Name: 从微解剖小鼠脉络丛中分离和表征免疫细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: 学习使用流式细胞术从灌注小鼠脑中分离脉络丛并表征巨噬细胞和T细胞等免疫细胞亚群。该方法可定量分析脉络丛免疫微环境，为研究脑免疫相互作用提供可靠方案。

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感谢巴斯德研究所动物饲养中心和CB-UTechS设施成员提供的帮助。本工作得到巴斯德研究所的经费支持。

所有操作均符合欧洲委员会关于实验动物管理的指导方针（指令86/609/EEC），并经伦理委员会No. 59、CETEA/CEEA No. 089批准，批准编号为dap210067，APAFIS #32382-2021070917055505 v1。
1. 材料准备
<ol>
	<li>将所有抗体（材料表）在 4 °C 下避光保存。</li>
	<li>DAPI 储存液（1 mg/mL）：用 PBS-/-（材料表）重悬粉末，分装后于 -20 °C 保存。</li>
	<li>DAPI 工作液（0.1 mg/mL）：将 DAPI 储存液用 PBS-/- 按 1:10 的比例稀释。</li>
	<li>磁珠激活细胞分选（MACS）缓冲液：在 PBS-/- 中配制含 2 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）和 0.5% 牛血清白蛋白（BSA）（材料表）的溶液。</li>
	<li>IV 型胶原酶储存液（20 U/μL）：用 PBS+/+（材料表）重悬粉末，分装后于 -20 °C 保存。 
	注意：IV 型胶原酶需要 MgCl2 才能完全激活；请勿对 IV 型胶原酶溶液进行冻融。</li>
	<li>麻醉镇痛溶液：将 150 μL 氯胺酮（150 mg/kg）、25 μL 赛拉嗪（5 mg/kg）和 330 μL 布托啡诺（0.1 mg/kg）溶于 1 mL 的 PBS-/- 中混合。 
	注意：麻醉镇痛溶液需现用现配，且存放时间不得超过一天。</li>
	<li>肝素溶液（100 U/mL）：用 PBS-/- 重悬粉末。</li>
	<li>准备灌注插入系统，将一根导管连接至装有 PBS-/- 的锥形烧瓶。在灌注管末端连接一根 23&#160;G 针头。打开灌注系统，让 PBS 流动直至导管内无气泡。</li>
	<li>准备配备光源的双目放大镜。</li>
</ol>
C57BL/6 小鼠的饲养
<ol>
	<li>用于分析CP髓系细胞或T细胞时，每种细胞使用四只小鼠，并合并四只小鼠的CP组织（每侧脑室各两个，第三脑室和第四脑室）&#160;脑室脉络丛（每只小鼠独立处理，共八只）；不合并脉络丛样本可能导致因稀有免疫细胞群体丰度极低而无法检测到这些细胞。</li>
	<li>让小鼠在任何实验开始前至少适应环境7天。将小鼠饲养在恒定温湿度的无病原体环境中，光照周期为12小时光照/12小时黑暗或14小时光照/10小时黑暗，自由饮水并提供标准颗粒饲料 随意摄取.</li>
</ol>
3.&#160;PBS 灌注与脑组织解剖
<ol>
	<li>称量每只小鼠的体重，并按10 μL/g剂量腹腔注射麻醉-镇痛混合溶液（步骤1.6）。</li>
	<li>等待约30分钟以确保充分镇痛（通过轻捏小鼠脚趾检查麻醉深度）。</li>
	<li>将麻醉的小鼠仰卧于解剖支架上，并用胶带固定其掌部至解剖支架。</li>
	<li>用镊子夹住动物皮肤，剪开腹部、横膈膜和胸腔，暴露心脏。 
	注意：打开胸腔后，脑组织将处于缺氧状态，操作必须准确迅速&#160;并迅速进入灌注的下一步操作。</li>
	<li>向左心室直接注射 20 μL 浓度为 100 U/mL 的肝素溶液。</li>
	<li>用精细剪刀在右心房做一处至少3 mm的切口，以使血液流出体外。</li>
	<li>紧接着，将连接在灌注管末端的23 G针头插入左心室顶端。</li>
	<li>以最大流速打开灌注系统并等待灌注完成：使用23 G针头，以约6 mL/min的流速，灌注在3分钟内完成。 
	注意：肝脏等器官均匀变色表明灌注有效。</li>
	<li>关闭灌注系统，并将针头从心脏心室中取出。</li>
	<li>移除小鼠掌部的胶带，将小鼠置于腹位。</li>
	<li>用镊子夹住动物的皮肤，配合剪刀，从眼睛至耳朵处去除头部顶部的皮肤。</li>
	<li>使用剪刀，先从两眼之间开始剪开颅骨，然后从每只眼睛外侧沿咬肌上方剪向脊髓。操作时应使用剪刀尖端，动作轻柔，避免剪刀损伤脑组织。</li>
	<li>用镊子夹住两眼之间的颅骨末端，打开颅骨。</li>
	<li>使用剪刀剪断脊髓，用镊子夹取脑组织，将镊子的两个尖端置于脑组织外侧，倾斜脑组织并将其放入盛有冰冻PBS的培养皿中+/+随后立即收集CP。 
	注意：检查脑组织是否出现变色，以验证灌注效果。</li>
</ol>
4. 从脑组织中分离脉络丛
<ol>
	<li>将脑组织背侧朝上置于培养皿中，并位于双目放大镜的物镜下方。</li>
	<li>用镊子固定脑组织，同时将另一把镊子的两端沿大脑半球之间的中线插入。</li>
	<li>使用镊子将同侧的皮层、胼胝体和海马从隔区拉开，暴露侧脑室及部分第三脑室。</li>
	<li>侧脑室脉络丛（lateral CP）呈长条状薄膜结构，沿侧脑室分布，两端展开。用细镊子的尖端夹住侧脑室脉络丛。注意收集可能被海马后褶遮挡的三角形后部区域。</li>
	<li>将对侧半球的皮层、胼胝体和海马从隔区拉开，以充分暴露整个第三脑室及对侧侧脑室。</li>
	<li>用精细镊子收集第三脑室脉络丛（third CP），其为一短小结构，表面呈颗粒状。</li>
	<li>收集另一侧的侧脑室脉络丛。</li>
	<li>将镊子的两端插入小脑与中脑之间，分离小脑与脑桥及延髓，以暴露第四脑室。</li>
	<li>第四脑室脉络丛（fourth CP）为一长条状球形结构，表面呈颗粒状，沿第四脑室分布，位于小脑与延髓之间，从右侧外侧端延伸至左侧端。使用精细镊子将其完整取出。 
	注意：镊子表面的硅烷涂层可防止脉络丛黏附于镊子上。</li>
	<li>对其余七只小鼠重复步骤 3.1–4.9。在此期间，已收集的脉络丛可暂时保存在置于冰上的离心管中。</li>
</ol>
5. 流式细胞术分析样品的制备
<ol>
	<li>将所有已解剖的脉络丛（CP）组织放入离心管中，并用 PBS+/+ 补充至终体积 750 μL。 
	注意：使用细镊子将解剖后的脉络丛转移至离心管时会带入少量 PBS+/+。建议直接将现有液体体积补充至 750 μL，而非弃去后重新加入 750 μL 新鲜 PBS+/+，以避免可能的脉络丛组织损失。</li>
	<li>加入 15 μL 浓度为 20 U/μL 的 IV 型胶原酶储备液（见步骤 1.5），使终浓度为 400 U/mL。 
	注意：可添加 DNAse I（150 μg/mL）以防止细胞过度聚集。</li>
	<li>将脉络丛与 IV 型胶原酶在 37 °C、轻度振荡（300 RPM）条件下孵育 45 分钟。</li>
	<li>轻轻吹打约 10 次，以完成脉络丛的解离。</li>
	<li>用 MACS 缓冲液（见配方步骤 1.4）将脉络丛离心管补至 1.5 mL，以终止 IV 型胶原酶活性。 
	注意：IV 型胶原酶的活性在低温下停止，并可被血清白蛋白抑制。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，并用 1.5 mL MACS 缓冲液重悬细胞进行洗涤。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 500 × g 再次离心 5 分钟，弃去上清液，将细胞重悬于 220 μL MACS 缓冲液中。</li>
	<li>从细胞悬液中分装出 10 μL 作为未染色对照（见后续步骤 5.18）。</li>
	<li>从细胞悬液中另取 10 μL 作为 DAPI 单染对照（见后续步骤 5.12）。</li>
	<li>将剩余的 200 μL 细胞悬液与抗小鼠 CD16/CD32 封闭抗体（1:100）在 4 °C 预孵育 20 分钟，以阻断非特异性 Fc 受体介导的结合。</li>
	<li>将细胞均分为两份，每份 100 μL，分别装入两个离心管中（一管用于髓系细胞分析，另一管用于 T 细胞分析）（见后续步骤 5.14）。</li>
	<li>取步骤 5.9 中保留的含 10 μL 细胞的 DAPI 单染对照样本，用 MACS 缓冲液补至 100 μL（见后续步骤 5.14）。</li>
	<li>准备十一支新离心管，每管加入 100 μL MACS 缓冲液，用于抗体单染（步骤 5.14.4）和全染对照（步骤 5.14.5），并向每管中加入一滴补偿微珠。 
	注意：补偿对照将用于设定荧光检测激光的电压，并评估各荧光染料在其他检测通道中的非特异性信号，以便在后续进行补偿校正。</li>
	<li>样本的抗体孵育：
	<ol>
		<li>髓系细胞样本：加入 0.1 mg/mL DAPI（1:100）（见步骤 1.3）、FITC 标记的抗小鼠 CD45 抗体（1:100）、PE-Dazzle 594 标记的抗小鼠 CD11b 抗体（1:100）、APC 标记的抗小鼠 CX3CR1 抗体（1:100）、BV711 标记的抗小鼠 Ly6C 抗体（1:100）、PE 标记的抗小鼠 F4/80 抗体（1:100）以及 APC-Cy7 标记的抗小鼠 IA-IE 抗体（1:100）。</li>
		<li>T 细胞样本：加入 0.1 mg/mL DAPI（1:100）、FITC 标记的抗小鼠 CD45 抗体（1:100）、PE-Dazzle 594 标记的抗小鼠 CD11b 抗体（1:100）、APC 标记的抗小鼠 TCRβ 抗体（1:100）、PE 标记的抗小鼠 CD8a 抗体（1:100）以及 APC-Cy7 标记的抗小鼠 CD4 抗体（1:50）。</li>
		<li>DAPI 单染对照（来自步骤 5.12）：加入 0.1 mg/mL DAPI（1:100）。</li>
		<li>抗体单染补偿微珠：将之前用于髓系细胞和 T 细胞样本的九种抗体（相同稀释比例）分别单独加入含有微珠的九支离心管中（每种抗体对应一管）。 
		注意：单染补偿对照将在补偿步骤中用于确定每种荧光标记物的阳性荧光峰。分析仪将这些信号与未染色对照 CP 细胞中的阴性信号进行比较。</li>
		<li>抗体全染补偿微珠：将所有用于髓系细胞染色的抗体加入一支微珠管中，将所有用于 T 细胞染色的抗体加入另一支微珠管中。 
		注意：全染补偿对照将用于设定各荧光激光检测通道的电压，并评估荧光染料在其他通道中的潜在非特异性信号。</li>
		<li>在冰上避光孵育 30–45 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 MACS 缓冲液将所有离心管补至 1.5 mL。在 4 °C 条件下，以 500 × g 离心 5 分钟，沉淀细胞和补偿微珠。</li>
	<li>弃去上清液，并用 1.5 mL MACS 缓冲液洗涤细胞和补偿微珠。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 500 × g 再次离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>将细胞和补偿微珠重悬于 500 μL MACS 缓冲液中。将未染色对照（步骤 5.8）用 MACS 缓冲液补至 500 μL。</li>
	<li>将含有 CP 细胞的各管样本（未染色 CP、DAPI 单染对照、髓系细胞和 T 细胞样本）通过 70 μm 细胞筛进行过滤。</li>
</ol>
6. 流式细胞术
注意：本方案中使用的流式细胞仪配备以下5种激光器：355 nm紫外激光器、405 nm紫激光器、488 nm蓝激光器、561 nm黄绿激光器和637 nm红激光器。
<ol>
	<li>使用细胞仪设置、追踪（CST）界面以及CST质控微球，对细胞仪执行每日质量控制检查，以确保分析之间的一致性、仪器性能稳定以及目标荧光强度的可重复性。</li>
	<li>设置流式细胞术实验时，创建包含双变量图和直方图的新实验。确保包含前向散射面积（FSC-A）和侧向散射面积（SSC-A）图，以及每种荧光颜色的直方图，用于监控数据采集过程。</li>
	<li>通过未染色对照CP细胞设定FSC-A和SSC-A参数的光电倍增管（PMT）电压，以定义细胞形态学特征。</li>
	<li>通过在未染色对照CP细胞上设定荧光染料的阴性峰，并利用经所有抗体染色的补偿微球确定各荧光标记的阳性峰，设定每种荧光标记的电压，同时确保检测信号未超出量程，且在其他通道中无过强的交叉信号干扰。</li>
	<li>创建补偿矩阵以分析每种单色补偿对照。在FSC-A/SSC-A图上圈选适当的细胞群后，通过直方图检查单染对照样本并记录补偿对照数据。在记录完所有单染样本后，计算补偿矩阵。</li>
	<li>记录髓系细胞和T细胞群体中检测到的所有事件。</li>
</ol>
7. CP 髓系细胞门控
<ol>
	<li>选择 FSC-A 与 SSC-A 并根据细胞大小设门。</li>
	<li>使用 FSC-A 与前向散射高度（FSC-H）创建单细胞的子门。</li>
	<li>使用 DAPI 与 FSC-A 创建活细胞的子门，排除 DAPI+ 细胞。</li>
	<li>使用 CD45 与 FSC-A 创建 CD45+ 免疫细胞的子门。</li>
	<li>在 CD45+ 细胞基础上创建子门，并选择 CD11b 与 F4/80，鉴定以下两个群体：CD11b+ F4/80+ 和 CD11b+ F4/80- 群体（见下一步 7.8）。</li>
	<li>创建 CD11b+ F4/80+ 细胞的子门，并选择 CX3CR1 与 IA-IE，鉴定出 CX3CR1+ IA-IE+ BAM 群体，进一步命名为 CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE+ BAM，以及 CX3CR1+ IA-IE- 巨噬细胞。</li>
	<li>创建 CD11b+ F4/80+ CX3CR1+ IA-IE- 巨噬细胞的子门，并选择 F4/80 与 CD11b，鉴定出 CD11bhigh F4/80intermediate 和 CD11b+ F4/80high 两个群体，分别进一步称为 CD11bhigh F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- Kolmer's epiplexus 巨噬细胞和 CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE- BAM。 
	注：CD11bhigh F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- 与 CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE- 细胞在 F4/80intermediate 至 F4/80high 和 CD11bhigh 至 CD11b+ 水平之间略有混合。</li>
	<li>从 CD11b+ F4/80- 群体（步骤 7.5）设门分析 Ly6C 与 IA-IE，选择 IA-IE+ Ly6C- 群体和主要对应于单核细胞/中性粒细胞的 IA-IE- Ly6C+ 细胞。 
	注：IA-IE- Ly6C+ 细胞大量存在可能反映在无炎症状态下动物灌注效率存在问题；其丰度应较低。</li>
	<li>为 CD11b+ F4/80- IA-IE+ Ly6C- 群体创建子门，并选择 CD11b 与 CX3CR1，鉴定出 CD11bhigh CX3CR1low 和 CD11b+ CX3CR1- 两个群体。</li>
</ol>
8. CP T 细胞门控
<ol>
	<li>选择 FSC-A 与 SSC-A 并根据细胞大小设门。</li>
	<li>使用 FSC-A 与前向散射高度（FSC-H）创建单细胞的子门。</li>
	<li>使用 DAPI 与 FSC-A 创建活细胞的子门，排除 DAPI+ 细胞。</li>
	<li>使用 CD45 与 FSC-A 创建 CD45+ 免疫细胞的子门。</li>
	<li>在 CD45+ 细胞中创建子门，并选择 TCRβ 与 CD11b，排除 CD11b+ 髓系细胞，圈选 TCRβ+ CD11b- T 细胞群体。</li>
	<li>对 TCRβ+ CD11b- 群体创建子门，并选择 CD4 与 CD8a，鉴定 CD8- CD4+ T 细胞和 CD8+ CD4- T 细胞。</li>
</ol>

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<li>Borst, K., Dumas, A. A., Prinz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+Immune+and+non-immune+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Microglia: Immune and non-immune functions.</a> Immunity. 54 (10), 2194-2208 (2021).</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

旨在研究免疫系统对脑稳态及脑部疾病作用的研究主要集中于脑实质内驻留的细胞，而忽视了脉络丛（CP）等脑边界结构，尽管后者对脑功能具有至关重要的贡献2,3。由于脉络丛体积小、驻留免疫细胞数量少且组织获取困难，对其进行免疫细胞群体分析具有挑战性。对全脑免疫细胞（CD45+）进行的流式细胞术分析无法有效鉴定脉络丛中稀有的免疫细胞群体。为了高精度地表征脉络丛的免疫组成，本研究对经PBS灌流小鼠分离的脉络丛组织进行了流式细胞术分析。该方法可排除循环中的CD45+细胞以及脉络丛中的CD45-细胞（如周细胞、内皮细胞和上皮细胞）32。通过聚焦于髓系细胞和T细胞群体的设门策略，可鉴定出脉络丛中主要的免疫细胞亚群。
当前方案的关键步骤是PBS灌注。由于脉络丛（CP）免疫细胞十分稀少，血液污染可能完全掩盖其局部异质性。常规需检查肝脏和脑组织的褪色情况作为对照，以确保血液污染降...

自19世纪末保罗·埃尔利希发现血脑屏障以来th 近一个世纪以来，大脑一直被认为几乎与其他器官和血液系统相互隔离。然而，过去十年中出现了一种新概念，即大脑功能受到多种生物因素的塑造，例如肠道微生物群以及全身性的免疫细胞和信号分子。1,2,3,4与此同时，其他脑部边界结构，如脑膜和脉络丛（CP），已被确认为活跃的免疫-脑相互作用界面，而非惰性的屏障组织5,6,7,8.
脉络丛（CP&#160;）构成血-脑脊液屏障，是分隔大脑与外周系统的重要边界之一。它们位于脑室系统的四个脑室内，即第三脑室、第四脑室以及两个侧脑室，并邻近参与神经发生的区域，如脑室下区和海马齿状回的颗粒下区3。结构上，脉络丛由一层有孔毛细血管网组成，这些毛细血管被单层上皮细胞包裹，上皮细胞之间通过紧密连接和黏附连接相互连接9,10。脉络丛上皮细胞的主要生理功能包括脑脊液的生成，后者可清除大脑中的代谢废物和蛋白质聚集体；此外，还负责多种信号分子（包括激素和神经营养因子）从血液向脑内的生成与受控转运11,12,13。脉络丛分泌的分子可调节大脑活动，例如通过调控神经发生和小胶质细胞功能14,15,16,17,18,19，这使得脉络丛在维持大脑稳态中发挥关键作用。脉络丛还参与多种免疫活动；在非病理状态下，脑实质中的主要免疫细胞类型为小胶质细胞，而脉络丛的免疫细胞群体多样性则与外周器官相当3,7，提示在脉络丛处存在多种免疫调节与信号传导通路在发挥作用。
脉络丛（CP）的内皮细胞与上皮细胞之间的空间即CP间质，主要由边界相关巨噬细胞（BAM）占据，这些细胞在炎症信号刺激下可表达促炎性细胞因子及与抗原呈递相关的分子3。另一类巨噬细胞亚型——Kolmer's epiplexus细胞，则位于CP上皮的顶侧表面20。CP间质同时也是树突状细胞、B细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞、固有淋巴样细胞以及T细胞的生态位，其中T细胞多为效应记忆T细胞，能够识别中枢神经系统抗原7,21,22,23,24。此外，当机体或大脑受到干扰时，CP部位免疫细胞群体的组成和活性会发生改变，例如在衰老10,14,15,21,25、微生物群扰动7、应激26以及疾病状态27,28过程中均可见此类变化。值得注意的是，这些变化被认为会间接影响大脑功能；例如，在脑衰老过程中，CP中的CD4+ T细胞向Th2型炎症偏移，进而触发来自CP的免疫信号，可能参与调控与衰老相关的认知功能下降14,15,21,25,29。因此，阐明CP免疫细胞的特性对于深入理解其对CP上皮生理功能及分泌活动的调控作用至关重要，也将有助于解析其在健康与疾病状态下对大脑功能的间接影响。
脉络丛（CP）是仅包含少量免疫细胞的小型结构。其分离需要在灌注预处理后进行显微解剖，否则血液中的免疫细胞将造成严重污染。本方案旨在通过流式细胞术对脉络丛中的髓系细胞和T细胞亚群进行表征。该方法可鉴定在非炎症条件下小鼠脉络丛中约90%的免疫细胞群体，与近期采用其他方法解析脉络丛免疫异质性的研究结果一致7,10,28。本方案可用于在体内（in vivo）研究疾病及其他实验范式下脉络丛免疫细胞区室的变化。

<table><tbody><tr><td>抗小鼠 CD16/CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>流式细胞术抗体</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>MP Biomedicals</td><td>160069</td><td>封闭试剂</td></tr><tr><td>APC 标记抗小鼠 CX3CR1</td><td>BioLegend</td><td>149008</td><td>流式细胞术抗体</td></tr><tr><td>APC 标记抗小鼠 TCRb</td><td>BioLegend</td><td>109212</td><td>流式细胞术抗体</td></tr><tr><td>APC-Cy7 标记抗小鼠 CD4</td><td>BioLegend</td><td>100414</td><td>流式细胞术抗体</td></tr><tr><td>APC-Cy7 标记抗小鼠 IA-IE</td><td>BioLegend</td><td>107628</td><td>流式细胞术抗体</td></tr><tr><td>BD FACSymphony A5 细胞分析仪</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>流式细胞仪分析仪</td></tr><tr><td>BV711 标记抗小鼠 Ly6C</td><td>BioLegend</td><td>128037</td><td>流式细胞术抗体</td></tr><tr><td>IV 型胶原酶</td><td>Gibco</td><td>17104-019</td><td>用于解离 CP 组织的酶</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Scientific</td><td>62248</td><td>活/死细胞标记物</td></tr><tr><td>EDTA</td><td></td><td></td><td>离子螯合剂</td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>FST</td><td>14058-11</td><td>解剖工具</td></tr><tr><td>FITC 标记抗小鼠 CD45</td><td>BioLegend</td><td>103108</td><td>流式细胞术抗体</td></tr><tr><td>流量控制器灌注嵌件</td><td>CareFusion</td><td>RG-3-C</td><td>血液灌注嵌件</td></tr><tr><td>FlowJo 软件</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>分析软件</td></tr><tr><td>镊子</td><td>FST</td><td>11018-12</td><td>解剖工具</td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td>抗凝剂</td></tr><tr><td>Imalgene</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td></td><td>氯胺酮，麻醉剂</td></tr><tr><td>OneComp eBeads</td><td>Invitrogen</td><td>01-1111-42</td><td>用于实现补偿的对照微珠</td></tr><tr><td>PBS-/-</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>缓冲液</td></tr><tr><td>PBS+/+</td><td>Gibco</td><td>14040-091</td><td>缓冲液</td></tr><tr><td>PE 标记抗小鼠 CD8a</td><td>BioLegend</td><td>100708</td><td>流式细胞术抗体</td></tr><tr><td>PE 标记抗小鼠 F4/80</td><td>BioLegend</td><td>123110</td><td>流式细胞术抗体</td></tr><tr><td>PE-Dazzle 594 标记抗小鼠 CD11b</td><td>BioLegend</td><td>101256</td><td>流式细胞术抗体</td></tr><tr><td>Rompun</td><td>Bayer</td><td></td><td>赛拉嗪，麻醉剂</td></tr><tr><td>细镊</td><td>Dumoxel Biology</td><td>11242-40</td><td>解剖工具</td></tr><tr><td>Vetergesic</td><td>Ceva</td><td></td><td>丁丙诺啡，镇痛剂</td></tr></tbody></table>

显微解剖小鼠脉络丛中免疫细胞的分离与鉴定

Isolation and Characterization of the Immune Cells from Micro-dissected Mouse Choroid Plexuses

大脑不再被视为孤立运作的器官；越来越多的证据表明，外周免疫系统的变化能够间接影响大脑功能。在大脑与体循环之间的交界处，构成血液-脑脊液屏障的脉络丛（choroid plexuses, CP）被认为是外周与大脑之间通讯的关键部位。CP 可产生脑脊液、神经营养因子以及信号分子，从而影响大脑稳态。CP 同时也是一个活跃的免疫微环境。与生理条件下主要由小胶质细胞构成的大脑实质不同，CP 的免疫细胞具有高度异质性，其多样性与其它外周器官相似。CP 免疫细胞的多样性和活性会随着衰老、应激和疾病状态而改变，并可调节 CP 上皮细胞的活动，从而间接影响大脑功能。本实验方案的目标是分离小鼠 CP，并鉴定其中约 90% 的主要免疫细胞亚群。该方法可用于表征 CP 免疫细胞，帮助理解其在介导外周-大脑通讯中的功能。该方案有望揭示 CP 免疫细胞在健康状态及多种疾病条件下如何间接调控大脑功能。

本研究中展示的流式细胞术分析成功揭示了髓系细胞和T细胞的主要亚群（分别为图1和图2），以及每只小鼠体内这些细胞亚群的相对总数，且结果具有高度可重复性（图3）。
骨髓细胞的流式细胞术分析显示，脉络丛（CP）主要由CD11b+ CX3CR1+ F4/80high 的脑膜边界相关巨噬细胞（BAM）构成，占CP中CD45+ 免疫细胞的近80%。根据MHC-II的表达情况，这些BAM可分为两个不同亚群：其中IA-IE+ BAM为主要群体，占CD45+ 免疫细胞的72%，与既往发表的数据一致7；另一群为IA-IE- BAM。此外，还鉴定出Kolmer氏脉络丛上皮巨噬细胞（epiplexus mac...

本研究对分离灌注的小鼠脑脉络丛采用流式细胞术及两种不同的设门策略；该方案可鉴定出定位于此脑结构中的主要免疫细胞亚群。

大脑不再被视为孤立运作的器官；越来越多的证据表明，外周免疫系统的改变可以……

该方案可能有助于研究脉络丛和外周免疫细胞在不同情境下对小鼠脑功能调控的作用。本方案可对小鼠脉络丛中独特的免疫细胞群体进行深入的定性和定量分析。由于脉络丛体积小且呈透明状，初期解剖可能存在一定难度。我们建议先在未灌注的动物上进行练习。开始时，将从C57黑六小鼠中分离出的脑组织背侧朝上置于培养皿中，并将培养皿放置在双目解剖镜的物镜下方。用镊子固定脑组织的同时，将另一把镊子的两个尖端沿大脑半球之间的中线插入。用镊子将带有胼胝体和海马的皮层从隔区拉开，暴露侧脑室和部分第三脑室。辨认侧脑室脉络丛，其呈长纱状结构，衬于侧脑室内壁，两端呈扇形展开。然后用精细镊子的两个尖端夹取侧脑室脉络丛。需小心收集隐藏在海马后褶皱内的三角形后部组织。接着，将对侧半球的皮层、胼胝体和海马从隔区拉开，以充分暴露整个第三脑室及对侧侧脑室。使用精细镊子，采集第三脉络丛组织，其呈短小结构，表面具有颗粒状外观。然后采集另一侧的脉络丛。接着，将镊子的两个尖端插入小脑与中脑之间的区域，分离小脑与脑桥及延髓，以暴露第四脑室。随后，识别第四脑室脉络丛：其为一长条状球形结构，表面呈颗粒状，沿第四脑室自右侧外侧端延伸至左侧端，位于小脑与延髓之间。使用精细镊子采集第四脉络丛。将所有采集的脉络丛与IV型胶原酶孵育后，轻轻吹打约10次以完成组织解离。然后用MACS缓冲液定容至1.5毫升，以终止IV型胶原酶的活性。接下来，离心细胞并弃去上清液，然后用1.5毫升MACS缓冲液洗涤细胞。加入适当的补偿微珠和抗体溶液后，将样品置于冰上避光孵育30至45分钟。然后用1.5毫升MACS缓冲液充满离心管，离心收集细胞和补偿微珠。将细胞和补偿微珠重悬于500微升MACS缓冲液后，通过70微米细胞筛过滤细胞。开启流式细胞仪及软件后，选择前向散射面积对侧向散射面积图，并根据细胞大小设门圈选细胞群体。随后，以前向散射面积对前向散射高度图创建子门，圈选单细胞群体。接下来，创建一个针对活细胞的子门，以DAPI与前向散射面积为参数，排除DAPI阳性细胞。然后，以CD45与前向散射面积为参数，创建CD45阳性免疫细胞的子门。随后，从CD45阳性细胞中创建一个子门，并选择F480与CD11b，以鉴定CD11b阳性F480阳性以及CD11b阳性F480阴性细胞群。然后为 CD11b 阳性 F4/80 阳性细胞创建子门，选择 CX3CR1 与 IA-IE，以区分 CX3CR1 阳性 IA-IE 阳性边界相关巨噬细胞和 CX3CR1 阳性 IA-IE 阴性巨噬细胞。接着，为 CD11b 阳性 F4/80 阳性 CX3CR1 阳性 IA-IE 阴性巨噬细胞创建子门，选择 F4/80 与 CD11b，以鉴定 CD11b 高表达 F4/80 中等表达 CX3CR1 阳性 IA-IE 阴性 Kolmer 氏脉络丛巨噬细胞和 CD11b 阳性 F4/80 高表达 CX3CR1 阳性 IA-IE 阴性边界相关巨噬细胞。然后从 CD11b 阳性 F4/80 阴性细胞群中，对 Ly6C 与 IA-IE 进行设门分析。同时选中 IA-IE 阳性 Ly6C 阴性细胞群以及 IA-IE 阴性 Ly6C 阳性细胞，后者主要对应单核细胞或中性粒细胞。最后，对 CD11b 阳性 F480 阴性 IA-IE 阳性 Ly6C 阴性细胞群建立子门控，并分析 CD11b 与 CX3CR1 的表达情况。随后鉴定出 CD11b 高表达 CX3CR1 低表达和 CD11b 阳性 CX3CR1 阴性两个细胞群。进行T细胞设门时，首先如前所述排除DAPI阳性细胞，然后根据CD45与FSC-A绘制子门，圈选CD45阳性免疫细胞；接着从CD45阳性细胞中建立子门，选择TCR beta与CD11b的散点图，排除CD11b阳性的髓系细胞，圈选TCR阳性且CD11b阴性的T细胞群体。最后，对TCR beta阳性CD11b阴性细胞群体建立子门，通过CD4与CD8a进一步区分亚群。鉴定CD8阴性且CD4阳性的T细胞，以及CD8阳性且CD4阴性的T细胞。此处展示的流式细胞术分析以高度可重复的方式成功揭示了髓系细胞和T细胞的主要亚群，以及每只小鼠中这些细胞的相对总数。对髓系细胞的流式细胞术分析显示，脉络丛中存在大量CD11b阳性、CX3CR1阳性、F4/80高表达的边界相关巨噬细胞，这类细胞占脉络丛中CD45阳性免疫细胞的80%。还鉴定出Kolmer脉络膜丛巨噬细胞群体，其表型为CD11b高表达、F480中等表达、CX3CR1阳性、IA-IE阴性。在CD11b阳性、F480阴性的免疫细胞中，鉴定出两种不同的Ly6C阴性、IA-IE阳性细胞群体，可能对应于树突状细胞。对T细胞的分析和设门策略揭示了少量CD45阳性、CD11b阴性、TCRβ阳性细胞群体的存在。在生理条件下，每只小鼠脉络丛中约有 30–50 个 CD8 阴性 CD4 阳性 T 细胞和 CD8 阳性 CD4 阴性 T 细胞。必须严格控制灌注质量，因为任何血液污染都可能干扰脉络丛的免疫细胞组成。该方法可后续用于分选特定细胞群体，以进行进一步分析，例如批量或单细胞 RNA 测序。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

从微解剖小鼠脉络丛中分离和表征免疫细胞

本视频展示了从小鼠脉络丛中分离免疫细胞的操作步骤。该方法应用于神经免疫学研究，以探讨脉络丛中的免疫细胞如何影响大脑健康及多种神经系统疾病。...

从小鼠脉络丛中分离免疫细胞

人们对了解派尔集合淋巴结（Peyer's patches, PPs）中特定细胞亚群的免疫学功能日益关注，PPs 是肠道相关淋巴组织的主要诱导部位。本文概述了制备 PP 单细胞悬液用于流式细胞术分析以及制备 PP...

从小鼠派伊尔集合淋巴结中分离并免疫染色淋巴细胞与树突状细胞

成功研究小胶质细胞生物学的一个关键在于，从小胶质细胞从中枢神经系统组织中分离的过程中，保持其免疫功能的 ex vivo 状态。通过旋转振荡法分离小胶质细胞，可获得高纯度且具有免疫功能的细胞培养物，这一点在使用促炎刺激物脂多糖（LPS）和 Pam3CSK4（Pam）激活小胶质细胞后，通过荧光成像、免疫细胞化学和 ELISA...

从新生小鼠中分离保留免疫表型和功能的皮层小胶质细胞

本文介绍了一种从小鼠脑组织中分离原代小胶质细胞的实验方案。该技术有助于深入理解神经系统疾病。通过结合密度梯度离心与磁珠分选方法，可获得产量充足且纯度较高的细胞样本。此外，我们还概述了小胶质细胞表征的具体步骤。...

通过密度梯度离心法对小鼠原代小胶质细胞进行表征与分离

深入了解小胶质细胞功能的努力因缺乏能够模拟成熟小胶质细胞特性的培养模型而受到阻碍 体内...

分离与培养啮齿类动物小胶质细胞以在无血清培养基中促进动态分支状形态

我们提供了一种从成年小鼠大脑半球不同解剖区域分离小胶质细胞的方案，随后进行半自动化的文库制备，以实现全长转录组的深度单细胞RNA测序。该方法将有助于阐明小胶质细胞在健康与疾病状态下的功能异质性。...

从单个成年小鼠脑半球分离区域特异性小胶质细胞用于深度单细胞RNA测序

本文介绍了两种优化的实验方案，用于分析中枢神经系统（包括脑、脊髓和脑膜）中的常驻免疫细胞及外周来源的免疫细胞。这些方案有助于确定在稳态和炎症条件下定位于这些解剖区域的细胞的功能与组成。...

分离中枢神经系统组织及其相关脑膜用于免疫细胞的下游分析

脉络丛（CP）是神经科学中一个研究尚不充分的组织，在中枢神经系统的健康与疾病中发挥着关键作用。本方案描述了一种用于分离脉络丛的显微解剖技术，并介绍了利用扫描电子显微镜获取其细胞结构整体图像的方法。...

小鼠脉络丛的显微解剖与整体封片扫描电镜可视化

迄今为止，尚无能够从同一只小鼠中同时分离出所有主要中枢神经系统常驻细胞类型的实验方案。本方案适用于正常小鼠及实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠，可用于研究神经炎症期间复杂的细胞网络，同时减少所需实验小鼠的数量。...

从成年自身免疫性脑脊髓炎小鼠中同时分离主要的中枢神经系统常驻细胞类型

我们描述了一种利用磁珠激活细胞分选（MACS）技术从小鼠下丘脑（或类似的较小脑区结构）中快速分离小胶质细胞的实验方案。经MACS分选获得的下丘脑小胶质细胞可用于 离体 分析并可接种培养以进行 体外...

通过磁激活细胞分选法从新鲜灌注的成年小鼠脑组织中分离下丘脑小胶质细胞

为了研究脑部疾病中的免疫反应，一种常用的方法是分析免疫细胞的变化。本文提供了两种简单且有效的方案，用于从小鼠脑组织和颅骨骨髓中分离免疫细胞。...

从小鼠脑和颅骨中分离免疫细胞

学习使用流式细胞术从灌注小鼠脑中分离脉络丛并表征巨噬细胞和T细胞等免疫细胞亚群。该方法可定量分析脉络丛免疫微环境，为研究脑免疫相互作用提供可靠方案。

显微解剖小鼠脉络丛中免疫细胞的分离与鉴定

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