Name: 测量 果蝇 光感受器中光色素水平的电生理学方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T12:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: 学习利用电生理学方法测量果蝇光感受器中的光色素水平，通过检测光子吸收引起的电荷位移来表征双稳态光色素功能。该技术适用于视觉缺陷突变体的遗传筛选，可发现光转导机制中的细微异常。

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本研究由以色列科学基金会（ISF）和美国-以色列双边科学基金会（BSF）的资助支持。感谢Anatoly Shapochnikov先生协助构建石蜡灯丝加热器。

1. 利用视网膜电图测量强度-反应关系、持续性去极化后电位（PDA）以及早期受体电位（ERP）
<ol>
	<li>黑腹果蝇（D. melanogaster）的适宜饲养条件
	<ol>
		<li>将黑腹果蝇（D. melanogaster）饲养于装有标准黄色玉米培养基的瓶子中，并置于温度维持在24 °C、光照周期为12小时光照/12小时黑暗的培养箱内</li>
		<li>实验前至少24小时将果蝇瓶置于黑暗环境中</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通用实验装置准备
	<ol>
		<li>使用外径1 mm、内径0.58 mm（O.D × I.D）的含纤维硼硅酸盐玻璃毛细管拉制记录电极（图6L，O），电极电阻应为5–10 MΩ；可使用任何合适的拉制仪</li>
		<li>将两根银丝镀上AgCl2：将0.25 mm银丝插入3 M KCl溶液中，并连接至自制的5 V电源</li>
		<li>将每根镀银丝插入电极夹持器中（图6N）</li>
		<li>使用带细长尖端的注射器将过滤后的林格氏液（见表1）注入玻璃毛细管（图6M）</li>
		<li>将导线电极插入玻璃毛细管中，确保毛细管内的溶液与银丝接触良好</li>
		<li>将电极夹持器（图7P，N）插入两个电极显微操作器中（图7G）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>果蝇电生理记录前的制备步骤 
	注意：为保持果蝇处于暗适应状态，以下所有操作均应在微弱红光照明下进行。
	<ol>
		<li>使用果蝇麻醉系统（图6A，B）通过CO2气体麻醉瓶中的果蝇，并将其倒入麻醉容器中</li>
		<li>选取一只果蝇，用尖头镊子小心夹住其翅膀，其余果蝇用培养皿遮盖</li>
		<li>将果蝇正确放置于果蝇固定装置上，使其侧卧，背部朝向操作者手部（图6P）</li>
		<li>打开电烙铁电源，将电流调节至约2.25 A，该电流可使0.25 mm铂铱丝加热至约55–56 °C（见补充文件）</li>
		<li>用电烙铁蘸取少量低熔点（约55–56 °C）石蜡（图6F）</li>
		<li>用镊子夹起果蝇，通过电烙铁将其翅膀固定在果蝇固定装置上（图6I）</li>
		<li>用电烙铁将果蝇背部用石蜡连接至支架表面（图6P）</li>
		<li>将电烙铁尖端压在腿部连接处，熔化石蜡以同时覆盖所有腿部（图6P）</li>
		<li>在头部与背部之间的颈部区域滴加少量石蜡（图6P） 
		注意：特别注意避免果蝇头部过热；确保果蝇被牢固固定，在实验过程中无法移动，轻微移动可能导致记录中出现伪迹；确保胸部和腹部的气管开口（呼吸孔）未被石蜡覆盖</li>
		<li>将果蝇固定装置（图7Q）置于暗室法拉第笼内的磁性底座上（图7I），并确保果蝇距离导光管末端约5 mm（图7L）</li>
		<li>使用显微操作器将记录电极（图7P）置于果蝇眼睛上方，将接地电极（图7N）置于果蝇背部上方</li>
		<li>使用显微操作器将接地电极插入果蝇背部</li>
		<li>使用显微操作器将记录电极插入果蝇眼睛的外周区域 
		注意：电极插入眼睛后会观察到一个小凹陷；此时应将电极轻微上提，但不脱离眼睛，直至凹陷消失。也可在躯干和眼部涂抹少量电极凝胶，使电极浸入其中</li>
	</ol>
	</li>
	<li>光强-反应实验方案
	<ol>
		<li>在高压氙灯前放置橙色滤光片（590边缘滤光片），并使用大范围（衰减六个数量级）的中性密度（ND）滤光片</li>
		<li>在黑暗中等待60秒后，给予5秒光脉冲</li>
		<li>将ND滤光片更换为衰减程度较小的ND滤光片，每次递减一个数量级</li>
		<li>再次在黑暗中等待60秒后，给予第二个5秒光脉冲</li>
		<li>重复步骤1.4.1–1.4.4，逐步使用衰减更小的ND滤光片以增加光强（最后一次脉冲应完全不使用ND滤光片）。务必按正确顺序使用ND滤光片系列，即从高衰减开始，逐步过渡至低衰减</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PDA实验方案（仅适用于白眼果蝇）
	<ol>
		<li>使用橙色滤光片（590边缘滤光片）给予5秒最大强度光脉冲，以将最大量的感光色素转化为R态</li>
		<li>将橙色滤光片更换为宽带蓝色滤光片（BP450/40 nm），并以最大强度给予三次5秒光脉冲 
		注意：也可持续给予高强度蓝光，直至达到稳态电压响应</li>
		<li>在黑暗中等待60秒，将蓝色滤光片换回之前的橙色滤光片，并以60秒间隔给予两次5秒光脉冲</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ERP/M电位实验方案：测量M态的光平衡吸收光谱（仅适用于白眼果蝇10，25）
	<ol>
		<li>持续给予蓝光（带通（BP）450/40 nm）脉冲，直至达到稳态电压响应，使R1-6细胞中的感光色素最大限度地由R态转化为M态</li>
		<li>使用窄带（约20 nm）滤光片，在350–700 nm波长范围内（已知R1-6细胞感光色素的吸收光谱）给予短暂（&#60;3 ms）高强度闪光，测量M电位反应中M1相的峰值振幅（该值反映在特定波长下光平衡时变视紫红质的吸收10，25） 
		注意：为同步激活大量感光色素分子，需使用短暂而高强度的闪光，使光子能量集中在极短时间内。M电位包含两个组分：M1（角膜负相），反映光感受器中变视紫红质的电荷位移；M2（角膜正相11，33），反映光感受器在视网膜小叶中对M1响应的放大效应9，10，11。这两个组分均可识别和测量，但建议优先测量M1电位，因其为M态水平的直接线性反映。若使用M2，应通过轻度类胡萝卜素缺乏处理确保其振幅处于线性范围24，25</li>
		<li>再次给予持续蓝光（BP450/40 nm）脉冲，随后给予另一波长的短暂（&#60;1 ms）高强度闪光</li>
		<li>重复该方案，直至覆盖M态在光平衡状态下的完整吸收光谱</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 采用全细胞电压钳记录法测量R1-6细胞R态和M态作用光谱的ERC方案
注意：有关全细胞电压钳记录使用的详细方案，请参见 Katz 等人34。M电位利用视网膜电图（ERG）仅测量M态的激活，因为R态的贡献被膜电容所抑制。相比之下，视网膜电图电位（ERC）可测量R态（正向ERC）和M态（负向ERC）的激活，因为电压钳记录消除了膜电容的影响（见引言）。
<ol>
	<li>将视色素转化为所需状态（R 或 M）。要实现 R 转化为 M，首先用短暂的（&#60;1 ms）蓝色适应光（BP450/40 nm）闪光使果蝇适应。要实现 M 转化为 R，则给予短暂的橙色适应光（OG590 边缘滤光片）闪光。</li>
	<li>给予一个波长在 350–700 nm 范围内的短暂闪光（&#60;1 ms），并测量 ERC 反应的最大负相或正相振幅，该振幅反映了在此特定波长下 M/R 的吸收特性。 
	注：为了同步激活大量视色素分子，需要使用短暂而强烈的闪光，以在极短时间内集中光子能量。由于 R 和 M 的吸收光谱存在重叠，蓝色闪光诱导的 R 向 M 的最大转化率可达总视色素分子的约 80%（图 3A）。因此，在波长低于约 550 nm 时，ERC 包含两个组分：负相反映变视紫红质的反应，正相反映残留视紫红质的反应。ERC 与光强呈线性关系（图 5D）。因此，为了获得 R 和 M 状态的光谱敏感性，需在不同波长下将 ERC 的每个相位按等能量进行归一化处理29。</li>
	<li>使用不同波长的闪光重复步骤 2.1–2.2。</li>
	<li>绘制归一化后的正相和负相 ERC 随波长变化的曲线。 
	注：强光闪光会通过光敏感通道引发巨大电流，导致感光细胞产生代谢压力，进而引起与光无关的通道开放。ERC 信号叠加在此构成性电流之上。</li>
</ol>

<ol><li>Vogt, K., Kirschfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+identity+of+the+chromophores+of+fly+visual+pigment%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwissenschaften%22%5BJournal%5D)">Chemical identity of the chromophores of fly visual pigment.</a> Naturwissenschaften. 77, 211-213 (1984).</li>
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<li>Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+light-induced+response+of+the+central+retinular+cells+from+the+electroretinogram+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Isolation of light-induced response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila.</a> Journal of Comparative Physiology. 98, 345-355 (1975).</li>
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<li>Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+of+the+prolonged+depolarizing+afterpotential+%28PDA%29+and+its+role+in+genetic+dissection+of+Drosophila+phototransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">The history of the prolonged depolarizing afterpotential (PDA) and its role in genetic dissection of Drosophila phototransduction.</a> Journal of Neurogenetics. 26 (2), 106-117 (2012).</li>
<li>Satoh, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin+translocation+is+stoichiometric+to+rhodopsin+isomerization+and+accelerated+by+phototransduction+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Arrestin translocation is stoichiometric to rhodopsin isomerization and accelerated by phototransduction in Drosophila photoreceptors.</a> Neuron. 67 (6), 997-1008 (2010).</li>
<li>Byk, T., Bar Yaacov, M., Doza, Y. N., Minke, B., Selinger, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+arrestin+cycle+secures+the+fidelity+and+maintenance+of+the+fly+photoreceptor+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Regulatory arrestin cycle secures the fidelity and maintenance of the fly photoreceptor cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 1907-1911 (1993).</li>
<li>Dolph, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin+function+in+inactivation+of+G+protein-coupled+receptor+rhodopsin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Arrestin function in inactivation of G protein-coupled receptor rhodopsin in vivo.</a> Science. 260, 1910-1916 (1993).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

使用该方法的主要优势在于 果蝇 感光细胞制备的优势在于其易于获取、光刺激操作简便且精确，最重要的是，能够应用分子遗传学的强大技术手段7已通过广泛的遗传学研究确立 果蝇 作为解析复杂生物过程遗传机制的极为有用的模型系统7结构相对简单 果蝇 基因组（仅包含四条染色体，包括X和Y性染色体、两条较大的常染色体——染色体2和染色体3，以及微小的点状第四染色体）、易于培养的特性以及较短的世代周期（在24 °C下约为2周）使其成为 果蝇 适用于筛选大量诱变个体果蝇。此外，由于平衡染色体的构建，使得任何分离出的突变体的分离与维持成为可能；平衡染色体含有显性标记和多重倒位，可阻止其与天然染色体发生重组。现有的分子工具已使得对 体外 在天然细胞环境中修饰的基因产物37这一强大的方法已产生大量突变果蝇，其新蛋白质功能缺陷是原本难以预测的7.
<p class="jove_c...

光激活的视紫红质（R）是一种G蛋白偶联受体（GPCR），由一种含有7个跨膜结构域的蛋白质（视蛋白）和一个发色团组成。 黑腹果蝇 （果蝇）, 光子吸收诱导11-的异构化顺式-3-羟基视黄醛发色团转化为全-转-3-羟基视黄醛1，促进视紫红质构象转变为变视紫红质（M, 图1A）。与脊椎动物视紫红质不同，无脊椎动物视紫红质的主要组分&#160;发色团不会从视蛋白上解离，从而形成生理活性的暗稳定色素状态M。随后，全-反式视黄醛进一步吸收光子转-3-羟基视黄醛发色团诱导发色团的异构化2,3，生成具有11-的R色素状态顺式-3-羟基视黄醛发色团。R态是一种在暗处稳定且生理上无活性的光色素。此外，发色团还存在极快的光子再生途径4，与脊椎动物非常相似&#160;视色素，无脊椎动物中存在一条酶促的缓慢再生途径，其中部分步骤由感光细胞周围的视网膜细胞完成5,6.
果蝇&#160;作为一种研究无脊椎动物光感受器的模式生物，具有显著优势。特别是其制备材料易于获取，且能够应用分子遗传学技术，这使得 黑腹果蝇 一个强大的模型系统7因此，若干 体内 和 离体 研究光转导的一般实验方法以及光敏色素水平的特定实验方法已经建立。最简单的方法 体内 该方法利用了相对较大的细胞外记录的光刺激电压反应 果蝇 眼。因此，光刺激会在整个眼球中引发一种电电压反应，可通过细胞外视网膜电图（ERG）记录进行测量，该反应幅度约为脊椎动物眼球对光产生的视网膜电图（ERG）反应的10³倍8,9。该 果蝇 ERG反应 robust 且易于获得，这使其成为识别由突变引起的光反应异常的便捷方法。ERG对光的反应主要来源于感光细胞、色素（胶质）细胞以及视网膜小叶的二级神经元（参见 图1B）。ERG 的主要成分包括：（i）光感受器的细胞外电压反应，（ii） &#34;开启&#34; 和 &#34;关闭&#34; 光刺激开始和结束时由髓板神经元产生的瞬时反应（图2A,&#160;插入，开启，关闭），（iii）胶质细胞的缓慢反应（图2A，插图，箭头），以及（iv）短暂且瞬时的反应，该反应由光敏色素激活过程中电荷位移引起，发生于ON瞬变之前10 (图 2C [插图]&#160;D,&#160;E）。这一短暂反应由两个阶段组成（M1 和 M2， 图2C （插图）且仅在极强的光刺激下才会被诱导，这种刺激可同时激活数百万个光敏色素分子。在蓝光刺激下则不会观察到该现象（图 2D，蓝色轨迹）或在光敏色素水平显著降低的突变体中图2E，红色轨迹），但在消除 PLC 活性的突变体中其振幅略有增强（图 2E，橙色轨迹）。M1 相是果蝇的一种典型事件相关电位，源于光感受器中 M 的激活。M1 相具有正极性（细胞内），在信号反转型突触中以正常方式释放神经递质，从而激活视网膜下神经节细胞，这些细胞通过产生突触放大后的 M2 相来响应光感受器的去极化。因此，M1 和 M2 相均反映了 M 的激活10,11.
光感受器的去极化产生角膜正电位 &#34;在&#34; 瞬态反应，源于光感受器轴突与视叶单极神经元之间具有信号反转功能的突触10,11 (图1B）。ERG 的缓慢上升和衰减源于色素细胞的去极化（图2A, 插图中箭头所示，主要归因于 K+ 光感受器细胞的外排12 通过瞬时受体电位（TRP）和TRP类似物（TRPL）通道13,14,15这些缓慢的动力学组分在与光感受器对光反应的细胞内或全细胞记录相比较时，会很大程度上掩盖并扭曲光感受器反应的波形9,10此外，在极强光照下，会出现一种额外的瞬时反应，该反应先于并部分融合于 &#34;在&#34; 短暂，可能被观察到（图2C [插图]D,E）。该信号直接来源于感光色素的大规模激活10.
已开发出多种使用中性密度（ND）和彩色滤光片以及强照明闪光的光照方案，用于研究眼睛整体功能，特别是光转导级联反应。这些方案还被用于研究感光色素的特性。
强度-反应协议通过逐渐增加光强度，测量整个眼球视网膜电图（ERG）电压反应的峰值幅度（图2A，B）。该协议有助于检测感光细胞对光敏感性的变化9。
延长去极化后电位（PDA）方案&#160;利用了视紫红质与变视紫红质吸收光谱的差异，这种差异在果蝇（Drosophila）中可实现大量光敏色素从R型向其生理活性且暗态稳定的M型中间态的转换2。在ERG电压反应中，给予一个相对较短的饱和光脉冲，并记录所产生的电压反应。在此条件下，去极化信号将达到一个上限（反转电位），因为只要激活极小比例（百分之几）的大量视紫红质分子（约1 × 108）就足以达到该上限。光转导组分的极高丰度确保了即使在光转导组分浓度显著降低或存在轻微功能障碍的突变体中，该上限仍可达到。这种情况使得难以分离出此类突变体。Pak等人引入了PDA筛选方法7，以寻求一种可靠且具有揭示性的检测手段来分离视觉突变体。在果蝇（Drosophila）中，PDA反应通过基因手段去除红色屏蔽色素，从而允许光敏色素转换，并施加蓝光刺激，后者被视紫红质优先吸收（图3A），因而导致R型向M型光敏色素状态发生大量净转换。由于R型向M型的大量净转换，光转导的终止在光敏色素水平上被破坏，从而导致光照关闭后仍维持长时间的持续兴奋（图2C，图4A［顶部］）。在PDA期间，感光细胞对后续测试光的敏感性降低，处于部分脱敏（失活）状态。PDA能够检测视紫红质生物合成中的微小缺陷，并测试感光细胞在较长时间内维持兴奋的最大能力。由于其严格依赖于高浓度的视紫红质，因此可有效识别光转导组分补充不足的突变。值得注意的是，PDA筛选已成功获得许多新的且极为重要的视觉突变体（详见Pak等人的综述7）。因此，由Pak等人分离出的PDA突变体7至今仍对果蝇（Drosophila）视觉系统的分析具有极高价值。
Drosophila 中的PDA由饱和蓝光诱导，导致光照结束后持续去极化（图4A [顶部]）。在施加诱导PDA的饱和蓝光后，外周感光细胞（R1-6）在黑暗中仍持续以最大能力保持活跃状态，达到饱和。在PDA期间再次施加额外的饱和蓝光，R1-6细胞在数秒内不会产生任何额外反应，但会在R7-8细胞中引发叠加于PDA之上的响应。这种叠加响应可通过这些细胞（R7-8）中表达的感光色素不同的吸收光谱加以解释16。PDA可被饱和橙光将M型视紫质光转化回R型而抑制（图4A [顶部]）。PDA能使感光细胞达到其最大活性状态，而这种状态无法通过强白光实现，因此PDA成为筛选Drosophila视觉突变体的重要工具。这是因为PDA能够检测出参与正常感光色素水平生成过程中相关蛋白的微小缺陷17,18。目前已分离出两类PDA缺陷型突变体：既无失活也无后电位（nina）突变体，以及有失活但无后电位（ina）突变体。前者的表型表现为缺乏PDA以及伴随的大规模感光色素水平降低所导致的失活现象（图4A [中部]）。后者的表型则显示存在失活反应，但在蓝光刺激后无暗相去极化，其机制尚不明确，该突变体视紫红质水平正常，但缺乏与TRP通道相互作用的蛋白质（图4A [底部]）。
PDA 的产生源于感光色素与视蛋白抑制蛋白（ARR2）之间的相对含量差异，ARR2 可结合并终止 M 活性19,20,21（图 1A）。在果蝇（Drosophila）的光感受器中，感光色素的含量约为 ARR2 的五倍19。因此，ARR2 的水平不足以使由大量 R 向 M 光转化所产生的全部 M 分子失活，导致在暗处持续存在过量的活性 M17,19,20,22,23。该机制可解释由突变或缺乏类胡萝卜素所导致的 PDA 反应消除现象24,25，因为这些情况会降低感光色素水平，但不影响 arrestin 的水平。此外，该解释也适用于 ARR2 空白突变（arr23）&#160;等位基因的表型21，在此类突变中，PDA 可在约弱 10 倍的蓝光强度下被诱发19,20,21（图 4B、C）。PDA 并非果蝇光感受器所独有，在所有已检测的物种中，只要其 M 状态在暗处稳定且其吸收光谱不同于 R 状态，即可发生足够程度的感光色素从 R 到 M 的光转化，从而出现 PDA。藤壶（Balanus）光感受器是 PDA 现象最早被发现且研究较为深入的一种物种，其 R 状态的吸收光谱波长比 M 状态更长2（图 3B）。因此，与果蝇不同，在藤壶中，橙红光会诱发 PDA，而蓝光则抑制 PDA2。
早期受体电位（ERP）实验方案利用了R或M激活过程中发生的电荷位移。视觉色素是脊椎动物&#160;和无脊椎动物感光细胞信号转导区表面膜的固有组成部分3。因此，当光敏色素分子从一个中间态转变为下一个中间态时，该激活过程伴随着电荷的位移4,26。由于光敏色素分子在电学上与膜电容平行排列4，其快速且同步的构象变化会在表面膜上产生迅速的极化改变；在果蝇中，这一过程发生在由约30,000至50,000根微绒毛堆叠而成的称为小眼杆（rhabdomere）的信号转导区。这种极化随后通过胞体的膜电容被动地扩散，直至整个细胞膜达到相同的极化状态。ERP即为这种电荷位移的细胞外记录结果。细胞内记录到的ERP则反映了细胞膜时间常数对细胞外ERP的积分效应4,27,28。由视觉色素电荷位移所激活的电流也可通过全细胞电压钳技术进行测量29,30（图5A-D），其主要优势在于（在早期受体电流（ERC）记录中）可最大程度减少膜电容对信号动力学的影响。
本实验方案部分介绍了如何对Drosophila复眼进行ERG（视网膜电图）记录9，以及如何通过全细胞记录技术对分离的Drosophila小眼进行ERC（光感受器电反应）测量31,32。我们还描述了用于研究光转导通路以及光敏色素特性的具体实验方案。

<table><tbody><tr><td>带细长针头的1 mL注射器</td><td></td><td></td><td>图6M</td></tr><tr><td>1 把粗头镊子</td><td></td><td>Dumont #5，标准型</td><td>0.1 毫米 × 0.06 毫米，长 110 毫米，Inox（图 6H）</td></tr><tr><td>2个聚光镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A/D转换器</td><td>分子装置</td><td>Digidata 1200</td><td>可能的替代设备：Molecular Devices 公司生产的任意 Digidata（例如 1440A）——图 7C</td></tr><tr><td>放大器</td><td>近乎完美的电子器件</td><td></td><td>可能的替代品：Warner Instruments - IE251A 或 IE-210（带前置放大器头级）- 图7D</td></tr><tr><td>防振台</td><td>纽波特</td><td>VW-3036-OPT-01</td><td>图7H</td></tr><tr><td>毛细血管</td><td>哈佛仪器</td><td>硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>1 mm × 0.58 mm（图6O）</td></tr><tr><td>Clampex</td><td>分子装置</td><td></td><td>软件</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;储液罐</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷光源</td><td>Schott</td><td>KL1500 LCD</td><td>图6C</td></tr><tr><td>精密擦拭器</td><td>Kimtech</td><td></td><td>Kimwipes（图6K）</td></tr><tr><td>电极夹 holder</td><td></td><td></td><td>适用于内径为1 mm的毛细管（图6N、图7N和图7P）</td></tr><tr><td>法拉第笼</td><td>自制</td><td></td><td>电磁噪声屏蔽与黑色前帘（图7K）</td></tr><tr><td>滤光片（颜色）</td><td>Schott</td><td>OG590，边缘滤光片</td><td>图7S</td></tr><tr><td>滤光片（颜色）</td><td>Schott</td><td>BP450/40 nm</td><td>图7S</td></tr><tr><td>滤光片（颜色）</td><td>运动外套</td><td>550 nm</td><td>图7S</td></tr><tr><td>冷光源滤光片（彩色）</td><td>Schott</td><td>RG630</td><td>图6C</td></tr><tr><td>过滤（加热）</td><td>Schott</td><td>KG3</td><td>图7S</td></tr><tr><td>滤光片（中性密度滤光片）</td><td>色度</td><td>6,5,4,3,2,1,0.5,0.3</td><td>图7S</td></tr><tr><td>闪光灯系统</td><td>霍尼韦尔</td><td></td><td>图 7U</td></tr><tr><td>带注射器的果蝇睡眠监测系统</td><td>Inject + matic</td><td></td><td>图6A-B</td></tr><tr><td>灯电源供应器</td><td>PTI</td><td>LPS-220</td><td>图7W</td></tr><tr><td>光探测器</td><td>自制</td><td></td><td>光电晶体管（图7O）</td></tr><tr><td>光导</td><td></td><td></td><td>3 mm 直径，1.3 m 长（图 7L,M）</td></tr><tr><td>光源</td><td></td><td></td><td>高压无臭氧75 W氙灯（以50 W功率运行），可替换为Cairn Research - OptoLED（图7R）</td></tr><tr><td>低温熔化石蜡</td><td>自制</td><td></td><td>由蜂蜡混合物（T&lt;sub&gt;m&lt;/sub&gt;&amp;asymp;62 &amp;deg;C）和石蜡以约3:1的比例混合，使其熔点达到约55℃&amp;ndash;56 &amp;deg;C（图6J）</td></tr><tr><td>用于果蝇的磁力架</td><td>自制</td><td></td><td>图6I 和 图7Q</td></tr><tr><td>带有前置放大器的微电极放大系统</td><td>近乎完美的电子器件</td><td></td><td>阻抗测试仪（图7G）</td></tr><tr><td>显微操作仪（机械粗调）</td><td>Tritech Research，Narishige</td><td>M-2</td><td></td></tr><tr><td>显微操作仪（机械精细型）</td><td>Leitz Microsystems</td><td>莱茨机械显微操作器</td><td>图7F</td></tr><tr><td>pCLAMP</td><td>分子装置</td><td></td><td>软件</td></tr><tr><td>培养皿</td><td></td><td></td><td>60 mm</td></tr><tr><td>脉冲发生器</td><td>AMPI</td><td>掌握 8</td><td>图7A</td></tr><tr><td>用于心电图的导电膏</td><td>Parker Laboratories</td><td>Redux 电解质 Cr&amp;egrave;我</td><td></td></tr><tr><td>快门驱动器</td><td>Uniblitz，Vincent Associates</td><td>VCM-D1 单通道单稳态</td><td>图7V</td></tr><tr><td>快门系统</td><td>Uniblitz，Vincent Associates</td><td>LS2 2 mm 单稳态快门</td><td>图7V</td></tr><tr><td>银丝</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td>0.25&amp;ndash;直径1 mm，需要进行氯化处理</td></tr><tr><td>由铂铱合金丝制成的电烙铁</td><td></td><td></td><td>0.25 mm 直径（图 6F）</td></tr><tr><td>体视变倍显微镜</td><td>尼康</td><td>SMZ-2B</td><td>图6D</td></tr><tr><td>体视变倍显微镜</td><td>野生型</td><td>野生型M5</td><td>具有 6、12、25 和 50 倍放大设置（图 7E）</td></tr><tr><td>注射器滤器</td><td>Millex</td><td></td><td>22 &amp;micro;m PVDF 滤膜</td></tr><tr><td>垂直式移液器拉制仪</td><td>Sutter/ Narishige</td><td>Model P-97/PP-830</td><td>根据个人偏好选择使用垂直或水平拉制仪（图6L）</td></tr><tr><td>石蜡丝加热器</td><td>自制</td><td></td><td>见图S1（图6E-G）</td></tr><tr><td>氙闪光灯系统</td><td>Dr. Rapp OptoElectronic</td><td>JML-C2</td><td>图7X</td></tr></tbody></table>

用于测量感光色素水平的电生理学方法 果蝇 光感受器

Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

果蝇 G蛋白偶联的光敏色素视紫红质（R）由一种蛋白质（视蛋白）和一个发色团组成。视紫红质的激活过程始于光子吸收所引发的发色团异构化，从而促进视蛋白发生构象变化，形成第二种暗态稳定的光敏色素状态（变视紫红质，M）。对这种双稳态光敏色素进行随机诱变研究时，需要简单且可靠的突变果蝇筛选方法。因此，已设计出多种用于检测功能性光敏色素水平降低的方法。其中一种方法利用了光敏色素在吸收光子后内部产生的电荷位移，以及光感受器中大量表达的光敏色素分子。这一电信号被称为早期受体电位（或早期受体电流），可通过多种电生理学方法（例如视网膜电图和全细胞记录）进行测量，且其信号强度与功能性光敏色素水平呈线性正比关系。该方法的优点包括高信噪比、对光敏色素水平的直接线性测量，以及不依赖于视紫红质或变视紫红质激活下游的光转导机制。另一种称为持续性去极化后电位（PDA）的电生理学方法，则利用了果蝇光敏色素的双稳态特性以及R和M色素状态之间的吸收光谱差异。PDA由强蓝光诱导，使大量视紫红质转化为变视紫红质，导致在黑暗中长时间无法终止光反应；但可通过强橙光将变视紫红质转换回视紫红质，从而终止PDA。由于PDA是一种需要大量光敏色素转换的强信号，即使光敏色素生成过程中存在微小缺陷，也会导致PDA明显异常，易于检测。事实上，PDA缺陷型突变体的研究已帮助鉴定出多个在光转导过程中起重要作用的新信号蛋白。

图 2 展示了使用 ERG 技术的稳健性和简便性。该技术具有稳健性，因为它通过一种简单的细胞外电压记录技术，在近乎完整的果蝇体内进行记录，仅需一个简单的电生理装置即可完成。即使在突变显著降低或扭曲光反应的情况下，仍能获得振幅相对较大（毫伏范围）的光反应记录，这体现了其稳健性。因此，即使是没有经验的研究人员，也可以使用这一极为简单的实验装置，并在几天内学会如何获得有意义的结果。该技术用于测量视色素水平的主要目标，已通过极大简化的 PDA（图 2C）和 ERP（图 2C-E）方法实现。相比之下，另一种可选方法——微分光光度法，则需要昂贵的光学设备以及大量的培训和操作技巧（图 3B）。ERC（图 5A-D）虽然在技...

我们提出了一种电生理学方法，用于表征双稳态光敏色素：（i）利用光敏色素分子在吸收光子后发生的电荷位移及其在感光细胞中的大量存在，以及（ii）利用视紫红质与高视紫红质这两种光敏色素状态之间的吸收光谱差异。这些方法可用于筛选影响双稳态光敏色素系统的突变。&#160;

果蝇G蛋白偶联光敏色素视紫红质（R）由一种蛋白质（视蛋白）和一种发色团组成。视紫红质的激活过程是……

该方案特别适用于视觉缺陷型果蝇突变体的遗传筛选，因为它能够检测果蝇光转导过程中即使微小的异常，尤其是在光敏色素水平及与层级相关的功能方面。该技术具有显著的体内检测能力，操作简便且高度稳健，可有效检测光转导蛋白活性的微小变化。在我看来，固定果蝇的同时保持其活性可能是该方法的关键步骤。打开计算机并启动Clampex软件。开启放大器和Master-8脉冲发生器，然后打开氙灯及快门控制器。打开拉制仪，将玻璃毛细管放入拉制仪中进行拉制。将拉制后的玻璃毛细管从拉制仪中取出。使用带细长吸头的注射器，将过滤后的任氏液注入玻璃毛细管中。将金属丝电极插入玻璃毛细管中，确保毛细管内的溶液与银丝接触。将电极支架插入两个电极显微操作器中。打开电烙铁的电源。将电流调节至约 2.25 安培。该电流应使 0.25 毫米的铂铱合金丝加热至约 55 至 56 摄氏度。在电烙铁上放置一滴低熔点的蜡。将瓶内的果蝇麻醉。把麻醉后的果蝇倒入休眠容器中，选取一只果蝇，其余果蝇用培养皿盖住。使用尖头镊子小心地夹住果蝇的翅膀，将其放置在果蝇固定装置上。将果蝇侧放于固定装置上，背部朝向手部。用镊子从翅膀处轻轻提起果蝇，并使用电烙铁将翅膀固定在果蝇固定装置上。使用电烙铁将果蝇的背部用石蜡固定在支架表面。将电烙铁的尖端降至足部连接处，熔化石蜡以同时固定所有足部。在头部与颈部之间的颈部区域放置一小滴石蜡。将果蝇固定器置于磁力块上的暗法拉第笼中，并确保果蝇距离导光管末端约五毫米。使用显微操作器将记录电极置于果蝇眼睛上方，将接地电极置于果蝇背部上方，然后使用显微操作器将接地电极插入果蝇背部。使用显微操作器将记录电极插入果蝇复眼的外周区域。关闭法拉第笼并熄灭房间灯光，使果蝇在暗处适应五分钟。设置参数，起始脉冲持续时间为500米/秒，脉冲间隔为60秒，脉冲次数设为六次。测量PDA时，将Master-8脉冲发生器设置为TRAIN模式，然后使用橙色滤光片给予一个持续5秒、最大强度的光脉冲。观察电压反应。将橙色滤光片更换为宽带蓝色滤光片，并以最大强度给予三个持续5秒的光脉冲。检查电压响应。在黑暗中至少等待60秒。将蓝色滤光片更换为之前的橙色滤光片。然后以60秒间隔给予两次持续5秒的光脉冲，检测电压反应。为测量ERP M电位，给予持续的蓝光脉冲，直至达到稳态电压反应。使用20纳米带通滤光片，给予一波长在350至700纳米之间的短暂强光闪光。然后测量M电位反应中M1相的峰值幅度，该幅度反映了在此特定波长下光平衡时的视紫红质吸收情况。针对不同突变果蝇评估了PDA反应。野生型果蝇在强蓝光刺激后，黑暗中表现出饱和性去极化，表现为持续的角膜负性ERG，随后的蓝光刺激仅产生叠加在PDA上的微弱反应，缺乏开瞬变和关瞬变。而在光敏色素生物合成异常的突变果蝇（如ninaE）中，强蓝光刺激后电压反应恢复至基线水平，后续蓝光刺激的反应未被抑制，并显示出正常的开瞬变和关瞬变。通过相同的方案获得野生型果蝇的ERP，但在PDA期间施加强烈的绿色闪光。该绿色闪光可诱发ERP并抑制PDA。在野生型果蝇中，M电位由蓝光照射后给予绿色闪光引发，而蓝光照射后给予蓝色闪光则不能引发M电位。该实验方案在野生型、视色素低表达突变体 ninaE 以及光转导缺陷但视色素水平正常的 norpA 突变体中重复进行。果蝇视紫红质和变视紫红质的相对吸收光谱是根据不同光谱的光度测量结果和光平衡光谱计算得出的。为了果蝇的存活，需注意石蜡的黏度，避免过热。该方法适用于视觉缺陷突变体的遗传学和表型筛选。通过随机分离和鉴定视觉突变的方法，有助于发现参与黑腹果蝇光转导过程的新蛋白质和新机制。PDA 实验方案已成功用于分离出若干重要且新颖的视觉机制。否则，这种参与可能根本不会被发现，甚至不会被预料到。

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科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

测量 果蝇 光感受器中光色素水平的电生理学方法

本视频概述了在固定状态的黑腹果蝇（Drosophila）眼部进行光感受器活动电生理记录的实验方案，可实现对光刺激下电压变化的精确测量。...

电压响应的电生理记录 黑腹果蝇 视网膜光感受器对光刺激的反应

该视频演示了通过建立全细胞记录模式，对Drosophila小眼（ommatidium）中的感光神经元进行电活动记录。重点展示了光脉冲激活瞬时受体电位通道，从而产生可测量的量子 bumps（quantum...

Drosophila 光感受器的全细胞电压钳记录

本视频展示了一种用于研究白眼Drosophila中持续性去极化后电位（PDA）的实验方案。通过将果蝇的眼睛暴露于强烈的蓝光脉冲下，使感光色素视紫红质转化为高视紫红质，从而启动信号级联反应，打开阳离子通道并引起膜去极化。由于蓝光会阻止高视紫红质重新转化为视紫红质，阳离子持续内流导致去极化状态长期维持，这种现象称为持续性去极化后电位（PDA）。...

研究延长性去极化后电位（PDA）在 果蝇 光感受器

来源：Wagner, K. 等，利用eGFP标记蛋白研究果蝇感光细胞中的膜蛋白转运。J. Vis. Exp.

研究膜蛋白转运在 果蝇 光感受器细胞

演示了细胞内记录的电生理技术，并用于测定蝴蝶复眼中单个感光细胞的光谱敏感性。...

从昆虫模型中测定感光细胞的光谱敏感性 在体 内 细胞内记录

尖锐的微电极能够准确表征活体果蝇（Drosophila）中感光细胞和视觉中间神经元的电生理输出。本文介绍了如何利用该方法记录单个细胞在可控光照刺激下高质量的电压反应。该方法非常适合研究昆虫复眼中神经信息的处理过程。...

记录细胞内电压反应的电生理学方法 果蝇 光感受器与中间神经元对光刺激的反应 在体 内

在此，我们展示了如何定量分析突触活性区的数量及其空间分布 果蝇...

分析长期光照后黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）感光细胞的突触调节

Drosophila melanogaster 光感受器的全细胞记录可用于测量在不同条件下产生的自发性暗脉冲、量子脉冲、对光的宏观反应以及电流-电压关系。结合 D. melanogaster 的遗传操作工具，该方法可用于研究普遍存在的肌醇脂质信号通路及其靶标——TRP...

全细胞电压钳记录的电生理学方法 果蝇 光感受器

本研究介绍了一种利用数字图像分析快速、精确量化黑腹果蝇（Drosophila...

量化腹部色素沉着 黑腹果蝇

本文介绍了利用eGFP荧光在黑腹果蝇（Drosophila）复眼中对光感受器膜蛋白进行定位以及评估视网膜变性的非侵入性方法。...

使用 eGFP 标记蛋白在 Drosophila 感光细胞中研究膜蛋白转运

学习利用电生理学方法测量果蝇光感受器中的光色素水平，通过检测光子吸收引起的电荷位移来表征双稳态光色素功能。该技术适用于视觉缺陷突变体的遗传筛选，可发现光转导机制中的细微异常。

用于测量感光色素水平的电生理学方法果蝇光感受器

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用于测量感光色素水平的电生理学方法 果蝇 光感受器

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