访谈：CD1d介导的糖脂抗原呈递及NKT细胞激活的治疗潜力

您好，我叫 Mitchell Cronenberg，来自拉霍亚过敏与免疫学研究所。我目前担任该研究所的所长兼科学主任，但我仍活跃在科研一线，拥有自己的研究实验室。我们今天要讨论的，正是我们实验室所掌握的一项技术——CD1D四聚体。我实验室的大部分工作都围绕CD1D反应性T细胞展开。

这些细胞具有独特性，因为它们识别的是糖脂而非多肽。我实验室的另一个研究方向则涉及一个完全不同的课题——黏膜免疫系统及其调控机制。CD1分子是一类抗原呈递分子，这意味着它们能够结合抗原或蛋白质片段以及其他分子片段，并将其呈递给T细胞进行识别。

目前，抗原呈递分子主要有两种不同类型：一种是结合或呈递肽类分子的，另一种是结合脂质和糖脂类分子的。CD1分子则负责结合脂质和糖脂类分子。

这是它们的功能，即由这些分子支撑或呈递脂质和糖脂给T细胞。实际上，CD1分子有四种不同类型：CD1A、CD1B、CD1C和CD1D。而我们特别关注CD1D，部分原因是目前存在小鼠模型，使得CD1D成为研究最为深入的类型。CD1D可将糖脂呈递给一种特殊的T细胞，称为自然杀伤性T细胞（natural killer T cell），这是一种具有先天性和适应性免疫反应特征的特殊白细胞。

所呈递的糖脂可能是自身糖脂，尽管目前对这些自身糖脂的特征仍不甚清楚，也可能是微生物来源的糖脂。目前已知被呈递的糖脂来自两个来源：其一是所谓的FMS细菌，这类细菌可能是生物圈中最丰富的细菌。

它们生活在海洋中，生活在植物中，也生活在土壤中。然而，它们并不会使许多人致病。我想，我们已经非常习惯与这些细菌共存了。

我们所知的第二类是另一种类型的糖脂，称为含二酰基甘油的糖脂。这类糖脂存在于引起莱姆病的伯氏疏螺旋体（Borrelia borre）中，可能也存在于许多其他病原体中。目前我们刚刚开始揭示哪些不同类型的细菌含有这些糖脂。

因此，我们获得了由SMS产生的糖鞘脂以及由伯氏疏螺旋体产生的二酰基甘油脂质，可能还有许多其他真正具有致病性的脂质。这些脂质主要被装载到树突状细胞的CD1D分子上，尽管也可能发生在B淋巴细胞、肝脏中的ER细胞以及其他某些细胞类型中。这些CD1D分子经过溶酶体和内体，在此过程中可能与这些脂质结合，随后将脂质转运至细胞表面，供T细胞识别，包括我之前提到的自然杀伤T细胞。

当暴露于含有糖脂的细菌时，会发生的情况之一是，NK T细胞会迅速被激活。而传统的T细胞，即对肽类产生反应的T细胞，通常需要三到四天才能引发有效的免疫反应，尤其是当它们未曾接触过相应抗原时。

换句话说，如果它们是初始型的。相比之下，自然杀伤 T 细胞（NK T 细胞）可在数小时内被激活，并会迅速开始产生诸如伽马干扰素等细胞因子，这对于在极短时间内清除细菌至关重要。因此，它们在某些方面类似于天然免疫应答的模式。

通过研究模型抗原可知，CD1D 会进入晚期内体和溶酶体——这些是酸性较强的细胞内区室，在其中糖脂抗原被装载到 CD1 分子上。事实上，在抗原呈递细胞（如树突状细胞）内部存在特殊的转运蛋白，可协助将脂质装载至 CD1D 分子。而对于这些分枝杆菌、伯氏菌及其他我们所研究的胞外细菌而言，其脂质抗原必须以某种方式被转运进入细胞，很可能被送入溶酶体，并装载到 CD1 分子上。

随后，NKT细胞会立即被激活，而所有这些过程必须在数小时内发生在肝脏的肝窦、脾脏，可能还有骨髓以及其他存在NKT细胞的部位。四聚体结构对于明确鉴定这些具有先天特性的自然杀伤T细胞至关重要，这些特性使它们区别于其他T细胞。其他可用的标记物往往过于模糊，而四聚体则能够基于细胞抗原受体的特异性来识别这些细胞，这种特异性正是定义这类细胞的关键所在。四聚体的制备方法已有很长的历史。

该技术由 Mark Davis 和 John Alman 发明，其原理在于 T 细胞受体的亲和力较低，如果希望根据细胞的特异性来定义或鉴定细胞，其所识别的肽段或肽段与抗原呈递分子形成的复合物的亲和力不足，即结合强度不够，无法用于有效识别目标细胞。因此，Mark Davis 和 John Allman 发明了四聚体技术（tetramer technology），即通过构建抗原呈递分子与其所呈递肽段的四聚体复合物（在某些情况下为 OCRs），从而显著增强相互作用的亲和力。这样，你就可以检测到特异性识别流感病毒肽段及特定抗原呈递分子，或任何你感兴趣的抗原的细胞。

这项技术非常重要，因为它能够帮助您评估某种疫苗接种方案可能达到的效力。从二十世纪九十年代末开始，我们最初于2000年发表了一篇论文，迄今已被引用约500次。我们的工作是将该技术应用于脂质领域。

因此，我们制备了可溶性的 CD1 分子，并通过稍后将要描述的方法，能够将它们多聚化，换句话说，即将它们与特定的糖脂分子结合，从而将其用作检测特定 T 细胞受体的试剂。换句话说，这些试剂可用于检测那些能够识别我们感兴趣的糖脂分子与 CD1D 复合物的 T 细胞受体。四聚体（Tetramers）可用于任何需要分析 NKT 细胞数量、活化状态及其功能的情况。

在我们的实验室中，这可能来自多个不同项目的任意一个。例如，如果你想探究某个特定突变体和信号通路是否影响自然杀伤T细胞（NKT细胞）的发育，我们可以利用四聚体（tetramers）来检测NKT细胞的数量。此外，我们还可以检测其他标志物或其他细胞表面蛋白，以评估NKT细胞是否成熟，或在抗原刺激后是否被激活。利用四聚体，在抗原刺激后我们不仅能够判断NKT细胞是否被激活，还能进一步分析它们分泌哪些细胞因子。

因此，我们可以将四聚体染色与例如细胞内细胞因子染色相结合，利用多参数流式细胞术来分析NKT细胞中产生γ干扰素的百分比、产生IL-4的百分比以及同时产生两种细胞因子的百分比。通过这些方法，我们能够直接在体外检测这些细胞的多种细胞因子产生情况。此外，我们还可以开展进一步的实验。例如，我们可以利用四聚体来分选NKT细胞，进行体外培养，以研究它们如何与其他细胞类型相互作用；甚至可以将分选出的细胞转移至受体动物体内，例如那些因遗传原因缺乏NKT细胞的动物模型。

我们希望恢复这种功能。我们能够通过这种方法来探究细胞归巢的位置及其功能状态。最后，我知道在人类NKT细胞的研究中，研究人员实际上已利用四聚体在体外扩增细胞系，以获得足够数量的细胞用于分析，甚至可能用于治疗目的。

我们使用杆状病毒表达系统来制备CD1D四聚体。该过程始于一个常见的DNA构建体，其中包含启动子以及β2微球蛋白和CD1D重链的表达序列。因此，这种CD1分子是由两条多肽组成的异源二聚体。

因此，我们采用这种双启动子表达系统，并按照我们通道中所述的方法，用经精确滴定的vao病毒病毒感染昆虫组织培养细胞。然后感染细胞，并从组织培养基中收获细胞所表达的蛋白。CD1D重链经过特殊设计，专门用于四聚体的生产。

我们主要做两件事，或者更准确地说，三件事。第一件事是去除跨膜部分，因此我们表达的是可溶性蛋白。

其次，我们添加了一个六组氨酸标签，以便通过金属离子层析纯化该蛋白。第三，我们加入了一个称为生物素化位点的酶切位点，用于酶法生物素标记，这是本研究的创新之处。

戴维斯和阿尔曼首次发明四聚体生产技术时，这一点非常重要。因此，在我们收获蛋白质后，会通过镍柱色谱法在镍螯合柱上进行纯化。有时在此之后还会进行分子筛色谱。

然后该蛋白质可进行酶促生物素化孵育，一旦发生酶促生物素化，再与链霉亲和素抗体（strep ab）孵育时，便会形成四聚体。但可溶性CD1蛋白可在含有目标糖脂的溶液中基本孵育过夜。非常重要的是，糖脂不能用DMSO溶解，因为尽管DMSO通常是糖脂的稀释剂或溶剂，但CD1对该溶剂非常敏感。

因此，我们通常使用含有少量Tween和PBS的缓冲液。这种缓冲液对溶解大多数糖脂非常有效。对于CD1d的加载，该过程似乎是自发进行的，我们可使用来自不同厂家的链霉亲和素。

并且它与PE、FICO、eryn或PC藻青蛋白染料中任意一种偶联后，似乎都能很好地发挥作用，为我们提供非常理想的染色效果。因此总体而言，该实验流程与已充分表征的MHC I类四聚体的制备流程并无太大差异，唯一的区别在于我们不采用细菌表达系统，而是使用噬菌体表达系统，当然，我们所使用的抗原是脂质抗原而非多肽。有一点我需要特别强调：人类也存在NK T细胞，且其特异性与小鼠NK T细胞相同。

因此，这种特异性自我们与啮齿类动物分化以来至少已存在6000万年。事实上，我们使用与视频中展示的相同技术来制备人CD1D四聚体。但实际上，人类的NK T细胞能很好地与小鼠四聚体结合，反之亦然。因此，我们并不经常制备人源四聚体，因为我们完全可以使用小鼠四聚体进行人类相关研究。

因此，已有许多小鼠模型表明，NK T细胞是决定免疫应答结果的关键因素。这些模型涵盖对癌症的应答、自身免疫性疾病的调控、病原体的清除，甚至包括动脉粥样硬化斑块的形成，后者是一种发生在动脉中的慢性炎症过程。

这些细胞在人体中的重要性尚存一些疑问，因为在人体中它们的丰度较低。已有许多报道称，这些细胞在自身免疫状态下会发生改变，也有报道称它们在哮喘患者肺部高度富集。尽管《英国医学杂志》曾发表过一篇相关报道，但这一点仍存在争议。不过，目前已有多项人类研究提示这些细胞可能具有重要意义。

在临床试验方面，已有四项针对晚期癌症患者的 I 期临床试验测试了 NKT 细胞的激活。这些试验显示出一定的疗效证据，当然，这些患者病情严重，目前相关研究仍在多种不同类型的癌症中持续进行。此外，一些研究人员对将 NK T 细胞介导的疗法应用于自身免疫性疾病也感兴趣，尽管该方向尚未真正开展起来。

四聚体在这些研究中的作用主要体现在分析激动剂治疗后NKT细胞的变化情况。通常的思路是使用糖脂类激动剂，或在某些情况下使用其他研究团队正在开发的糖脂类拮抗剂，具体选择取决于所观察的免疫应答和疾病状态。随后，通过四聚体常规检测方法来评估NK T细胞在治疗后发生的变化。

另一种潜在用途是在体外扩增人源NKT细胞。通过抗原刺激等方法，在体外大量培养人源NKT细胞是相当可行且可能的，例如可使用四聚体，或使用表达合适糖脂的细胞进行刺激。除了使用四聚体或细胞外，还需添加细胞因子。

但在这些条件下，可以大量扩增人源 NK T 细胞。此外，波士顿至少有一个研究团队对这类疗法感兴趣，而非基于糖脂的疗法。我实验室的另一部分工作则致力于黏膜免疫的研究。

大多数免疫学家关注的是淋巴结和脾脏中的淋巴细胞或白细胞。然而，我们体内大部分的淋巴细胞实际上存在于肠道黏膜中，而该部位也含有大约10¹⁴到10¹⁵个细菌。因此，从微生物角度来看，我们身体的大部分是无菌的，但肠道并非如此。

此外，在肠道中也存在大量白细胞。这些细胞具有独特的特性，但实际上对其研究尚不充分。因此，我们开展了一些针对这些细胞的基础科学研究。

但我们还研究一种我称之为免疫失调的过程，即肠道引发炎症性肠病，这类疾病本质上是小肠或大肠的免疫介导性疾病，其名称分别为克罗恩病（Crohn's disease）和溃疡性结肠炎（ulcerative colitis）。尽管我们也会开展一些人类相关研究，但大部分工作集中在小鼠模型上。我们拥有我认为非常优良的小鼠模型，可用于研究导致类似克罗恩病症状的黏膜免疫系统失调过程。

我们正在研究这一过程以及干预该过程的方法，最终目的是为患有这些免疫介导性疾病的患者开发出更有效的治疗方法。因此，最后我们可以稍加思考一下，未来十年左右免疫学将走向何方，而要准确预见十年后的发展确实非常困难，尽管这听起来可能令人惊讶。

我认为，黏膜免疫系统实际上是免疫学中尚未深入探索的主要领域之一。尽管越来越多的研究人员和越来越多的高水平研究团队正逐渐对黏膜免疫学研究产生兴趣。我认为另一个将产生巨大影响的领域是遗传学，特别是人类遗传学；随着我们不断推进——更准确地说，是迈向完成一千个人类基因组序列的测定，我们将真正有可能针对个体开展研究，并评估DNA变异如何影响免疫应答。

目前，大多数关于基本通路的优秀研究都涉及啮齿类动物。啮齿类动物，尤其是小鼠，对我们的研究至关重要。但我认为，未来当我们考虑个体中复杂的自身免疫现象或其他可能发生的状况时，我们将能够基于人类的遗传多态性来开展这类研究。

我们将能够评估多态性，然后利用这些信息尝试预测其对免疫反应的影响，并最终推进到我所称的、也是其他人所称的个性化免疫治疗，或更广义上的个性化医疗。因此，遗传学将产生巨大的影响。我们已经在小鼠遗传学中拥有了非常强大的工具。

我们可以敲除任何我们想要的基因，也可以在特定细胞类型中敲除基因的表达。我们能够完成许多令人惊叹的研究工作。

但我认为，未来我们将从人类免疫反应的角度来研究和理解免疫应答与免疫力。