Name: 有机溶剂基蛋白质沉淀，在质谱分析之前实现强大的蛋白质组纯化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: 学习基于有机溶剂的蛋白质沉淀方法，用于质谱分析前的高效蛋白质组纯化。该方案可在数分钟内完成，实现高回收率与纯度，适用于自下而上和自上而下的蛋白质组学工作流程。

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本工作由加拿大自然科学与工程研究理事会资助。作者感谢加拿大滑铁卢市生物信息解决方案公司（Bioinformatics Solutions Inc.）以及加拿大多伦多市病童医院SPARC生物中心（分子分析部）在质谱数据获取方面的贡献。

1. 材料考虑与样品预处理
<ol>
	<li>仅使用高纯度溶剂（丙酮、氯仿、甲醇）（&#62;99.5%）和化学试剂，无过量水分。</li>
	<li>在水中配制氯化钠和硫酸锌溶液（1 M）。 
	注意：盐溶液可在室温下长期保存，&#160;只要无污染物或微生物生长即可。</li>
	<li>使用能够容纳所需样品和溶剂体积并诱导沉淀的最小规格聚丙烯（PP）微量离心管。</li>
	<li>确保待沉淀样品中的SDS浓度不超过2%（w/v）。如果SDS浓度过高，用水稀释样品。</li>
	<li>确保蛋白浓度在 0.01 至 10 g/L 之间，以获得最佳沉淀效率。 
	注意：沉淀反应的最佳蛋白质量范围为1-100 µg。</li>
	<li>确保使用前所有溶剂和溶液均无颗粒物。可进行过滤处理（&#60;0.5 µm）或离心步骤（10,000 x g 室温下离心1分钟，以去除未溶解的颗粒物。</li>
	<li>如果需要进行二硫键还原和烷基化，请在蛋白质沉淀之前完成这些步骤。过量的还原剂和烷基化试剂将通过沉淀过程被去除。</li>
	<li>通过选择并执行以下任一方案（步骤 2、3、4 或 5）使蛋白质沉淀。</li>
</ol>
2. 基于离心管的丙酮快速蛋白沉淀法
<ol>
	<li>将90 µL（无颗粒）蛋白质或蛋白质组溶液移入一个聚丙烯（PP）微量离心管中，然后加入10 µL 1 M的水溶液NaCl。 
	注意：如果蛋白质组提取物的离子强度已超过100 mM，则无需额外添加盐。</li>
	<li>向样品中加入400 µL丙酮。盖紧管盖，轻轻敲击管壁以混合溶剂。无需剧烈混匀。 
	注意：只要保持各组分的相对比例不变，蛋白质、盐和丙酮的体积均可相应增加。</li>
	<li>将离心管在室温下静置孵育，至少2分钟。 
	注意：延长孵育时间（包括在较低温度下孵育，例如常规丙酮沉淀法中在冰箱内过夜沉淀）可能导致形成较大的（可见的）蛋白质聚集体颗粒（图1A），但通常不会提高总蛋白质回收率。</li>
	<li>孵育结束后，将样品放入离心机中，并记录离心管的方向。在室温下以至少10,000 × g 的离心力离心至少2分钟。</li>
	<li>打开管盖，通过缓慢倒置离心管将上清液小心倾入废液容器中。将倒置的管口轻触纸巾，以吸除残留溶剂。 
	注意：废液溶剂应妥善保存，并按照相关规程进行处理。</li>
	<li>对于含SDS的样品，加入400 µL新鲜丙酮，注意不要扰动沉淀物。 
	注意：步骤2.6为可选步骤。
	<ol>
		<li>立即对样品进行离心（室温下10,000 × g 或更高离心力离心1分钟），并将离心管以与初次离心相同的方向放入转子中。按照步骤2.5所述方法倾去洗涤溶剂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>打开管盖使样品完全干燥（约1分钟）。重新盖好管盖，随后进行沉淀物的溶解（步骤6）。</li>
</ol>
3. 低分子量（LMW）肽的沉淀（ZnSO4 + 丙酮）
<ol>
	<li>将54 µL蛋白组提取物加入2 mL聚丙烯（PP）样品瓶中，然后加入6 µL 1 M ZnSO4。 
	注意：通过加入丙酮至终体积浓度为97%，可实现对低分子量肽段（≤5 kDa）的最佳回收。假设使用2 mL PP样品瓶，初始样品体积最大为54 µL。</li>
	<li>加入1940 µL丙酮，使终体积浓度为97%。轻轻涡旋混匀，并在室温下静置至少2分钟。</li>
	<li>离心（10,000 × g，室温1分钟），通过倒置样品瓶去除上清液，然后将样品瓶轻触纸巾以吸除残留液滴。</li>
	<li>对于含SDS的样品，加入400 µL新鲜丙酮，注意不要扰动沉淀。 
	注意：步骤3.4为可选步骤。
	<ol>
		<li>立即按照步骤3.3的条件对样品进行离心，将样品瓶以与初次离心相同的方向放入转子中。按步骤3.3所述倾去洗涤溶剂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过短暂涡旋或超声处理（约5分钟），将所得的干燥沉淀重新溶解于水相溶剂中。</li>
</ol>
4. 通过氯仿/甲醇/水（CMW）进行蛋白质沉淀
<ol>
	<li>将100 µL蛋白质或蛋白质组溶液加入聚丙烯（PP）样品瓶中。依次加入400 µL甲醇和100 µL氯仿。盖紧瓶盖，短暂涡旋混匀。 
	注意：对于CMW沉淀，建议使用底部较窄的1.5 mL样品瓶（图2A）。 
	警告：氯仿溶剂应在适当的通风橱中操作。所有接触过氯仿的溶剂在废弃时均应作为卤化废物处理。</li>
	<li>迅速将300 µL水直接加入样品瓶中心。盖紧瓶盖，在室温下静置1分钟，期间避免扰动样品。 
	注意：溶液会立即呈现乳白色浑浊。加水后请勿混匀样品瓶。</li>
	<li>将PP样品瓶放入离心机，以至少5分钟（10,000 x g 或更高，室温）的条件进行离心。 
	注意：离心后将形成两层清晰的溶剂相（上层为甲醇/水；下层为氯仿）。在两相界面处会形成固体蛋白质沉淀（图2A）。</li>
	<li>使用较大的（1 mL）移液枪头，将样品瓶倾斜约45°，以均匀速度从上层溶剂中移除约700 µL溶剂。</li>
	<li>使用较小的（200 µL）移液枪头，继续从倾斜约45°的样品瓶中移除上层溶剂。以连续动作吸液，直至上层溶剂在瓶内形成液滴状。</li>
	<li>沿样品瓶内壁缓慢加入400 µL新鲜甲醇，注意不要扰动沉淀物。</li>
	<li>盖紧瓶盖，通过轻轻摇动样品瓶使溶剂层混合均匀。 
	注意：必须避免破坏沉淀物。切勿涡旋震荡样品瓶。</li>
	<li>记录样品瓶在转子中的方向，以至少10分钟（10,000 x g，室温）的条件进行离心。蛋白质沉淀将附着于样品瓶底部（图2B）。</li>
	<li>将样品瓶倾斜45°，使沉淀物朝下。将移液枪头置于样品瓶上缘，使用1 mL移液枪头以缓慢但连续的速度吸除上清液，保留约20 µL溶剂在瓶内。</li>
	<li>对于含SDS的样品，通过缓慢加入400 µL新鲜甲醇清洗蛋白质沉淀。切勿涡旋震荡样品瓶。
	<ol>
		<li>立即进行离心（10,000 x g，2分钟，室温），并将样品瓶以与初次离心相同的方向放入转子中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照步骤4.9的方法去除溶剂。将样品置于通风橱中自然晾干，直至残留溶剂完全挥发。</li>
	<li>参见步骤6中推荐的重溶解操作流程。</li>
</ol>
5. 使用一次性过滤柱进行蛋白质沉淀
注意：步骤 2-5 中描述的每种基于溶剂的沉淀方案均可在双级过滤和萃取柱中进行（参见材料表）。
<ol>
	<li>将插头连接到上层过滤柱（图3A）后，根据以下三种方案之一，加入所需体积的提取蛋白质组、盐和溶剂。
	<ol>
		<li>（方案1）使用丙酮进行蛋白质沉淀：混合90 µL蛋白质或蛋白质组溶液、10 µL 1 M水溶液NaCl和400 µL丙酮。在室温下静置孵育至少2分钟。 
		注意：对于高浓度蛋白质样品（1 g/L），将出现可见沉淀（图3B）。</li>
		<li>（方案2）用于低分子量（LMW）肽的沉淀：混合15 µL样品、1.5 µL 1 M ZnSO4和485 µL丙酮。在室温下静置孵育至少2分钟。 
		注意：水相样品中90 mM的盐浓度不会影响回收率，相对于步骤3推荐的100 mM无显著差异。</li>
		<li>（方案3）用于CMW沉淀：加入50 µL蛋白质组提取物、200 µL甲醇和50 µL氯仿。盖紧管盖并短暂涡旋混合。
		<ol>
			<li>迅速将150 µL水直接加入管中心。在室温下静置孵育1分钟。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在室温下，以2,500 × g离心2分钟，插头仍连接在过滤柱上。</li>
	<li>将过滤柱倒置，然后拧开并从柱底取下插头。</li>
	<li>将过滤柱放入一个洁净的收集管中，并放回离心机。在室温下以500 × g离心3分钟。弃去下层收集管中的穿滤液。 
	注意：如果上层过滤柱中仍有残留溶剂，请重新放入离心机进行额外一次离心。</li>
	<li>通过向过滤柱中加入400 µL丙酮来洗涤蛋白质沉淀（对于CMW沉淀，即步骤5.1.3，加入400 µL甲醇）。</li>
	<li>在室温下以500 × g离心3分钟，或直至上层柱中无残留溶剂。</li>
	<li>按照步骤6所述方法重新溶解沉淀物。</li>
</ol>
6. 蛋白质沉淀的再溶解
<ol>
	<li>在进行下述复溶操作前，立即向过滤柱底部的膜上加入 2–5 µL 异丙醇，润湿膜。</li>
	<li>采用以下其中一种复溶方法。
	<ol>
		<li>（选项 1）向过滤柱中加入至少 20 µL 含 ≥2% SDS 的水相缓冲液。盖紧后剧烈涡旋振荡（约 1 分钟）。或者通过超声处理（&#62;10 分钟）分散蛋白沉淀。
		<ol>
			<li>将样品在 95 °C 加热 5 分钟。加热后重复混匀步骤。 
			注意：Laemmli 上样缓冲液可重新溶解蛋白沉淀。但含 SDS 的样品与胰蛋白酶消化以及反相液相色谱-质谱联用（LC-MS）不兼容。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>（选项 2）配制 80%（v/v）的甲酸水溶液。将甲酸溶液预冷至 -20 °C，并同时预冷含有沉淀蛋白的过滤柱。
		<ol>
			<li>向过滤柱中加入 50 µL 冷甲酸，盖紧后涡旋振荡 30 秒。然后放回冷冻箱（-20 °C）10 分钟。</li>
			<li>再次涡旋振荡 30 秒。随后重复一次冷冻和混匀循环（10 分钟，-20 °C，30 秒涡旋）。</li>
			<li>加水至终体积为 500 µL，使甲酸稀释至 8%。 
			注意：冷甲酸法与后续的胰蛋白酶消化不兼容，但适用于液相色谱-质谱联用（LC-MS）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>（选项 3）向过滤柱中加入 50 µL 新鲜配制的 8 M 尿素水溶液。超声处理 30 分钟。
		<ol>
			<li>将过滤柱在室温下孵育 1 小时（可长达过夜）。</li>
			<li>用水或适当的缓冲液至少 5 倍稀释 8 M 尿素。 
			注意：稀释后，尿素溶解法适用于后续的胰蛋白酶消化以及液相色谱-质谱联用（LC-MS）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 蛋白质消化
<ol>
	<li>进行自下而上（bottom-up）质谱分析时，将重新溶解的蛋白质采用以下两种方法之一进行酶解消化。
	<ol>
		<li>（选项1）对于甲酸重溶，将步骤6.2.2.1中80%甲酸的初始体积减少至25 µL。在步骤6.2.2.3中，加入375 µL水将甲酸稀释至5%（v/v）。</li>
		<li>将胃蛋白酶以大约50:1的蛋白与酶质量比加入滤 cartridge 中。在过滤 cartridge 上安装塞子后，于室温下孵育样品过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>（选项2）对于尿素中重溶，在步骤6.2.3.2中加入100 mM Tris或碳酸氢铵，确保pH值在8至8.3之间。
	<ol>
		<li>以大约50:1的蛋白与酶质量比加入胰蛋白酶。在 cartridge 上安装塞子后，于37 °C温水浴中孵育样品过夜。</li>
		<li>通过加入10%三氟乙酸（TFA）将溶液酸化至终浓度1%，以终止酶解反应。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过移除滤膜底部的塞子，并将 cartridge 置于洁净离心管中离心（2分钟，5000 x g，室温），回收经胃蛋白酶或胰蛋白酶消化后的肽段。</li>
</ol>
8. 固相萃取净化
注意：消化后或溶剂交换后如需进一步进行样品脱盐，可按照所述方法对样品进行反相纯化。
<ol>
	<li>预处理SPE小柱（参见 材料表) 通过加入300 µL甲醇（2分钟，400 × g) 随后加入 300 µL 含 5% 乙腈/0.1% TFA 的溶液（2 分钟，400 × g).</li>
	<li>将已活化的固相萃取柱连接到含有复溶或消化后蛋白质的过滤柱底部。</li>
	<li>将蛋白质溶液通过固相萃取小柱离心（5 分钟，800 × g） g 在室温下）。如果上层小柱中仍有溶剂残留，将小柱重新放回离心机并重复离心。 
	注意：将样品再次通过固相萃取小柱可能提高回收率。</li>
	<li>向小柱中加入 300 µL 含 5% 乙腈/0.1% TFA 的水溶液。洗涤时，使液体流经固相萃取小柱（2 分钟，2000 × g），弃去穿流液。</li>
	<li>对于低分子量蛋白质或消化后的肽段，使用 300 µL 的 50% 乙腈/0.1% 甲酸溶液流经柱体以洗脱样品。&#160;TFA（5 分钟，2500 x g).</li>
	<li>对于完整蛋白质，按照步骤8.5操作，并使用300 µL的75%乙腈/0.1%三氟乙酸进行额外的洗脱步骤。合并两次所得提取液。 
	注意：步骤 8.6 为可选步骤。</li>
</ol>

Doucette 实验室提出了本研究中使用的 ProTrap XG 并为其申请了专利。AAD 也是 Proteoform Scientific 的创始合伙人，该公司实现了样品制备柱的商业化。

当残留的SDS浓度低于10 ppm时，可实现最佳的质谱表征效果。尽管其他方法（如FASP和磁珠上消化）能够实现定量去除SDS，但回收率存在差异31,32,33，而沉淀法的主要目标是同时最大化纯度和得率。这取决于能否在不扰动蛋白质沉淀物的前提下，有效分离上清液（含SDS）。在采用离心管进行沉淀时，当通过移液去除大部分上清液后，聚集的沉淀物意外丢失的风险会逐渐增加。因此，有必要保留较多的残余溶剂（约20 µL），并增加洗涤步骤34。洗涤步骤可稀释并去除管中的残余溶剂。特别是使用CMW时，一旦沉淀形成，无需对样品管进行涡旋振荡。剧烈震荡破坏沉淀物会增加因移液操作不当而导致样品丢失的风险。如果按照先前方案建议进行涡旋（vortexing）35，部分CMW沉淀物可能黏附在管盖内侧；再次离心后，沉淀物会固定在管盖上，可能导致约50%的样品损失。
<p class...

由于现代质谱仪在灵敏度、分辨率、扫描速度和多功能性方面的提升，基于质谱的蛋白质组分析已变得日益严谨。质谱技术的进步显著提高了蛋白质鉴定效率和定量准确性1,2,3,4,5。随着质谱仪器性能的改进，研究人员对前端样品制备策略提出了更高要求，期望在整个工作流程的各个阶段均能以最短时间实现高纯度蛋白质的定量回收6,7,8,9,10,11。为了准确反映生物系统的蛋白质组状态，必须以高效且无偏倚的方式从原始样品基质中分离蛋白质。为此，在提取过程中加入变性表面活性剂（如十二烷基硫酸钠，SDS），可确保蛋白质的有效提取和溶解12。然而，SDS会对电喷雾离子化产生强烈干扰，若未被彻底去除，将导致严重的质谱信号抑制13。
目前已有多种用于后续蛋白质组分析的SDS去除策略，例如使用一次性离心柱中包含的分子量截留滤膜来保留蛋白质14,15,16。滤膜辅助样品制备法（FASP）因其可将SDS有效去除至10 ppm以下，有利于实现最佳质谱（MS）分析，因而备受青睐。然而，FASP的蛋白质回收率存在较大波动，这促使研究人员探索其他技术。选择性捕获蛋白质（或表面活性剂）的色谱方法已发展为多种形式便捷的柱状或磁珠体系17,18,19,20,21。尽管这些蛋白质纯化策略简单且（理想情况下）具有良好的重复性，但传统的有机溶剂沉淀法在蛋白质分离中常被忽视。虽然溶剂沉淀法已被证明能成功将SDS去除至低于临界水平，但其蛋白质回收率长期以来令人担忧。多个研究团队观察到该方法存在蛋白质回收偏差，其沉淀产率受蛋白质浓度、分子量和疏水性影响，有时低至不可接受的程度22,23。由于文献中报道的沉淀方案差异较大，因此有必要建立标准化的沉淀条件。2013年，Crowell等人首次报道了在80%丙酮中蛋白质沉淀效率对离子强度的依赖性24。对于所有被检测的蛋白质，添加高达30 mM的氯化钠被证明是最大化回收率（最高可达100%）的关键。最近，Nickerson等人进一步证明，在丙酮沉淀过程中结合更高的离子强度（高达100 mM）和较高温度（20 °C），可在2–5分钟内实现接近定量的蛋白质回收25。但在此条件下，低分子量（LMW）蛋白质的回收率略有下降。因此，Baghalabadi等人在后续研究中通过结合特定盐类（尤其是硫酸锌）与更高比例的有机溶剂（97%丙酮），成功实现了低分子量蛋白质和肽段（≤5 kDa）的有效回收26。
尽管优化沉淀方案可为基于质谱的蛋白质组学提供更可靠的蛋白质纯化策略，但传统沉淀方法的成功在很大程度上依赖于操作人员的技术水平。本研究的主要目标是提出一种稳健的沉淀策略，以促进从污染性上清液中有效分离蛋白质沉淀。为此开发了一次性过滤柱，通过在多孔聚四氟乙烯（PTFE）膜滤器上方截留聚集的蛋白质，从而避免移液操作27。上清液中干扰质谱分析的组分可在短暂的低速离心步骤中被有效去除&#160;。该一次性过滤柱还配备可更换的固相萃取（SPE）柱，可在质谱分析前的蛋白质重溶解及可选的蛋白质消化步骤之后，方便地进行后续样品净化处理。
本文介绍了一系列推荐的蛋白质组沉淀实验流程，包括改良的丙酮法以及氯仿/甲醇/水28法，可在传统（基于离心管）或半自动化格式下进行，后者使用一次性双相过滤与提取 cartridge。文中重点展示了各方法的蛋白质回收率和十二烷基硫酸钠（SDS）去除效率，以及自下而上（bottom-up）液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）蛋白质组覆盖度，以说明每种方案的预期结果。同时讨论了每种方法的实际优势与局限性。

<table><tbody><tr><td>丙酮</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC177170010</td><td>&amp;le;0.002% 醛类</td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998-4</td><td>HPLC 级</td></tr><tr><td>碳酸氢铵</td><td>Millipore Sigma</td><td>A6141-1KG</td><td>固体</td></tr><tr><td>β-巯基乙醇</td><td>Millipore Sigma</td><td>M3148-25ML</td><td>分子生物学级</td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Millipore Sigma</td><td>B8026-5G</td><td>溴酚蓝钠盐</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Fisher Scientific</td><td>C298-400</td><td>氯仿</td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Honeywell</td><td>56302</td><td>LC-MS 流动相添加剂</td></tr><tr><td>Fusion Lumos 质谱仪</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>用于标准蛋白质混合物的分析</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Millipore Sigma</td><td>356352-1L-M</td><td>分子生物学用，&gt;99%</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4641</td><td>HPLC 级</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452SK-4</td><td>HPLC 级</td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-400-102</td><td>最高可达 21,000 ×g</td></tr><tr><td>微量离心管（1.5 mL）</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-130</td><td>锥形底</td></tr><tr><td>微量离心管&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;（2 mL）</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-321</td><td>圆底</td></tr><tr><td>移液器吸头&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;（0.1–10 &amp;mu;L）</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-197-28</td><td>通用型移液吸头，非无菌</td></tr><tr><td>移液器吸头&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;（1–200 &amp;mu;L）</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-302</td><td>通用型移液吸头，非无菌</td></tr><tr><td>移液器吸头&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;（200–1000 &amp;mu;L）</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-303</td><td>通用型移液吸头，非无菌</td></tr><tr><td>微量移液器</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-710-903</td><td>微量移液器三件套</td></tr><tr><td>胃蛋白酶</td><td>Millipore Sigma</td><td>P0525000</td><td>冻干粉末，&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&gt;3200 单位/mg</td></tr><tr><td>ProTrap XG</td><td>Proteoform Scientific</td><td>PXG-0002</td><td>每盒 50 个完整单元</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9888-1KG</td><td>ACS 试剂，&gt;99%</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28312</td><td>粉末状固体</td></tr><tr><td>timsTOF Pro 质谱仪</td><td>Bruker</td><td></td><td>用于肝脏蛋白质组提取物的分析</td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L06374.AP</td><td>99%</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td>分子生物学级</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Millipore Sigma</td><td>9002-07-7</td><td>来源于牛胰腺，经 TPCK 处理</td></tr><tr><td>尿素</td><td>Bio-Rad</td><td>1610731</td><td>固体</td></tr><tr><td>水（去离子）</td><td>Sartorius Arium Mini 水纯化系统</td><td>76307-662</td><td>1 级超纯水（18.2 M&amp;Omega;·cm）</td></tr><tr><td>硫酸锌</td><td>Millipore Sigma</td><td>307491-100G</td><td>固体</td></tr></tbody></table>

基于有机溶剂的蛋白质沉淀法用于质谱前稳健的蛋白质组纯化

Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry

尽管质谱（MS）仪器的多项进展已改善了蛋白质组的定性和定量分析，但在质谱分析前采用更可靠的前端方法对蛋白质进行分离、富集和处理，对于成功的蛋白质组表征至关重要。蛋白质回收率低、回收量不一致以及表面活性剂等残留杂质均会对质谱分析产生不利影响。与其他样品前处理策略相比，蛋白质沉淀常被认为可靠性差、耗时且技术操作困难。通过采用优化的蛋白质沉淀方案，可克服上述问题。对于丙酮沉淀，特定盐类、温度控制、溶剂组成和沉淀时间的组合至关重要；而氯仿/甲醇/水沉淀的效率则依赖于正确的移液操作和离心管处理。此外，这些沉淀方案也可在一次性离心柱中实现流程简化和半自动化。本文展示了传统方式下基于溶剂的蛋白质沉淀以及使用一次性两步过滤与提取柱的预期结果，包括通过自下而上（bottom-up）LC-MS/MS分析对蛋白质组混合物进行的详细表征。同时，还展示了基于SDS的工作流程相较于无污染蛋白质样品所表现出的更优性能。

图4总结了使用丙酮在一次性滤芯中通过小瓶法或柱式辅助沉淀蛋白质后预期的SDS去除效果。将传统的丙酮中过夜孵育（-20 °C）与室温下的快速丙酮沉淀方案（步骤2）以及CMW沉淀法（步骤4）进行了比较。残留的SDS通过亚甲蓝活性物质（MBAS）测定法29进行定量。简言之，将100 µL样品与100 µL MBAS试剂（250 mg亚甲蓝，50 g硫酸钠，10 mL硫酸，加水定容至1.0 L）混合，随后加入400 µL氯仿，并在紫外/可见光分光光度计上测定有机层在651 nm处的吸光度。所有方法均能将SDS降低至适合进行理想质谱分析的水平。
通过快速丙酮沉淀和CMW沉淀，可实现定量且可重复的蛋白质回收，如图5中经处理的酵母全细胞裂解液的SDS-PAGE分析所示。在一次性过滤柱中进行沉淀，可避免在含有SDS的上清液中进行精细移液操作，同时使聚集的蛋白质保留在膜滤器上方。所有沉淀方案均获得一致的回收效果，在三次独立重复实验中，...

本实验方案描述了在受控条件下通过溶剂法进行蛋白质沉淀，以在质谱分析前实现蛋白质组样品的高效、快速回收与纯化。

尽管质谱（MS）仪器的多项进展已提升了蛋白质组的定性和定量分析能力，但更可靠的前端……

这些实验方案旨在通过基于溶剂的沉淀方法，最大限度地提高蛋白质的回收率和纯度。我们将向您展示在离心管中进行沉淀的一些技巧，以及采用离心柱格式的半自动化方法。我们还对沉淀方案进行了优化，使其具有良好的重复性和较快的操作速度。整个实验方案仅需几分钟即可完成。这些实验方法表明，蛋白质的溶剂沉淀法非常适合质谱分析前的样品制备。这些方案可无缝整合到底部向上（bottom up）以及顶部向下（top down）的蛋白质组学工作流程中。今天为我们演示的是来自新斯科舍省哈利法克斯市Proteoform Scientific公司的Ziheng Dang和高级科学家Victoria Miller。将90 µL无颗粒的蛋白质溶液用移液器加入聚丙烯微量离心管中。然后向样品溶液中加入10 µL 1 mol/L的氯化钠水溶液和400 µL丙酮，盖上管盖，轻轻敲击混匀溶剂。静置孵育该管。 孵育后于室温下静置至少两分钟，将样品离心，注意记录离心管的方向，并在室温下以10,000 RCF或更高转速离心至少两分钟。离心后，可在管底观察到明显的白色沉淀。此时，打开管盖，通过倒置离心管将上清液倾倒至废液容器中。使用纸巾从样品瓶中吸除残留溶剂。对于含有 SDS 的样品，小心加入 400 微升新鲜丙酮，注意不要扰动沉淀。将小瓶以与初次离心相同的方向放入转子中，在室温下以10,000 × g或更高的速度立即离心一分钟。按照之前所述方法弃去洗涤溶剂。打开管盖，将样品干燥约一分钟。在通风橱内，进行蛋白沉淀溶解前操作。将100 µL蛋白溶液加入聚丙烯小管中。在通风橱内，加入400 µL甲醇，随后加入100 µL氯仿。盖紧管盖并短暂涡旋混匀。迅速将300微升水直接加入管中心。盖紧管盖，室温下静置1分钟，然后将聚丙烯管放入离心机，在10,000 ×g或更高转速下离心5分钟。观察到小瓶中有两层溶剂，并可见白色沉淀物。将小瓶倾斜约45度，先用1毫升大孔径微量移液枪头，随后换用200微升移液枪头，以均匀速度从小瓶上层溶剂中移除约700微升溶剂，直至瓶内液体形成液滴状。沿小瓶壁缓慢加入400微升新鲜甲醇，避免扰动沉淀物。盖紧离心管，轻轻摇动离心管使溶剂层混合均匀。将离心管放入转子离心机中，确保管底沉淀朝下，于室温下以10,000 ×g或更高的转速离心至少10分钟，以观察到白色蛋白质沉淀。将移液枪枪头沿小瓶上边缘放入，用1毫升微量移液枪头以缓慢但均匀的速度吸出上清液，保留约20微升溶剂。在通风橱中让残留溶剂自然干燥。为了沉淀蛋白质，使用一次性过滤柱，将插头连接到上部过滤柱。混合90微升蛋白质溶液、10微升1摩尔的氯化钠水溶液和400微升丙酮。室温下在台面上孵育至少两分钟，将带有插头的过滤柱放入离心机中，以2,500 × g离心两分钟。室温下将过滤柱倒置，拧下并移除柱底的插头。将过滤柱放入干净的收集管中，以500 × g离心蛋白样品三分钟。弃去下层收集管中的滤过液。向过滤柱中加入400微升丙酮洗涤蛋白质沉淀，于室温下以500 × g离心3分钟，或直至上层滤柱中无溶剂残留。参照此前已演示的蛋白质沉淀方案。在进行蛋白质沉淀重溶解方案前，通过直接向过滤柱底部膜上加入2至5微升异丙醇润湿膜，以重新溶解蛋白质。为制备蛋白质沉淀的重溶解液，配制体积分数为80%的甲酸水溶液。将该酸溶液预冷至零下20摄氏度，并将含有沉淀蛋白的过滤柱一同预冷。取50微升冰冷的稀释甲酸溶液加入预冷的过滤柱盖中，涡旋振荡30秒。然后将过滤柱放回零下20摄氏度的冰箱中冷冻10分钟。重复之前的涡旋和孵育步骤。加入 450 微升水，使最终体积达到 500 微升。将甲酸稀释至 8%。反转小柱，拧开并取下柱基底部的塞子，然后将固相萃取小柱连接到离心管上。将蛋白质在室温下以800 × g离心5分钟，通过SPE小柱。若上部小柱中仍有溶剂残留，将小柱重新放回离心机，再次离心。加入300 µL含0.1%三氟乙酸（TFA）的5%乙腈水溶液冲洗SPE小柱，在2000 × g下离心2分钟，使溶液流过小柱。对于低分子量蛋白质或酶解后的肽段，使用300 µL含0.1% TFA的50%乙腈溶液，在2500 × g下离心5分钟进行洗脱。对于完整蛋白质，则采用相应条件进行洗脱。使用 300 微升含 0.1% 三氟乙酸的 75% 乙腈进行额外的洗脱步骤。合并两次得到的提取物。该图比较了基于小瓶法或使用一次性滤 cartridge 进行蛋白质沉淀后的 SDS 耗竭效果。使用丙酮进行常规快速法和CMW法。所有方法均降低了SDS含量，以实现最佳的质谱分析效果。该图展示了通过快速丙酮沉淀和CMW沉淀处理后的酵母全细胞裂解液，在SDS-PAGE分析中定量的蛋白质回收结果。所有沉淀方案均获得了稳定的回收率。使用一次性过滤柱进行沉淀可避免在移取含SDS的上清液时需小心操作，同时通过膜滤器将聚集的蛋白质保留在上方。因此，在三次独立重复实验的上清组分中均未检测到可见条带。与基于小瓶的沉淀方法相比，基于滤芯的蛋白质沉淀在牛血浆经胃蛋白酶消化后的样品中表现出更优的回收率。当使用氯化钠时，滤芯方法在产率上的优势更为显著，而使用锌溶剂则获得了最高的产率。该图展示了各肽段样品的肽峰强度，比值大于一表示经一次性过滤滤芯处理的样品具有更高的肽段丰度。该图比较了三次重复样品制备中每种蛋白质鉴定出的肽段数量。这些图中的相关系数为 0.94 至 0.95，表明自下而上的质谱分析样品制备方法具有高度一致性。因此，一旦形成沉淀，务必避免扰动。如果保持沉淀物完整，将获得更高的得率。因此，务必记得用额外的丙酮洗涤沉淀物。这一步是为了彻底去除SDS，使样品尽可能纯净，从而获得最佳的质谱分析结果。因此，我们发现，通过倒置来去除过量溶剂比使用移液器吸取样品要简单得多，这种方法也能获得更稳定的产率。在室温下进行丙酮沉淀，相较于传统的在冰箱中沉淀，能够实现更稳定且更快的回收效果。

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基于有机溶剂的蛋白质沉淀法用于质谱前稳健的蛋白质组纯化

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