显微解剖小鼠脉络丛中免疫细胞的分离与鉴定
2022年2月3日
本研究对分离灌注的小鼠脑脉络丛采用流式细胞术及两种不同的设门策略；该方案可鉴定出定位于此脑结构中的主要免疫细胞亚群。
该方案可能有助于研究脉络丛和外周免疫细胞在不同情境下对小鼠脑功能调控的作用。本方案可对小鼠脉络丛中独特的免疫细胞群体进行深入的定性和定量分析。由于脉络丛体积小且呈透明状，初期解剖可能存在一定难度。
我们建议先在未灌注的动物上进行练习。开始时，将从C57黑六小鼠中分离出的脑组织背侧朝上置于培养皿中，并将培养皿放置在双目解剖镜的物镜下方。用镊子固定脑组织的同时，将另一把镊子的两个尖端沿大脑半球之间的中线插入。
用镊子将带有胼胝体和海马的皮层从隔区拉开，暴露侧脑室和部分第三脑室。辨认侧脑室脉络丛，其呈长纱状结构，衬于侧脑室内壁，两端呈扇形展开。然后用精细镊子的两个尖端夹取侧脑室脉络丛。
需小心收集隐藏在海马后褶皱内的三角形后部组织。接着，将对侧半球的皮层、胼胝体和海马从隔区拉开，以充分暴露整个第三脑室及对侧侧脑室。使用精细镊子，采集第三脉络丛组织，其呈短小结构，表面具有颗粒状外观。
然后采集另一侧的脉络丛。接着，将镊子的两个尖端插入小脑与中脑之间的区域，分离小脑与脑桥及延髓，以暴露第四脑室。随后，识别第四脑室脉络丛：其为一长条状球形结构，表面呈颗粒状，沿第四脑室自右侧外侧端延伸至左侧端，位于小脑与延髓之间。
使用精细镊子采集第四脉络丛。将所有采集的脉络丛与IV型胶原酶孵育后，轻轻吹打约10次以完成组织解离。然后用MACS缓冲液定容至1.5毫升，以终止IV型胶原酶的活性。
接下来，离心细胞并弃去上清液，然后用1.5毫升MACS缓冲液洗涤细胞。加入适当的补偿微珠和抗体溶液后，将样品置于冰上避光孵育30至45分钟。然后用1.5毫升MACS缓冲液充满离心管，离心收集细胞和补偿微珠。
将细胞和补偿微珠重悬于500微升MACS缓冲液后，通过70微米细胞筛过滤细胞。开启流式细胞仪及软件后，选择前向散射面积对侧向散射面积图，并根据细胞大小设门圈选细胞群体。随后，以前向散射面积对前向散射高度图创建子门，圈选单细胞群体。
接下来，创建一个针对活细胞的子门，以DAPI与前向散射面积为参数，排除DAPI阳性细胞。然后，以CD45与前向散射面积为参数，创建CD45阳性免疫细胞的子门。随后，从CD45阳性细胞中创建一个子门，并选择F480与CD11b，以鉴定CD11b阳性F480阳性以及CD11b阳性F480阴性细胞群。
然后为 CD11b 阳性 F4/80 阳性细胞创建子门，选择 CX3CR1 与 IA-IE，以区分 CX3CR1 阳性 IA-IE 阳性边界相关巨噬细胞和 CX3CR1 阳性 IA-IE 阴性巨噬细胞。接着，为 CD11b 阳性 F4/80 阳性 CX3CR1 阳性 IA-IE 阴性巨噬细胞创建子门，选择 F4/80 与 CD11b，以鉴定 CD11b 高表达 F4/80 中等表达 CX3CR1 阳性 IA-IE 阴性 Kolmer 氏脉络丛巨噬细胞和 CD11b 阳性 F4/80 高表达 CX3CR1 阳性 IA-IE 阴性边界相关巨噬细胞。然后从 CD11b 阳性 F4/80 阴性细胞群中，对 Ly6C 与 IA-IE 进行设门分析。
同时选中 IA-IE 阳性 Ly6C 阴性细胞群以及 IA-IE 阴性 Ly6C 阳性细胞，后者主要对应单核细胞或中性粒细胞。最后，对 CD11b 阳性 F480 阴性 IA-IE 阳性 Ly6C 阴性细胞群建立子门控，并分析 CD11b 与 CX3CR1 的表达情况。随后鉴定出 CD11b 高表达 CX3CR1 低表达和 CD11b 阳性 CX3CR1 阴性两个细胞群。
进行T细胞设门时，首先如前所述排除DAPI阳性细胞，然后根据CD45与FSC-A绘制子门，圈选CD45阳性免疫细胞；接着从CD45阳性细胞中建立子门，选择TCR beta与CD11b的散点图，排除CD11b阳性的髓系细胞，圈选TCR阳性且CD11b阴性的T细胞群体。最后，对TCR beta阳性CD11b阴性细胞群体建立子门，通过CD4与CD8a进一步区分亚群。
鉴定CD8阴性且CD4阳性的T细胞，以及CD8阳性且CD4阴性的T细胞。此处展示的流式细胞术分析以高度可重复的方式成功揭示了髓系细胞和T细胞的主要亚群，以及每只小鼠中这些细胞的相对总数。对髓系细胞的流式细胞术分析显示，脉络丛中存在大量CD11b阳性、CX3CR1阳性、F4/80高表达的边界相关巨噬细胞，这类细胞占脉络丛中CD45阳性免疫细胞的80%。
还鉴定出Kolmer脉络膜丛巨噬细胞群体，其表型为CD11b高表达、F480中等表达、CX3CR1阳性、IA-IE阴性。在CD11b阳性、F480阴性的免疫细胞中，鉴定出两种不同的Ly6C阴性、IA-IE阳性细胞群体，可能对应于树突状细胞。对T细胞的分析和设门策略揭示了少量CD45阳性、CD11b阴性、TCRβ阳性细胞群体的存在。
在生理条件下，每只小鼠脉络丛中约有 30–50 个 CD8 阴性 CD4 阳性 T 细胞和 CD8 阳性 CD4 阴性 T 细胞。必须严格控制灌注质量，因为任何血液污染都可能干扰脉络丛的免疫细胞组成。该方法可后续用于分选特定细胞群体，以进行进一步分析，例如批量或单细胞 RNA 测序。
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概述
本研究利用流式细胞术分析灌注小鼠脑组织中脉络丛内的免疫细胞群体。通过采用全面的设门策略，该研究鉴定了这一脑结构中的主要免疫细胞亚群，增进了对其在脑功能调控中作用的理解。
关键研究组成部分
研究领域
- 中枢神经系统免疫细胞分析
- 脉络丛功能
- 小鼠模型
背景
- 脉络丛是参与大脑稳态的关键结构。
- 由于脉络丛细胞体积小且透明，其分离与分析存在挑战。
- 本研究聚焦于脉络丛中免疫细胞的鉴定。
使用的方法
- 用于细胞群体分析的流式细胞术
- 离体灌注小鼠脑作为模型系统
- 免疫细胞亚群定量的设门策略
主要结果
- 揭示了脉络丛中存在大量巨噬细胞和T细胞群体。
- 鉴定了主要的免疫细胞亚群，包括CD11b阳性巨噬细胞。
- 证明了在不同小鼠中流式细胞术结果具有良好的可重复性。
结论
- 本方案提供了关于脉络丛免疫微环境的深入见解。
- 研究结果增进了对免疫细胞如何影响脑功能的理解。
常见问题
行业应用价值
从小鼠脉络丛中定量分离和表征免疫细胞，能够精确研究外周与大脑之间的免疫通讯。该实验流程有助于对与中枢神经系统疾病相关的神经免疫通路进行机制性风险评估和靶点验证。本方案具有良好的可重复性和对免疫细胞亚群的高分辨率，为转化生物标志物的发现及临床前模型的优化提供了基础。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够在脑-免疫界面实现对免疫细胞异质性的精细解析。
- 通过定量特定细胞群体，支持神经免疫靶点的功能验证。
- 通过阐明免疫细胞的作用，助力中枢神经系统药物研发的机制性风险降低。
筛选与检测方法开发
- 为下游实验提供标准化的免疫细胞悬液制备方法。
- 提供可重复的流式细胞术设门策略，用于定量免疫分析。
- 实现在不同实验条件下对免疫细胞亚群的可靠比较。
转化与临床前研究
- 将免疫细胞特征分析与疾病相关的中枢神经系统模型相整合。
- 通过支持细胞分选以进行转录组学分析，实现从发现到临床前验证的连贯性。
- 提高神经免疫调节策略的预测可靠性。
流程与工作流整合
本方案通过实现中枢神经系统模型中的免疫细胞分析、靶点验证以及下游分子分析，融入了从发现到临床前研究的连续过程。
- Discovery Biology：通过脉络丛细胞支持对免疫调节脑功能的假设验证。
- Screening：标准化免疫细胞分离及流式细胞术设门方法，以获得可重复的定量结果。
- Analytics：提供细胞亚群计数及设门数据，用于比较分析。
- Translational Research：实现特定免疫细胞群体的分选，用于转录组学或功能研究。
- Enterprise Reuse：建立可重复使用的流程，用于以中枢神经系统为重点的研发中免疫细胞的表征。
运营与企业影响
- 科学价值：提高神经免疫靶点筛选与验证的预测可信度。
- 操作价值：在不同研究间提供标准化、可重复的免疫细胞谱型分析。
- 战略价值：降低机制上的不确定性，支持中枢神经系统项目中基于风险评估的投资组合决策。
- 项目组合影响：基于定量的细胞亚群数据，实现神经免疫靶点的优先排序。
实施注意事项
- 需要具备小鼠脑组织解剖和流式细胞术设门策略的专业知识。
- 需要具备高参数流式细胞仪及细胞分选设备的使用条件。
- 要求严格的灌注和样本处理操作，以避免血液污染。
- 设门策略和抗体组合的标准化对于不同研究间的可比性至关重要。
- 针对不同小鼠品系或疾病模型可能需要进行方法优化。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:42
Dissection of the Choroid Plexus from the Brain
2:47
Preparation of Samples for Flow Cytometry Analysis
3:52
Choroid Plexus Myeloid Cells Gating
6:46
Choroid Plexus T Cells Gating
7:44
Results: Myeloid and T Cells Gating Strategy to Identify Choroid Plexus Immune Subsets
9:24
Conclusion
