从微解剖小鼠脉络丛中分离和表征免疫细胞

该协议可能有助于解决有关脉络丛和外周免疫细胞在小鼠模型中各种情况下调节大脑中的作用的问题。该协议允许对小鼠脉络膜丛中独特的免疫细胞群进行深入的定量和定性分析。由于脉络膜丛的体积小且颜色透明，在开始时可能很难解剖脉络丛。

我们建议先在非灌注动物身上练习。首先，将C57黑色六只小鼠背侧解剖的大脑放在培养皿中，并将培养皿放在双眼环的目标下方。在使用镊子将大脑保持在适当的位置时，将另一对镊子的两端向下插入半球之间的中线。

使用镊子，将带有胼胝体和海马体的皮层从隔膜上拉开，暴露外侧心室和第三脑室的一部分。将外侧脉络丛识别为外侧心室内衬的长面纱，两端有喇叭形。然后使用薄镊子的两端，收集侧脉络丛。

小心收集被海马体后褶皱隐藏的三角形后部。接下来，将带有对侧半球的胼胝体和海马体的皮层从隔膜上拉开，以暴露整个第三脑室和对侧心室。使用细镊子，收集第三脉络丛，其标识为具有颗粒状表面的短结构。

然后收集另一个侧脉络丛。接下来，将镊子的两端插入小脑和中脑之间，并将小脑与脑桥和髓质分离以暴露第四脑室。然后将第四脉络丛确定为具有颗粒状表面的长球状结构，该表面面从小脑和髓质之间的外侧右端到左端排列第四脑室。

使用细镊子，收集第四脉络丛。用胶原酶IV孵育所有收集的脉络膜丛后，轻轻地上下移液约10次以完成解离。然后用MACS缓冲液将试管填充至1.5毫升以停止胶原酶IV活性。

接下来，离心细胞并丢弃上清液，然后用1.5毫升MACS缓冲液洗涤细胞。加入适当的补偿微珠和抗体溶液后，将样品在冰上孵育30至45分钟，保护它们免受光照。然后用1.5毫升MACS缓冲液填充试管，并离心细胞和补偿微球。

将细胞和补偿珠重悬于500微升MACS缓冲液中后，通过70微米过滤器过滤细胞。打开流式细胞仪和软件后，根据大小选择前向散射区域与侧面散射区域和细胞门。然后为具有前向散射面积与前向散射高度的单个单元创建子门。

接下来，为具有DAPI与前向散射区域的活细胞创建子门，以排除DAPI阳性细胞。然后为CD45阳性免疫细胞创建一个子门，CD45与前向散射区域。现在，从CD45阳性细胞创建一个子门，并选择F480与CD11b来识别CD11b阳性F480阳性和CD11b阳性F480阴性群体。

然后为CD11b阳性F480阳性细胞创建子门，并选择CX3CR1与IA-IE，以鉴定CX3CR1阳性IA-IE阳性边界相关巨噬细胞和CX3CR1阳性IA-IE阴性巨噬细胞。接下来，为 CD11b 阳性 F480 阳性 CX3CR1 阳性 IA-IE 阴性巨噬细胞创建子门，并选择 F480 与 CD11b 以鉴定 CD11b 高 F480 中间 CX3CR1 阳性 IA-IE 阴性 Kolmer 氏双神经丛巨噬细胞和 CD11b 阳性 F480 阳性 CX3CR1 阳性 IA-IE 阴性边界相关巨噬细胞。然后从CD11b阳性F480阴性人群中，门为Ly6C与IA-IE。

选择主要对应于单核细胞或嗜中性粒细胞的IA-IE阳性Ly6C阴性群体和IA-IE阴性Ly6C阳性细胞。最后，为 CD11b 阳性 F480 阴性 IA-IE 阳性 Ly6C 阴性群体创建子门，并选择 CD11b 与 CX3CR1。然后鉴定CD11b高CX3CR1低和CD11b阳性CX3CR1阴性人群。

对于 T 细胞门控，如前所述排除 DAPI 阳性细胞后，使用 CD45 与 FSC-A 为 CD45 阳性免疫细胞创建子门，然后从 CD45 阳性细胞创建子门，选择 TCR β 与 CD11b。最后，为TCRβ阳性CD11b阴性群体创建子门，并选择CD4与CD8a。

鉴定 CD8 阴性和 CD4 阳性 T 细胞以及 CD8 阳性 CD4 阴性 T 细胞。这里展示的流式细胞术分析以高度可重复的方式成功地揭示了骨髓细胞和T细胞的主要亚群及其每只小鼠的相对总数。对髓系细胞的流式细胞术分析表明，脉络丛由CD11b阳性CX3CR1阳性F480高边界相关巨噬细胞填充，占脉络丛CD45阳性免疫细胞的80%。

还鉴定了科尔默氏双神经丛巨噬细胞的CD11b高F480中间体CX3CR1阳性IA-IE阴性群体。在CD11b阳性F480阴性免疫细胞中，表征了两个不同的Ly6C阴性IA-IE阳性细胞群体，可能对应于树突状细胞。T细胞的分析和门控策略突出了CD45阳性CD11b阴性TCRβ阳性细胞的次要群体的存在。

其中，每只小鼠约30-50个CD8阴性CD4阳性和CD8阳性CD4阴性T细胞在生理条件下填充脉络丛。控制灌注质量很重要，因为任何血液污染都可能模糊脉络丛的免疫成分。该方法之后可以对选定的细胞群进行分选，以进行进一步分析，例如批量或单细胞RNA测序。