基于荧光的膜电位测定，用于两个上皮细胞系中两个内源性离子通道的高通量功能研究
2022年6月22日
该协议描述了通过测量膜电位变化来研究电源膜蛋白的方法。该测定为上皮细胞系中内源性表达的多个离子通道的功能读数提供了一个平台。
基于荧光的膜电位测定为研究调节剂对上皮细胞中内源性表达的离子通道的影响提供了可靠的方法。作为概念验证，我们正在测量已知上皮细胞系中两个离子通道的功能。该测定是通用的，因为它使用外源化学探针来测量离子通道功能，因此无需基因编码探针。
这些高通量测定可以识别和表征小分子调节剂对离子通道的影响，这有可能推进囊性纤维化的治疗。首先，在含有20%胎牛血清和1%青霉素链霉素的EMEM的T75烧瓶中培养Calu-3和Caco-2细胞。在细胞达到80%至100%汇合度后，从T75烧瓶中吸出培养基。
用10毫升磷酸盐缓冲盐水轻轻洗涤细胞。然后，向细胞单层中加入 2 毫升预热的 0.25% 胰蛋白酶和 0.1% EDTA。将烧瓶置于 37 摄氏度下约 5 分钟。
在此步骤中，确保细胞从烧瓶表面提起并解离成单细胞悬液。加入8毫升培养基以中和反应。当细胞达到30%至40%汇合度时，将1.5毫升细胞悬液加入锥形管中的18.5毫升培养基中并混合。
向96孔板的每个孔中加入200微升该细胞悬液，以获得每孔约140， 000个细胞。要接种一个完整的 384 孔板，将 1 毫升细胞悬液加入锥形管中的 17 毫升培养基中，以获得每孔约 50， 000 个细胞。混合后，向每个孔中加入50微升细胞悬液。
每两天更换一次培养基，并确保细胞在三到五天内同时在所有孔中达到100%汇合度。在功能研究前24小时更换培养基。首先，使用文本协议中列出的试剂制备无钠、无氯化物的缓冲溶液。
将试剂添加到组织培养级双蒸水中。让试剂在室温下搅拌过夜溶解。溶液稳定后，滴加1摩尔NMDG溶液，将pH调节至7.4。
混合30分钟，将溶液的渗透压调节到每公斤300正负5毫摩尔的范围。过滤并将缓冲溶液储存在无菌瓶中。然后，将0.5毫克膜电位染料溶解在1毫升无钠，无氯化物的缓冲液中，并将溶液加热至37摄氏度。
从Calu-3和Caco-2细胞单层中取出培养基。对于96孔板，每孔添加195微升染料溶液，对于384孔板，每孔添加95微升染料溶液。让细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下加载染料 35 分钟。
然后，以530纳米激发和560纳米发射进行荧光测量。最初，以 30 秒的间隔连续读取 5 分钟的基线读数。然后，向96孔板的每个孔中加入5微升400微摩尔佛司可林溶液，以获得1微摩尔的最终佛司可林浓度。
对于384孔板，加入5微升20微摩尔佛司可林溶液。进行 20 分钟的刺激评级，每隔 15 秒进行一次测量。接下来，向96孔板中加入5微升400微摩尔CFTR抑制剂溶液，以获得10微摩尔的终浓度。
向 384 孔板中加入 5 微升 200 微摩尔 CFTR 抑制剂。取抑制读数 15 分钟，每隔 30 秒测量一次。量化每个孔的荧光强度测量值，并将值导出为电子表格。
列格式，包含单个孔。为了计算佛司可林诱导的变化，将96孔板的每个孔的相对荧光单位测量除以基线读数的最后一次荧光强度测量，并绘制它们。测量峰值响应作为佛司可林刺激期间从基线测量的最大荧光强度.
使用此测量值或曲线下面积来量化 CFTR 响应。CFTR功能检测为Caco-2细胞中佛司可林刺激后的膜去极化.与作为载体对照的DMSO相比，检测到氟化物外排的荧光急剧增加。
佛司可林刺激后，荧光信号持续到加入CFTR抑制剂，之后荧光强度迅速下降。这种现象在Caco-2和Calu-3细胞中都是可重复的。CFTR活性计算为佛司可林或DMSO刺激后荧光最大变化的差异。
在佛司可林刺激和DMSO对照的情况下，各个点的范围在平均值的正负3个标准差之间，表明测定的可重复性。为了确认功能反应的特异性，可以使用常规电生理方法（例如Ussing室）进一步验证这些膜电位测定。该平台能够弥合高通量调节剂筛选和异源表达系统之间的差距，以及在难以接近的原代组织中进行耗时的生物电测量。
概述
本研究提出了一种基于荧光的膜电位测定法，旨在评估上皮细胞系中电生膜蛋白，特别是离子通道的功能。利用Calu-3和Caco-2细胞，该方法允许对离子通道调控进行高通量分析，突出了其在囊性纤维化中的潜在治疗应用。
关键研究组成部分
研究领域
- 电生理学
- 细胞膜电位测定法
- 离子通道调控
背景
- 离子通道的高通量筛选方法
- 小分子调节剂对CFTR功能的影响
- 上皮细胞系在生物医学研究中的应用
所用方法
- 基于荧光的膜电位测量
- 上皮细胞系：Calu-3和Caco-2
- 使用药理试剂（福斯可林和CFTR抑制剂）的测定法
主要结果
- 福斯可林刺激诱导的荧光可测量变化表明CFTR活性
- 荧光信号在两种细胞系中均表现出可重复性
- 通过使用特定的抑制剂确认了CFTR功能的抑制
结论
- 开发的测定法有效地在高通量格式中评估离子通道活性
- 该方法有助于连接调节剂筛选和初级组织中的电生理测量
常见问题
Executive Industry Relevance
High-throughput fluorescence-based membrane potential assays enable robust functional evaluation of endogenous ion channels in tissue-relevant epithelial cell lines. This platform advances predictive confidence in modulator screening by providing quantitative, reproducible readouts in physiologically relevant systems. The approach supports early-stage target validation and de-risks downstream portfolio decisions for ion channel drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of CFTR and ENaC channels in native epithelial contexts.
- Supports biological de-risking by measuring endogenous channel activity without genetic modification.
- Facilitates predictive confidence in target engagement and modulator effects.
Screening & Assay Development
- Delivers high-throughput, plate-based assay readiness for compound screening campaigns.
- Provides standardized, quantitative fluorescence outputs for reliable comparison across wells and plates.
- Enables reproducible evaluation of small molecule modulators in scalable formats.
Translational & Preclinical Research
- Aligns functional readouts with disease-relevant epithelial models for translational continuity.
- Bridges high-throughput screening with confirmatory electrophysiological validation in primary tissues.
- Supports risk-adjusted advancement of candidate modulators toward preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
This fluorescence-based assay integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification and preclinical evaluation for ion channel modulators.
- Discovery Biology: Quantifies membrane potential changes to test mechanistic hypotheses and clarify channel function.
- Screening: Provides reproducible, scalable assay outputs suitable for high-throughput compound evaluation.
- Analytics: Generates quantitative fluorescence data enabling statistical comparison of modulator effects.
- Translational Research: Maintains disease relevance by using endogenous channels in epithelial cell lines.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible platform adaptable to additional ion channel targets and cell systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in ion channel studies.
- Operational Value: Standardizes assay protocols for reproducibility and scalability across discovery teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency in early-stage screening.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of modulators for further development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence assay design and quantitative data analysis.
- Needs access to high-throughput plate readers and compatible fluorescence detection infrastructure.
- Demands cross-team standardization of cell culture and assay protocols for reproducibility.
- May require adaptation for different epithelial models or additional ion channel targets.
- Validation with orthogonal electrophysiological methods is recommended for specificity confirmation.
