Name: 一种高度可扩展的方法，用于对自发 性Caenorhabditis 线虫进行生态调查 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-01T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 学习利用移动数据平台和云端数据库对Caenorhabditis线虫进行大规模生态调查的方法。该技术实现了可扩展的野外采样、精准分离鉴定及标准化数据处理，为生态学和分子生物学研究提供高效可靠的数据支持。

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本研究得到了西北大学的启动资金以及美国国家科学基金会CAREER奖（IOS-1751035）的支持，两项资助均授予E.C.A.。

<ol><li>Frézal, L., Félix, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+outside+the+Petri+dish%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">C. elegans outside the Petri dish.</a> eLife. 4, 05849(2015).</li>
<li>Sivasundar, A., Hey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sampling+from+natural+populations+with+RNAI+reveals+high+outcrossing+and+population+structure+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Sampling from natural populations with RNAI reveals high outcrossing and population structure in Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology: CB. 15 (17), 1598-1602 (2005).</li>
<li>Kiontke, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phylogeny+and+molecular+barcodes+for+Caenorhabditis%2C+with+numerous+new+species+from+rotting+fruits%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">A phylogeny and molecular barcodes for Caenorhabditis, with numerous new species from rotting fruits.</a> BMC Evolutionary Biology. 11, 339(2011).</li>
<li>Petersen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten+years+of+life+in+compost%3A+temporal+and+spatial+variation+of+North+German+Caenorhabditis+elegans+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Ten years of life in compost: temporal and spatial variation of North German Caenorhabditis elegans populations.</a> Ecology and Evolution. 5 (16), 3250-3263 (2015).</li>
<li>Richaud, A., Zhang, G., Lee, D., Lee, J., Félix, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+local+coexistence+pattern+of+selfing+genotypes+in+Caenorhabditis+elegans+natural+metapopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The local coexistence pattern of selfing genotypes in Caenorhabditis elegans natural metapopulations.</a> Genetics. 208 (2), 807-821 (2018).</li>
<li>Ferrari, C., Salle, R., Callemeyn-Torre, N., Jovelin, R., Cutter, A. D., Braendle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephemeral-habitat+colonization+and+neotropical+species+richness+of+Caenorhabditis+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Ecology%22%5BJournal%5D)">Ephemeral-habitat colonization and neotropical species richness of Caenorhabditis nematodes.</a> BMC Ecology. 17 (1), 43(2017).</li>
<li>Crombie, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+sampling+of+Hawaiian+Caenorhabditis+elegans+reveals+high+genetic+diversity+and+admixture+with+global+populations%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Deep sampling of Hawaiian Caenorhabditis elegans reveals high genetic diversity and admixture with global populations.</a> eLife. 8, 50465(2019).</li>
<li>Crombie, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+adaptation+and+spatiotemporal+patterns+of+genetic+diversity+revealed+by+repeated+sampling+of+Caenorhabditis+elegans+across+the+Hawaiian+Islands%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Local adaptation and spatiotemporal patterns of genetic diversity revealed by repeated sampling of Caenorhabditis elegans across the Hawaiian Islands.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Noble, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selfing+is+the+safest+sex+for+Caenorhabditis+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Selfing is the safest sex for Caenorhabditis tropicalis.</a> eLife. 10, 62587(2021).</li>
<li>Cutter, A. D., Morran, L. T., Phillips, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Males%2C+Outcrossing%2C+and+Sexual+Selection+in+Caenorhabditis+Nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Males, Outcrossing, and Sexual Selection in Caenorhabditis Nematodes.</a> Genetics. 213 (1), 27-57 (2019).</li>
<li>Petersen, C., Dirksen, P., Schulenburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+we+need+more+ecology+for+genetic+models+such+as+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%3A+TIG%22%5BJournal%5D)">Why we need more ecology for genetic models such as C. elegans.</a> Trends in Genetics: TIG. 31 (3), 120-127 (2015).</li>
<li>Haber, M., Schüngel, M., Putz, A., Müller, S., Hasert, B., Schulenburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+history+of+Caenorhabditis+elegans+inferred+from+microsatellites%3A+evidence+for+spatial+and+temporal+genetic+differentiation+and+the+occurrence+of+outbreeding%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Evolutionary history of Caenorhabditis elegans inferred from microsatellites: evidence for spatial and temporal genetic differentiation and the occurrence of outbreeding.</a> Molecular Biology and Evolution. 22 (1), 160-173 (2005).</li>
<li>Barrière, A., Félix, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+C.+elegans+and+Related+Nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Isolation of C. elegans and Related Nematodes.</a> WormBook. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19764/ (2018).</li>
<li>Poullet, N., Braendle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sampling+and+isolation+of+C.+elegans+from+the+natural+habitat%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Sampling and isolation of C. elegans from the natural habitat.</a> Methods in Molecular Biology. 1327, 221-229 (2015).</li>
<li>Di Bernardo, M., Crombie, T. A., Cook, D. E., Andersen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((easyFulcrum%3A+An+R+package+to+process+and+analyze+ecological+sampling+data+generated+using+the+Fulcrum+mobile+application%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">easyFulcrum: An R package to process and analyze ecological sampling data generated using the Fulcrum mobile application.</a> PloS one. 16 (10), 0254293(2021).</li>
<li>Mobile data collection & workflow automation in NCAP. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fulcrumapp.com/">https://www.fulcrumapp.com/</a> (2021).</li>
<li>Nematode Isolation Application. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fulcrumapp.com/apps/nematode-isolation">https://www.fulcrumapp.com/apps/nematode-isolation</a> (2021).</li>
<li>Nematode Field Sampling Application. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fulcrumapp.com/apps/nematode-field-sampling">https://www.fulcrumapp.com/apps/nematode-field-sampling</a> (2021).</li>
<li>JOVE wild_isolate-genotyping-template. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://docs.google.com/spreadsheets/d/1oEP40jy6_K6Wkwn7Qm4iF58rTUe4JWk2zhJ20-keoOk/edit">https://docs.google.com/spreadsheets/d/1oEP40jy6_K6Wkwn7Qm4iF58rTUe4JWk2zhJ20-keoOk/edit</a> (2021).</li>
<li>Nucleotide BLAST: Search nucleotide databases using a nucleotide query. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://blast.ncbi.nim.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch">https://blast.ncbi.nim.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch</a> (2021).</li>
<li>easyFulcrum. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://andersenlab.org/easyfulcrum/articles/easyFulcrum.html">http://andersenlab.org/easyfulcrum/articles/easyFulcrum.html</a> (2021).</li>
<li>Andersen, E. C., Bloom, J. S., Gerke, J. P., Kruglyak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+in+the+neuropeptide+receptor+npr-1+is+a+major+determinant+of+Caenorhabditis+elegans+growth+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A variant in the neuropeptide receptor npr-1 is a major determinant of Caenorhabditis elegans growth and physiology.</a> PLoS Genetics. 10 (2), 1004156(2014).</li>
<li>Tuli, M. A., Daul, A., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WormBook%3A+Caenorhabditis+Nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">WormBook: Caenorhabditis Nomenclature.</a> WormBook. , (2018).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WormBook%3A+Maintenance+of+C.+Elegant%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">WormBook: Maintenance of C. Elegant.</a> WormBook. , (2006).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案包含若干必须谨慎执行的关键步骤。例如，野外采样和实验室分离线虫时，野外团队和分离团队必须仔细确保在应用程序中选择了正确的采集项目。如果选错了采集项目，最好通过 Fulcrum 数据库的在线记录编辑工具来修正错误的数据记录。当存在大量记录位置错误时，这一修正过程可能较为繁琐。然而，数据库会保留所有记录的修改痕迹，从而实现对采集和分离记录的完整审计。本方案中的其他关键步骤涉及野外样品及其分离线虫的处理。为确保Caenorhabditis属线虫在采样和运输过程中存活，样品温度应维持在 4 °C 至 25 °C 之间。温度超过 25 °C 可能导致C. elegans14出现不育现象。应尽可能在五天内将样品从采样袋转移至采集平板，以最大限度减少线虫损失。在线虫分离后，必须在它们死亡前完成基因分型并进行冷冻保存。由于真菌和细菌污染可能使 S-平板环境变得不适宜生存，因此很难在存放超过两到三周的 S-平板上找到存活的线虫。
该方案可轻松修改，以适应研究人员在野外希望收集的不同类型数据。例如，可使用 Fulcrum 的在线图形用户界面（GUI）编辑应用程序，轻松地为“线虫野外采样”应用程序添加新的数据输入字段。此外，数据分析包 easyFulcrum 在处理新数据时也能兼容这些修改15。用户可能感兴趣的另一项修改是在野外采用不同的采样方法。研究人员可能希望采样包含多种基质类型的较大区域，而非离散的基质样本。这些较大的样本在实验室中使用贝尔曼漏斗法或托盘提取法处理效果最佳13。重要的是，C标签和S标签仍适用于这些技术，因此与移动应用程序兼容。
本方案的主要局限性与线虫在实验室分离前的处理时间有关。首先，样本采集与线虫分离之间的时间延迟使得无法记录采集时刻特定样本上线虫的发育阶段。其次，雄性个体在自然界中的出现频率以及异交行为是关于自交型 Caenorhabditis 线虫的关键进化问题10。该方法并不适合回答这些问题，因为线虫在被分离前可能已经历了多个世代。延迟分离意味着无法获得自然界中雄性频率的直接证据。此外，在基因分型步骤中存在的多世代延迟会导致异交的基因组证据（杂合性）在对线虫品系进行测序前即被稀释。为了识别自然界中的杂合性，通常采用直接从自然环境中分离的单个线虫所产的后代进行测序2。本方案的另一个潜在局限性在于其倾向于鉴定出自交型 Caenorhabditis 线虫。这是因为自交型物种的分离个体比专性异交型个体更有可能增殖，后者只有在分离到已受精的雌性个体时才能实现增殖。
该收集方法基于现有的收集方案13,14该技术的主要进步在于利用移动技术和定制软件，以促进大规模采集项目所产生的大量生态学和分子数据的组织管理。通过本采集方案获得的生态学数据可用于解答自然种群中的重要科学问题 秀丽隐杆线虫 物种。例如，利用该方法生成的数据已被用于揭示这些物种在夏威夷群岛间的生态位偏好。此外，通过对冷冻保存的线虫进行基因组测序，研究人员能够探究遗传变异模式与生态数据之间的关联。此类研究可揭示局部适应的遗传信号 秀丽隐杆线虫 种群，并为自然条件下遗传变异的相关性提供重要见解8. 为了获得对许多基因功能的理解 秀丽隐杆线虫 线虫，可能需要进行生态学研究11即使对于 秀丽隐杆线虫 大量基因缺乏功能注释，尽管它是首个完成测序的多细胞动物，也是地球上研究最为深入的动物之一。本采集方案旨在通过促进野生样本的收集，帮助弥补这一知识空白 秀丽隐杆线虫 线虫及其生态学与自然遗传多样性的研究

近二十年来，人们对Caenorhabditis属线虫的生态学兴趣日益增加。这些研究表明，自由生活的Caenorhabditis物种可从温带和热带地区短暂存在的微生境中分离得到，它们以腐烂植物材料相关的微生物大量繁殖为食，有时与其他物种同域分布1,2,3,4,5,6,7,8。我们还了解到，自体受精在该属中经历了三次趋同进化，且是C. briggsae、C. elegans和C. tropicalis的主要繁殖方式9,10。在这些自交物种中，C. elegans是地球上研究最广泛的动物之一，研究人员已利用它在生物学领域取得了诸多关键性进展。重要的是，其他自交的Caenorhabditis物种与C. elegans共享许多实验优势，正迅速推动该属内的比较研究。然而，这些线虫在自然环境中的隐秘特性使其生态学和自然多样性研究变得困难，而这些研究对于理解其基因的生物学功能以及进化如何塑造物种间的遗传多样性至关重要10,11。
研究野生环境中自交型 Caenorhabditis 线虫生态学的最大挑战在于其体型微小；成年线虫的体长通常仅为1 mm或更短。这一挑战要求研究人员必须从野外采集基质样本，并在无法直接观察野外个体的情况下，在实验室中尝试将目标线虫从基质中分离出来。由于即便是受过专业训练的专家，也难以在显微镜下将自交型 Caenorhabditis 线虫与其他自由生活的线虫区分开来，因此通常的做法是先将线虫从基质中取出，进行分离培养，使其增殖，再通过已建立的分子条形码技术，依据序列一致性进行鉴定3,12,13,14。以这种方式处理每条线虫所需的时间和精力带来了组织管理上的难题，因为研究人员必须能够将实验室中分离得到的每条线虫准确追溯至野外采样的具体基质及其相关的生态数据。本文中，我们描述了一种逐步操作流程，可高效地从野外采集并鉴定自交型 Caenorhabditis 线虫，并在大规模条件下可靠地将这些分离株与其对应的空间信息和生态数据关联起来。
该采集方法通过使用移动数据采集平台、基于云的数据库以及 R 软件环境，提高了生态调查的规模和准确性。Fulcrum 是一个可定制的数据采集平台，兼容大多数移动设备，允许用户构建自定义应用程序以收集和组织基于地理位置的数据（https://www.fulcrumapp.com）。本实验方案详细说明了如何使用定制的数据采集应用程序在野外整理具有明确空间信息的生态数据，并将这些数据与实验室中分离的线虫种类准确关联。本方案还介绍了如何利用已建立的分子条形码高效鉴定自交&#160;Caenorhabditis 线虫。通过配套的 R 软件包 easyFulcrum15，可对这些方法获得的数据进行简单且可重复的处理，以研究自然状态下 Caenorhabditis 种群的生态学特征和遗传多样性。

<table><tbody><tr><td>粘性标签</td><td>Avery</td><td>61533</td><td>打印C标签和S标签</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Thomas Scientific</td><td>C748D75</td><td>琼脂糖凝胶制备</td></tr><tr><td>背包</td><td></td><td></td><td>每位团队成员配备一个背包，用于携带当天所需的设备、样品、食物和水</td></tr><tr><td>纸板箱</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS261</td><td>S平板储存</td></tr><tr><td>离心机</td><td>NA</td><td>NA</td><td>线虫裂解、SSU和ITS2 PCR</td></tr><tr><td>采集袋</td><td>自封袋</td><td>NA</td><td>基质样品采集</td></tr><tr><td>数字温湿度计</td><td>Preciva</td><td>HT-86</td><td>环境温度和湿度测量</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>NA</td><td>NA</td><td>线虫分离、裂解</td></tr><tr><td>一次性储液槽</td><td>USA Scientific</td><td>1306-1010</td><td>分装PCR预混液和上样染料</td></tr><tr><td>DNA分子量标准（1 KB plus）</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0243</td><td>SSU和ITS2 PCR产物的可视化</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Thomas Scientific</td><td>CB4430-2</td><td>PCR预混液组分</td></tr><tr><td>easyFulcrum R软件包</td><td>NA</td><td>NA</td><td>用于处理采集数据的R软件包 http://andersenlab.org/easyfulcrum/articles/easyFulcrum.html</td></tr><tr><td>EDTA溶液（0.5 M，pH 8.0）</td><td>NA</td><td>NA</td><td>配方见补充表3</td></tr><tr><td>乙醇（95%）</td><td>NA</td><td>NA</td><td>样品涂布、勺子灭菌</td></tr><tr><td>溴化乙锭溶液（10 mg/mL）</td><td>VWR</td><td>97064-602</td><td>SSU和ITS2 PCR产物的可视化</td></tr><tr><td>移动设备外接充电器</td><td>NA</td><td>NA</td><td>适用于iPhone或Android设备的外接充电器及充电线缆</td></tr><tr><td>锥形瓶（500 mL）</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB501500</td><td>琼脂糖凝胶制备</td></tr><tr><td>食物</td><td>NA</td><td>NA</td><td>根据需要准备</td></tr><tr><td>凝胶电泳装置</td><td>Thermo Scientific</td><td>B2</td><td>SSU和ITS2 PCR产物的可视化</td></tr><tr><td>凝胶电泳电源</td><td>BioRad</td><td>1645050</td><td>SSU和ITS2 PCR产物的可视化</td></tr><tr><td>上样染料（6×）</td><td>NEB</td><td>B7022S</td><td>SSU和ITS2 PCR产物的可视化</td></tr><tr><td>ITS2引物组</td><td>NA</td><td>NA</td><td>oECA1687 = 正向引物 CTGCGTTACTTACCACGAATTG&lt;br/&gt; CARAC，oECA202 = 反向引物 GCGGTATTTGCTACTACCAYYAM&lt;br/&gt; GATCTGC</td></tr><tr><td>ITS2测序引物</td><td>NA</td><td>NA</td><td>oECA306 = 正向引物 CACTTTCAAGCAACCCGAC</td></tr><tr><td>裂解缓冲液</td><td>NA</td><td>NA</td><td>线虫裂解，配方见实验方案</td></tr><tr><td>微波炉</td><td>NA</td><td>NA</td><td>琼脂糖凝胶制备</td></tr><tr><td>移动设备</td><td>NA</td><td>NA</td><td>充满电并处于飞行模式的手机。Fulcrum应用程序的GPS定位精度低于从照片中提取的GPS位置。此设置可确保更低的功耗并获得更精确的GPS测量结果。</td></tr><tr><td>NGMA平板（10 cm）</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>C平板，NGMA平板制备方法参见Andersen等（2014）</td></tr><tr><td>NGMA平板（3.5 cm）</td><td>Greiner Bio-One</td><td>5662-7102Q</td><td>S平板，NGMA平板制备方法参见Andersen等（2014）</td></tr><tr><td>非接触式红外测温仪</td><td>Etekcity</td><td>B00837ZGRY</td><td>基质温度测量</td></tr><tr><td>纸巾</td><td>NA</td><td>NA</td><td>用于吸收封装样品中多余水分的纸巾</td></tr><tr><td>封口膜</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td>平板密封</td></tr><tr><td>PCR封口膜</td><td>VWR</td><td>60941-126</td><td>PCR封口膜</td></tr><tr><td>PCR缓冲液（10×）</td><td>Thomas Scientific</td><td>CB3702-7</td><td>PCR预混液组分</td></tr><tr><td>PCR板（96孔）</td><td>Thomas Scientific</td><td>1149K04</td><td>SSU和ITS2 PCR</td></tr><tr><td>铅笔</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>塑料勺</td><td>NA</td><td>NA</td><td>样品涂布</td></tr><tr><td>铂金接种针</td><td>NA</td><td>NA</td><td>线虫分离、裂解</td></tr><tr><td>预贴标签的自封采集袋</td><td>NA</td><td>NA</td><td>成捆的、预先贴有C标签条形码的自封塑料袋。每捆应包含25个带条形码的袋子，并用橡皮筋捆扎。</td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Sigma</td><td>3115879001</td><td>线虫裂解，在使用前立即加入裂解缓冲液中</td></tr><tr><td>R软件</td><td>NA</td><td>NA</td><td>R软件：用于统计计算的语言和环境 https://www.R-project.org/</td></tr><tr><td>软质保温袋和冰袋</td><td>NA</td><td>NA</td><td>采集用保温箱和冷却包，当环境温度高于25 &amp;deg;C时用于保持样品低温</td></tr><tr><td>备用电池</td><td>NA</td><td>NA</td><td>采样设备的额外电池</td></tr><tr><td>SSU引物组</td><td>NA</td><td>NA</td><td>oECA1271 = 正向引物 TACAATGGAAGGCAGCAGGC，oECA1272 = 反向引物 CCTCTGACTTTCGTTCTTGATTAA</td></tr><tr><td>条状管盖（12孔）</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159V29</td><td>线虫裂解</td></tr><tr><td>条状管（12孔）</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159V31</td><td>线虫裂解</td></tr><tr><td>TAE缓冲液（1×）</td><td>NA</td><td>NA</td><td>SSU和ITS2 PCR产物的可视化。配方见补充表3</td></tr><tr><td>Taq DNA聚合酶</td><td>Thomas Scientific</td><td>C775Y45</td><td>PCR预混液组分</td></tr><tr><td>PCR仪</td><td>NA</td><td>NA</td><td>线虫裂解、SSU和ITS2 PCR</td></tr><tr><td>水</td><td>NA</td><td>NA</td><td>根据需要准备</td></tr></tbody></table>

一种可高度扩展的自交型 caenorhabditis 线虫生态调查方法

A Highly Scalable Approach to Perform Ecological Surveys of Selfing Caenorhabditis Nematodes

Caenorhabditis elegans 是生物学中的主要模式生物之一，但直到最近，研究人员才开始关注其自然生态。关于 C. elegans 在自然环境中的信息相对匮乏，这主要是由于在野外识别这种小型线虫存在诸多挑战。尽管如此，随着对 C. elegans 生态学研究的日益重视，人们已获得了大量有关其在实验室外生存的新信息。对自然界中 C. elegans 的深入搜寻不仅促成了许多新的 Caenorhabditis 物种的发现，还揭示了同属线虫在野外常常共存，并以腐烂植物材料相关的微生物大量繁殖为食。新物种的鉴定还表明，由雄虫和自体受精的雌雄同体组成的雄雌同体交配系统在 Caenorhabditis 属中已独立演化了三次。另外两种自交物种 C. briggsae 和 C. tropicalis 与 C. elegans 一样具有实验研究的优势，使得科学家能够开展比较研究，以探究包括自体受精在内的关键性状的分子机制。尽管取得了这些进展，关于这些重要物种的生态学及其自然多样性，仍有许多未知之处。例如，我们对其众多基因的功能仍缺乏了解，而这些信息可能只有通过理解其自然生态才能获得。为了促进对自交型 Caenorhabditis 线虫的生态学研究，我们开发了一种高度可扩展的方法，用于从野外采集线虫。该方法利用移动数据采集平台、基于云的数据库以及 R 软件环境，增强研究人员从野外采集线虫、记录相关生态数据，并利用分子条形码鉴定野生线虫的能力。

该方案已用于从多个地点（包括夏威夷和加利福尼亚）采集Caenorhabditis属线虫。Caenorhabditis属线虫的分离成功率因采集地点、气候、采样经验以及所采样的基质类型而异。该方案已在夏威夷群岛进行了广泛采样，多年来在不同季节共开展了九次采集项目。对于自交繁殖的Caenorhabditis物种，其分离成功率在C. briggsae（4,506份样本中获得162份，3.6%）和C. elegans（4,506份样本中获得163份，3.6%）之间几乎相同，而C. tropicalis的分离成功率则低得多（4,506份样本中获得26份，0.58%）8。每种自交物种在腐烂果实和花朵基质上的丰度均高于其他类型的基质。若研究人员旨在提高分离成功率而非研究基质偏好性，则应优先采样腐烂的果实和花朵基质。然而，分离成功率与所选基质的质量密切相关。例如，在果实和花朵基质中，过于干燥、过湿或过于新鲜的样本通常难以获得Caenorhabditis属线虫。
该采集方案的可扩展性体现在单个研究人员团队从野外能够采集的样本数量上。例如，在2018年10月，一对研究人员使用本采集方案在7天内从夏威夷两个岛屿的多个地点共采集了超过1,000份样本。该野外团队将样本连夜寄送至实验室，随后由八名研究人员组成的团队在样本到达后陆续从中分离出超过2,000条线虫。本方案的一个关键优势在于，通过减少野外工作所需的设备和人员，显著降低了在偏远地区采样的成本。采用该方案后，小型野外团队可专注于采样工作，而分离团队则可在其所属机构利用解剖显微镜和琼脂平板等易碎且笨重的设备进行样本处理。此外，移动数据采集应用程序的使用使得所有与样本相关的野外数据可直接与C标签关联，从而使分离团队在处理样本时能够独立于野外团队开展工作。
使用该采集方案的研究人员必须在开展采集项目前，充分考虑分离线虫所需投入的工作量。分离与鉴定步骤是限制性环节，较小的采集团队可能迅速产生大量样本，从而超出分离人员的处理能力。此外，处理大量样本所需的实验空间可能会影响正在进行的其他研究工作。图3）。此外，一些分离得到的线虫在基因分型时需要额外的操作。例如，约有 2% 的样本在首次裂解后使用 SSU PCR 引物组无法扩增，必须重新裂解，以确保裂解产物适用于 ITS2 引物组的扩增图8）。此外，约有3%的分离株在初次进行Sanger测序后无法获得高质量的序列。对于这些分离株，通常需要再次进行裂解、ITS2 PCR扩增及Sanger测序，这可能会增加分离团队的操作时间。重要的是，仅凭序列一致性不足以作为确立新种的充分证据 秀丽隐杆线虫 物种图7）。为合理地将一个分离株提升为新种 秀丽隐杆线虫 物种，必须额外开展交配实验并建立模式标本13. 也建议对已分类的标本进行正式的形态学描述，但非强制要求3综上所述，这些因素提示研究人员在开展采集项目之前，应先对分离与鉴定步骤进行试验性测试，以确保资源得到合理分配。尤为重要的是，即使规模较小的采集项目也能从该方案中获益，因为该流程具有高度可重复性，且所产生的数据便于在不同实验团队之间进行质量控制审查。
<img alt="森林生态系统研究中的果实、花朵和枯枝落叶，展示植物分解的不同阶段。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：底物示例。（A）图像中央显示一个理想的腐烂果实（1），其形态已几乎无法辨认；附近显示腐烂程度较轻的果实，应避免采集刚落下的新鲜果实（2）。（B）顶部显示一个理想分解状态的花朵（3），应避免采集刚落下的新鲜花朵（4）。（C）在干燥落叶表层下方的深色枯枝落叶，是采集自交型Caenorhabditis线虫的理想采样材料（5）；应避免采集干燥的枯枝落叶（6）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的高清版本。</a>
<img alt="线虫野外采样应用程序；用于数据录入的界面设计，包含记录和野外条件。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：线虫野外采样移动应用程序。（A）在 Fulcrum 平台的 Apple 设备上打开线虫野外采样应用程序后的初始界面。右下角的红色箭头指向用于创建新采集记录的+按钮。（B）在 Apple 设备上显示的新采集记录示例。红色箭头指向采集记录界面顶部的“项目”字段。野外采样时务必选择正确的项目。在创建后续采集记录时，项目字段将默认为上次使用的项目。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="用于生物样本储存和微生物实验培养皿的实验室设置" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：接种前收集袋与收集平板的摆放情况。 本图显示左侧为装有样本的含C标记的收集袋，每个收集袋上方均对应放置一个带有相同C标记的10 cm培养皿。右侧为10 cm收集平板，其中已装入从收集袋转移而来的样本材料。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于微生物分析的土壤样品培养皿，实验设置，实验室研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：已成功转移样品的收集板（C-板）。 一个直径为 10 cm 的 C-板，其边缘放置了正在分解的水果，位于细菌菌苔上。C-标签已贴在培养皿盖上。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="线虫分离应用程序界面、数据录入界面；采样记录和项目选择流程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5：线虫分离移动应用程序。（A）Fulcrum 移动应用程序中的应用程序选择界面。红色箭头指向线虫分离应用程序。（B）在 Fulcrum 中于 Apple 设备上打开线虫分离应用程序后的初始界面。右下角的红色箭头指向用于创建新分离记录的+按钮。（C）在 Apple 设备上显示的新分离记录示例。红色箭头指向分离记录界面顶部的“项目”字段。进行分离操作时，务必选择正确的项目。在创建后续分离记录时，项目字段将默认为上次使用的项目。（D）点击 C 标签下方的选择字段后，用户将点击搜索按钮（红色箭头），以查找其正在分离线虫的 C 标签。（E）选择 C 标签后，用户将使用设备摄像头拍摄 C 平板的照片。（F）随后，用户需输入 C 平板上是否存在线虫。若存在需分离的线虫，则将 S 标签添加至分离记录中。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="BLASTN 结果示意图；DNA 序列比对、查询详情、过滤参数、比对得分。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 6"> 
图 6：NCBI BLAST 结果页面。 （1）用于查看所有序列 BLAST 结果的下拉菜单。（2）从下拉菜单中选择的当前序列的描述信息。此处显示的是 S-05554 样品标签（S-label）的结果。（3）S-05554 的最佳 BLAST 比对结果。紫色文字表示已点击链接以可视化该比对结果。请务必通过肉眼检查比对结果，以识别可能的新的 Caenorhabditis 物种，参见上文步骤 9.8。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="DNA序列比对结果；比较图示；基因比对概览；序列相似性分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig07.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图7"> 
图7：NCBI BLAST比对可视化示例。（A）一个分离株ITS2查询序列与C. kamaaina参考序列比对的示例。（1）比对的序列一致性百分比（89%），该值作为BLAST最佳匹配结果而言偏低。（2）查询序列与参考序列之间的一个错配位点（G到A）。（3）比对算法在参考序列中引入的一个4个碱基对的空缺；查询序列或参考序列中的空缺提示比对质量较差。（4）比对中心区域存在一个包含多个错配和空缺的广义区域。此类区域提示该查询序列可能来源于一个新的Caenorhabditis物种。图中展示的是2017年发现的一个新物种C. oiwi的实际比对示例。（B）一个分离株ITS2查询序列与参考序列良好比对的示例。（5）比对的序列一致性百分比（99%），通常表明该查询序列来源于与参考序列相同物种的分离株。（6）比对中心区域具有完全一致的序列。此类区域提示该查询分离株很可能与参考序列属于同一物种。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="PCR凝胶电泳图，DNA片段，500 bp和2 kb ladder，SSU和ITS2分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig08.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 8"> 
图8：SSU和ITS2 PCR产物。 上方凝胶显示使用SSU引物组扩增的12个代表性样本的PCR产物。左侧包含DNA分子量标记作为参照。Caenorhabditis线虫的SSU PCR产物长度约为500 bp。样本2至12使用SSU引物组成功扩增，但样本1未扩增出条带。样本1缺乏500 bp的SSU扩增子表明裂解材料质量较差，需重新进行裂解处理。下方凝胶显示使用ITS2引物组对与上方凝胶相同的12个样本进行扩增所得到的PCR产物。两个凝胶中的分子量标记和样本排列方向一致。12个样本中有6个未能使用ITS2引物组扩增出产物。具有SSU和ITS2条带的样本将通过Sanger测序，并利用NCBI BLAST算法比对序列相似性进行鉴定。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充文件 1：C 标签。 一个包含 2500 个独特 C 标签的 PDF 文件。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/C-labels.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 2：S-标签。 一个包含 5000 个独特 S-标签的 PDF 文件。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/S-labels.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表1：野外材料。 用于野外采集线虫的材料清单。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充表 2：PCR 反应体系与PCR仪反应条件。 包含 ITS2 和 SSU PCR 反应体系及PCR仪反应条件的表格。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/Supplemental_Table_2.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充表 3：电泳缓冲液配方。 0.5 M pH 8.0 乙二胺四乙酸溶液（EDTA）以及三羟甲基氨基甲烷-乙酸-EDTA（TAE）缓冲液的配制方法。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/Supplemental_Table_3.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

本方案可用于对自交型Caenorhabditis线虫进行大规模生态学调查。该方法的主要优势在于能够高效地整理和分析从自然界采集的线虫所关联的生态学与分子数据。

一种可高度扩展的自交型 Caenorhabditis 线虫生态调查方法

秀丽隐杆线虫是生物学中主要的模式生物之一，但研究人员直到最近才开始关注其自然生态。相对……

本方案可用于简化从自然环境中分离和鉴定秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis nematodes）的流程，并记录与线虫自然生境相关的重要生态和环境数据。该技术的主要优势在于其可扩展性和准确性，这得益于移动数据采集平台、基于云的数据库以及标准化的数据处理功能。首先，确定一个用于调查秀丽隐杆线虫的地点。要创建一个Fulcrum项目，请通过Fulcrum在线平台使用免费的教育协议注册账户，并添加线虫田间采样应用程序，然后添加线虫分离应用程序。打印一组QR码标签，其中C标签用于追踪样品采集，S标签用于追踪线虫分离过程。将 C-标签 贴在用于包装的 Ziploc 塑料袋上。将 S-标签 组留作实验室使用。在 Fulcrum 移动应用程序的下拉菜单中选择线虫野外采样，并按加号以在项目中创建新记录。拍摄底物的照片。点击 C-标签字段并选择扫描。使用移动设备的摄像头扫描采集袋上的条形码，然后点击完成。点击底物字段并选择一种底物类型。使用非接触式温度计测量底物的表面温度，并将数值记录在底物温度字段中。同时测量并记录环境温度和湿度。通过点击屏幕左上角的“保存”按钮，在Fulcrum中保存并记录。将采集袋倒置作为手套，拾取不含枝条或其他硬质碎片的基质一汤匙，然后密封采集袋。对于每个Ziploc袋，记录袋上的C标签，并将对应的C标签贴在已点有OP50细菌的10厘米培养皿的盖子上。使用干净的塑料勺子，从每个采集袋中取一汤匙样品转移到C-板中。在Fulcrum应用程序中，从应用菜单选择线虫分离。然后点击右下角的加号图标，创建一个新的分离记录。点击选择按钮以查找与样本关联的 C-标签。点击搜索图标，然后点击扫描图标以扫描 C-标签的二维码。使用解剖显微镜在C培养板上寻找线虫。轻敲样本区域的蠕虫，以记录样本中是否存在线虫。若未发现线虫，则用封口膜封好C培养板，并将其丢弃至生物危害垃圾桶中。如果存在线虫，则从C板中分离出最多五条线虫，并将每条转移至各自的S板。接着，点击标记为S的平板区域，输入本次分离所用的S板。然后点击右下角的加号。点击 S-标签，然后点击“扫描”以打开设备摄像头，接着扫描 S-板上的 S-标签二维码。当分离记录已正确添加所有信息后，点击右上角的保存按钮，随后用封口膜封好含有分离线虫的 S-板，并将其放置在指定用于存放含线虫 S-板的区域。登录 Fulcrum 网站，选择线虫分离应用程序。单击导出器以下载包含线虫分离物 s_labeled_plates.csv 文件的压缩包。前往野生分离物基因分型模板的 Google 表格并复制该表格。将从线虫分离 s_labeled_plates.csv 列中复制的 S-标签放入基因分型表格中。在分离后 48 小时检查 S-平板上是否有增殖的动物。如果S型培养板中有动物开始增殖，则在基因分型表的“增殖48小时”一栏中记录为1，然后将该S型培养板转移至标记为“48小时增殖盒一”的盒子中。对于在分离后48小时未显示增殖的S型培养板，需在分离后168小时再次检查。如果此时S型培养板出现增殖，则在基因分型表的“增殖168小时”一栏中记录为1，并将该S型培养板转移至标记为“168小时增殖盒一”的盒子中。在 Google 表格中筛选基因型，仅包含一个待裂解增殖盒中的 S 标签，然后选择从 S 标签到裂解节点的各列。为每个待裂解的增殖盒打印一份裂解工作表。为待裂解的样品准备 12 孔条状管。打开一个排管管盖，使用多通道移液器向每个管盖中加入 8 µL 裂解缓冲液。从来源培养板中挑选三至五只动物，放入裂解工作表上指定的管盖位置。对最多八个排管重复此操作，并将排管置于 -80 °C 冰箱中保存。取出排管，放入PCR仪中运行裂解程序。随后将裂解产物在-80°C条件下保存，最长可保存一周。从-80°C冰箱中取出排管，在冰上融化裂解样品。在裂解液解冻的同时，于冰上分别配制ITS2和SSU的预混液。使用低容量多通道移液器将2微升裂解液加入PCR板相应的孔中。使用相应的PCR仪程序运行扩增反应，并在基因分型表中记录哪些S标签产生了ITS2或SSU的PCR产物。对于每个ITS2检测呈阳性的样品，利用剩余的ITS2 PCR产物进行Sanger测序，并从测序平台获取每个S标签的测序输出文件。在网页浏览器中访问NCBI BLAST网站，开始进行BLAST比对搜索。对于在BLAST结果中比对到线虫属（Caenorhabditis）物种的S平板序列，将最高匹配结果的完整属名和种名填入物种鉴定列中。根据秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis）命名规范，为品系赋予唯一的名称，并将品系名称填入品系名称列中。为处理数据，请访问 Fulcrum 网站并从 Fulcrum 数据库导出原始项目数据。打开一个新的 R 脚本，按照 easyfulcrum 小品文档中的说明处理采集数据。在 NBCI BLAST 中，S-Label S-05554 的结果显示，最匹配的物种为 Caenorhabditis briggsae。此外，部分分离的线虫在基因分型时需要额外操作。例如，约有 2% 的分离株在首次裂解后无法通过 SSU PCR 引物组扩增，必须重新裂解，以确保裂解产物适用于 ITS2 引物组的扩增。通过该实验流程，研究人员可探究与野生线虫分离株相关的生态和环境数据，以确定最有可能栖息特定线虫物种的地理位置及基质特征。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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