基于有机溶剂的蛋白质沉淀法用于质谱前稳健的蛋白质组纯化

这些实验方案旨在通过基于溶剂的沉淀方法，最大限度地提高蛋白质的回收率和纯度。我们将向您展示在离心管中进行沉淀的一些技巧，以及采用离心柱格式的半自动化方法。我们还对沉淀方案进行了优化，使其具有良好的重复性和较快的操作速度。

整个实验方案仅需几分钟即可完成。这些实验方法表明，蛋白质的溶剂沉淀法非常适合质谱分析前的样品制备。这些方案可无缝整合到底部向上（bottom up）以及顶部向下（top down）的蛋白质组学工作流程中。

今天为我们演示的是来自新斯科舍省哈利法克斯市Proteoform Scientific公司的Ziheng Dang和高级科学家Victoria Miller。将90 µL无颗粒的蛋白质溶液用移液器加入聚丙烯微量离心管中。然后向样品溶液中加入10 µL 1 mol/L的氯化钠水溶液和400 µL丙酮，盖上管盖，轻轻敲击混匀溶剂。静置孵育该管。

孵育后于室温下静置至少两分钟，将样品离心，注意记录离心管的方向，并在室温下以10,000 RCF或更高转速离心至少两分钟。离心后，可在管底观察到明显的白色沉淀。此时，打开管盖，通过倒置离心管将上清液倾倒至废液容器中。

使用纸巾从样品瓶中吸除残留溶剂。对于含有 SDS 的样品，小心加入 400 微升新鲜丙酮，注意不要扰动沉淀。

将小瓶以与初次离心相同的方向放入转子中，在室温下以10,000 × g或更高的速度立即离心一分钟。按照之前所述方法弃去洗涤溶剂。打开管盖，将样品干燥约一分钟。

在通风橱内，进行蛋白沉淀溶解前操作。将100 µL蛋白溶液加入聚丙烯小管中。在通风橱内，加入400 µL甲醇，随后加入100 µL氯仿。

盖紧管盖并短暂涡旋混匀。迅速将300微升水直接加入管中心。盖紧管盖，室温下静置1分钟，然后将聚丙烯管放入离心机，在10,000 ×g或更高转速下离心5分钟。

观察到小瓶中有两层溶剂，并可见白色沉淀物。将小瓶倾斜约45度，先用1毫升大孔径微量移液枪头，随后换用200微升移液枪头，以均匀速度从小瓶上层溶剂中移除约700微升溶剂，直至瓶内液体形成液滴状。沿小瓶壁缓慢加入400微升新鲜甲醇，避免扰动沉淀物。

盖紧离心管，轻轻摇动离心管使溶剂层混合均匀。将离心管放入转子离心机中，确保管底沉淀朝下，于室温下以10,000 ×g或更高的转速离心至少10分钟，以观察到白色蛋白质沉淀。

将移液枪枪头沿小瓶上边缘放入，用1毫升微量移液枪头以缓慢但均匀的速度吸出上清液，保留约20微升溶剂。在通风橱中让残留溶剂自然干燥。

为了沉淀蛋白质，使用一次性过滤柱，将插头连接到上部过滤柱。混合90微升蛋白质溶液、10微升1摩尔的氯化钠水溶液和400微升丙酮。

室温下在台面上孵育至少两分钟，将带有插头的过滤柱放入离心机中，以2,500 × g离心两分钟。室温下将过滤柱倒置，拧下并移除柱底的插头。将过滤柱放入干净的收集管中，以500 × g离心蛋白样品三分钟。弃去下层收集管中的滤过液。

向过滤柱中加入400微升丙酮洗涤蛋白质沉淀，于室温下以500 × g离心3分钟，或直至上层滤柱中无溶剂残留。参照此前已演示的蛋白质沉淀方案。在进行蛋白质沉淀重溶解方案前，通过直接向过滤柱底部膜上加入2至5微升异丙醇润湿膜，以重新溶解蛋白质。为制备蛋白质沉淀的重溶解液，配制体积分数为80%的甲酸水溶液。

将该酸溶液预冷至零下20摄氏度，并将含有沉淀蛋白的过滤柱一同预冷。取50微升冰冷的稀释甲酸溶液加入预冷的过滤柱盖中，涡旋振荡30秒。然后将过滤柱放回零下20摄氏度的冰箱中冷冻10分钟。

重复之前的涡旋和孵育步骤。加入 450 微升水，使最终体积达到 500 微升。将甲酸稀释至 8%。反转小柱，拧开并取下柱基底部的塞子，然后将固相萃取小柱连接到离心管上。

将蛋白质在室温下以800 × g离心5分钟，通过SPE小柱。若上部小柱中仍有溶剂残留，将小柱重新放回离心机，再次离心。加入300 µL含0.1%三氟乙酸（TFA）的5%乙腈水溶液冲洗SPE小柱，在2000 × g下离心2分钟，使溶液流过小柱。对于低分子量蛋白质或酶解后的肽段，使用300 µL含0.1% TFA的50%乙腈溶液，在2500 × g下离心5分钟进行洗脱。对于完整蛋白质，则采用相应条件进行洗脱。

使用 300 微升含 0.1% 三氟乙酸的 75% 乙腈进行额外的洗脱步骤。合并两次得到的提取物。该图比较了基于小瓶法或使用一次性滤 cartridge 进行蛋白质沉淀后的 SDS 耗竭效果。

使用丙酮进行常规快速法和CMW法。所有方法均降低了SDS含量，以实现最佳的质谱分析效果。该图展示了通过快速丙酮沉淀和CMW沉淀处理后的酵母全细胞裂解液，在SDS-PAGE分析中定量的蛋白质回收结果。

所有沉淀方案均获得了稳定的回收率。使用一次性过滤柱进行沉淀可避免在移取含SDS的上清液时需小心操作，同时通过膜滤器将聚集的蛋白质保留在上方。因此，在三次独立重复实验的上清组分中均未检测到可见条带。

与基于小瓶的沉淀方法相比，基于滤芯的蛋白质沉淀在牛血浆经胃蛋白酶消化后的样品中表现出更优的回收率。当使用氯化钠时，滤芯方法在产率上的优势更为显著，而使用锌溶剂则获得了最高的产率。该图展示了各肽段样品的肽峰强度，比值大于一表示经一次性过滤滤芯处理的样品具有更高的肽段丰度。

该图比较了三次重复样品制备中每种蛋白质鉴定出的肽段数量。这些图中的相关系数为 0.94 至 0.95，表明自下而上的质谱分析样品制备方法具有高度一致性。因此，一旦形成沉淀，务必避免扰动。

如果保持沉淀物完整，将获得更高的得率。因此，务必记得用额外的丙酮洗涤沉淀物。这一步是为了彻底去除SDS，使样品尽可能纯净，从而获得最佳的质谱分析结果。

因此，我们发现，通过倒置来去除过量溶剂比使用移液器吸取样品要简单得多，这种方法也能获得更稳定的产率。在室温下进行丙酮沉淀，相较于传统的在冰箱中沉淀，能够实现更稳定且更快的回收效果。