一种用于评估细胞DNA损伤的高通量彗星实验方法

彗星试验被广泛用于评估基因毒性。我们的方案相较于标准彗星试验具有多项方法学优势。本技术的核心在于将标准彗星载玻片垂直放置，并在专用支架中以每批25片的规模进行处理。

这包括电泳，因此电泳槽更小，使用的缓冲液更少，并具有集成冷却功能。载玻片上的凝胶被放置在架子中，因而得到更好的保护，并可在25秒内从一种溶液转移至另一种溶液。通过使用我们的血液彗星实验方案，研究人员可以利用指尖采血来研究人类、其他物种以及多种潜在遗传毒性环境暴露所导致的DNA损伤。

所有使用显微镜载玻片作为彗星凝胶固体支撑的彗星实验不同格式均可适用于我们的方法。该技术的关键步骤是在样品与低熔点琼脂糖混合后迅速上样。上样时应快速操作，避免产生气泡，并立即覆盖盖玻片，以防凝固前样品干燥或变形。

首先，配制0.6%的低熔点琼脂糖PBS溶液，并将其置于37摄氏度水浴中。使用永久性记号笔或铅笔在预先包被的载玻片的磨砂端标记姓名、日期和处理信息。将冷却板放置在平坦的实验台上，并将两个冷冻过的冷却包插入金属表面下方的滑动抽屉中。

然后，将载玻片置于预冷板上，预冷1到2分钟。离心后弃去样品管中的上清液，并立即将样品管放回冰上。用200微升0.6%低熔点琼脂糖重悬细胞沉淀，并通过移液混匀。

接下来，将80 µL含有细胞的琼脂糖加到预冷的载玻片上，并迅速在凝胶上放置盖玻片。将凝胶置于冷却板上静置1至2分钟使其凝固。在此期间，准备500 mL裂解缓冲液工作液，并将其倒入裂解槽中。

凝胶凝固后，用拇指和食指轻轻夹住载玻片，迅速而轻柔地将盖玻片从凝胶上滑下。然后将载玻片放入玻片架中，确保所有载玻片上的黑色圆点标记朝向同一方向。将玻片架放入裂解皿中。

关闭裂解皿的盖子并进行孵育。小心地将载玻片架从裂解皿中取出，注意不要扰动凝胶。轻轻将载玻片架放入预先装有冰冻双蒸水的洗涤皿中。

确保载玻片完全浸没，并静置30分钟。将冷冻的冷却包置于电泳槽下方，以维持缓冲液的最佳温度。随后，向电泳槽中加入冰冻的电泳工作液，并将载玻片架转移至其中。

将载玻片放置成含细胞的凝胶朝向阴极。将载玻片放入电泳槽中孵育20分钟，使DNA解旋。然后接通电源，在每厘米1.19伏特的电压下进行电泳20分钟。

电泳完成后，关闭电源，将载玻片架从电泳槽中取出。将载玻片架置于滤纸上沥干30秒。随后，将载玻片架放入盛有中和缓冲液的培养皿中，静置20分钟。

随后，将其放入盛有冰冻双蒸水的染色缸中，静置20分钟。洗涤后，将载玻片架从水中取出，并将载玻片置于37°C的培养箱中干燥1小时。为使载玻片重新水化，将载玻片架转移至盛有冰冻双蒸水的染色缸中，静置30分钟。

然后，将载玻片架放入含有2.5 µg/mL碘化丙啶溶液的染色缸中。盖上染色缸盖子，在室温避光条件下孵育20分钟。孵育结束后，将载玻片架转移至另一个染色缸中，用冰冻的双蒸水洗涤20分钟。

从培养皿中取出载玻片架，并在避光条件下完全干燥，可置于37°C培养箱中或室温下干燥。载玻片完全干燥后，将其存放在避光的载玻片盒中，直至进行图像分析。人角质形成细胞经不同剂量的UVA和UVB照射，或用50 µmol/L过氧化氢处理，以诱导DNA损伤。

最佳电压为1.19伏特/厘米，因其可诱导出最敏感的反应和最高比例的尾部DNA。人全血经不同剂量的UVA照射后，用不同浓度的Fpg酶处理。高通量碱性彗星实验结果显示，每毫升4个单位的Fpg可诱导出最佳水平的DNA损伤。

卵巢癌细胞系SK-OV-3用顺铂和过氧化氢联合处理。未暴露的细胞未显示损伤。与诱导DNA链内交联的细胞相比，单独暴露于过氧化氢产生了显著的平均橄榄尾矩。

经100微摩尔顺铂处理后，DNA链内交联随时间增加，并在12小时达到峰值，随后在30小时后降至零。电泳前必须将冰袋放入电泳槽中，并将载玻片孵育20分钟以解旋DNA。此步骤有助于受损DNA在电流作用下迁移。将载玻片垂直放置进行检测，使我们能够实现彗星实验的自动化。

此外，我们的技术简化了用于研究的彗星实验。