利用脉冲振幅调制叶绿素荧光测定法对作物非光化学淬灭进行高通量分析

该方法可用于深入了解遗传多样性群体或育种群体中非光化学淬灭的遗传变异。该技术的主要优势在于，可在一天内对大量基因型的非光化学淬灭变异进行筛选。本方案以大豆（Glycine max）为例进行介绍，但也可适用于其他能够采集叶圆片的植物物种。

对于首次执行该方案的研究人员而言，关键在于操作升降盘时避免损坏，以及防止海绵吸水过多。首先，在种子萌发30天后，于野外采样点采集植物样品。然后，在24孔板的每个孔中加入至1/3体积的蒸馏水。

用待取样的重复组标记平板的盖子和侧面。将植株顶端现有的最幼嫩的完全展开叶紧贴橡胶塞。将直径为2号的Humboldt打孔器穿过叶片并旋转以切下叶圆片，注意避开主脉。

使用同一叶片连续采集五个叶圆片作为技术重复。用棉签将叶圆片从打孔器中推出，放入24孔板的单个孔中，并对同一基因型的另一株植物重复此操作。检查所有叶圆片是否均浮在水面上。

如果叶盘粘附在孔板侧壁上，需用棉签轻轻将其推至漂浮位置。接着从下一个样地取样叶盘。盖上盖子，并用半透明的柔性薄膜密封。

完成整个24孔板的取样后，将该板存放于袋子、盒子或空的冷藏箱中，避免阳光直射。在洁净的实验室内，轻敲密封板的盖子，使运输过程中粘附在盖子上的叶圆片脱落。

揭开薄膜并取下盖子。将24孔板第一个位置中的叶片圆片转移至新的96孔板中，使叶片圆片平整地朝下贴于孔底。将一个鼻腔吸出器滤膜切成两半。

将所得滤纸一半浸入水中，然后在纸巾上轻拍以去除多余液体。将滤纸插入含有叶圆片的孔中以保持湿度。从24孔板的第一个孔中取出第二个叶圆片，翻转后放入96孔板的下一个可用孔位中。

将制备好的鼻滤器剩余一半浸入水中，取出后在纸巾上轻拍一下，然后放入含有第二片叶圆片的孔中。用胶带固定右上角，以便在黑暗条件下成像时确定培养板的方向。用半透明的柔性封膜密封培养板，并用铝箔纸包裹整个培养板。

在铝箔上写下样地编号和培养皿编号。将培养皿置于暗盒或暗柜中至少30分钟，以使非光化学淬灭的前两个阶段达到弛豫状态。若需研究非光化学淬灭的长期相位，则在成像前应采用长达一小时的黑暗孵育期。

准备一个额外的虚拟板用于分析过程中的对焦：将一个叶圆片放置在新的96孔板的每个角落以及中心位置。使用鼻滤器固定叶圆片（操作与之前各板相同），密封该板，并在室温、50%相对湿度条件下避光孵育。打开成像仪并启动成像软件。

单击“设置”，然后选择“方案”，以打开用于输入PAM实验方案步骤的窗口。根据论文中提供的仪器技术参数进行设置。在“延迟后”框中输入20秒，以设置程序从一个饱和脉冲开始，用于测量暗适应光合作用的最大量子效率。

单击“Apply pulse”复选框，并在标题为“This number of times”的框中输入1。将脉冲PPFD设置为6,152，脉冲时长设置为800毫秒，并勾选“Take F prime and FM prime images with all pulses”复选框。勾选“Insert after”以在方案中添加第二个步骤。

在“延迟时间为”标题的输入框中输入 30 秒。然后，选择“改变测量光”选项，并在“测量光 PPFD”标题的输入框中输入 50，以将腔室的光强设置为 50 PPFD。单击“插入后续步骤”以向方案中添加新步骤，并在“延迟时间为”标题的输入框中输入 150 秒。

选择“应用脉冲”，并在标题为“此次数”的框中输入 4，表示在 50 PPFD 的光化光强度下，每隔 150 秒连续应用测量脉冲四次。在将方案保存为 pcl 文件至指定位置之前，根据论文中提供的数值调整每一步的延迟时间和光照强度。关闭光源，将假板倒置放置在样品台上，使叶片的近轴面朝上指向检测器，而海绵朝下对准平台。

将样品台高度调节至叶盘位于仪器底座上方140毫米处。单击连接/断开成像相机和硬件相机图标以启动相机。单击荧光对焦符号（一个底部带有两条绿色线条的红色双头箭头图标），并调节镜头和曝光，使培养板清晰对焦。

再次点击荧光对焦图标以关闭闪烁光源。在暗环境中，将空白板替换为待分析的样品板。将样品板倒置放置，使外部的胶带用于定位右上角，然后点击图像映射相机图标。

通过打开或关闭光圈来调整图像曝光，直至弹出窗口中的指示条位于绿色区域。每次调整光圈后，点击“重试”按钮，直到曝光正确调整到位，仪器自动拍摄图像。右键点击图像，选择“应用图像隔离”以屏蔽背景信号。

聚焦的叶片区域将以灰色显示，背景以蓝色显示。通过右键单击图像，从“修改图像”下拉菜单中调整直方图和伽马值，选择感兴趣的区域或像素，仅包含叶圆片。右键单击图像并选择“删除高低截断”，以删除高亮显示的浅蓝色区域。

右键单击图像并选择“删除杂散像素”，以移除所有未与其余三个以上像素相连的像素。图像上显示为孤立区域的部分将被单独分析，并包含在最终的数据输出中。单击运行程序图标以启动程序。

屏幕底部将显示一个计时器，提示您该实验方案剩余的运行时间。请等待方案运行完毕。点击文件，然后选择另存为，将数据保存为 igr 文件。

在开始另一个样品板之前，单击窗口右上角的红色叉号关闭窗口。要导出叶绿素荧光数据，请在成像软件中打开 igr 文件，然后单击“文件”（File），接着选择“导出到文件夹”（Export to Folder），以创建一个包含所有必要文件的新文件夹。对田间种植的大豆进行的典型非光化学淬灭测量显示，在给予初始饱和闪光以测定 Fv/Fm 后，当叶圆片暴露于 50 微摩尔每平方米每秒的低光强下时，非光化学淬灭值小于 1。

此外，在转移至光照强度为2,000微摩尔每平方米每秒的高光条件下15分钟后，非光化学淬灭上升至最大值4。一次失败的测量显示，转移至高光条件后非光化学淬灭仅出现轻微增加。在成像仪内正确放置培养板，并制定明确的取样与接种叶圆片方案，对于确保数据与正确基因型相对应至关重要。

该方案可量化干旱和遮荫等环境因素对非光化学淬灭的影响，或评估冠层不同层次的非光化学淬灭，以优化作物模型。