EOM的信号输入，然后将信号输入连接到第一个EOM，并将其打开。通过将光束穿过第一个电光调制器（EOM），以20兆赫兹对斯托克斯光束进行调制。调节第一个EOM的倾斜角度和位置，确保光束穿过EOM晶体时位于中心。使用双面胶带、载玻片和盖玻片制备组织切片样品。将样品放置在显微镜上，盖玻片一侧朝向显微镜物镜。对于反射式SRS成像，在激光束进入显微镜之前安装一个半波片，以改变进入显微镜的光束偏振方向。在物镜上方放置一个偏振分束器，使去偏振的背向反射光束能够到达探测器。接下来，使用一个75毫米消色差透镜和一个30毫米非球面透镜，将物镜后孔径处的背向散射光子传递至光电探测器。安装探测器以收集由偏振分光棱镜引导的背向散射光。然后安装一个滤光片，以阻挡调制光束进入探测器。改变棒的长度会影响光谱分辨率。当不使用玻璃啁啾棒时，DMSO 的两个拉曼峰完全无法分辨。增加玻璃啁啾棒的数量后，两个峰开始被满意地分辨开来。匹配的啁啾可分辨出两个峰，并可用于将位移台位置校准至频率。使用两组具有正交偏振、时间延迟的脉冲序列对DMSO光谱进行成像，可显示SRS激发之间具有可接受的调制深度和时间分离。相比之下，较差的双色SRS相位偏移会导致倒置或负峰的出现。此处展示了在2,850和2,930 cm⁻¹处对离体小鼠脑组织进行实时双色SRS成像的结果。原始的脂质和蛋白质图像经过颜色编码，生成了一幅同时显示脂质和蛋白质分布的单幅图像。此外，还进行了假性苏木精-伊红重染色，以模拟病理学应用中的苏木精-伊红染色效果。空间-时间重叠和空间分辨率优化是受激拉曼散射（SRS）空间聚焦方法中最重要的步骤。该方法通常适用于其他泵浦-探测显微成像实验，例如瞬态吸收显微成像。该方法还可实现对细胞和组织中非荧光分子的成像。本文介绍的方法可缩短成像采集时间，有助于未来在临床中转化应用受激拉曼组织学技术。

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科研

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Bioengineering

生物工程

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