评估能量底物氧化 体外 与 ¹⁴CO₂ 捕获

不同能量底物的利用具有细胞类型特异性，并且与疾病相关。测定特定底物的消耗情况有助于揭示正常的生物学过程以及病理机制。该技术无需专用设备，且易于放大操作。

与之前发表的方法相比，该方法使用起来也更为简便。了解底物氧化速率的变化将有助于开发针对代谢性疾病的饮食和药物干预措施。尽管本研究以骨组织为例进行演示，但该技术可轻松定制用于研究所有细胞类型的代谢灵活性，从而帮助理解代谢转变的原因及其后果。

处死出生后3至5天的幼鼠，将其转移至含有青霉素-链霉素双抗溶液的冰冻D-PBS中。去除皮肤和软组织，暴露颅骨。在D-PBS中从后向前剪除周围组织，收集中间区域。

使用镊子轻轻刮擦颅盖骨的内表面和外表面，以帮助在后续消化过程中释放细胞。在 D-PBS 中配制浓度为 2 毫克/毫升和 4 毫克/毫升的 II 型胶原酶溶液，并使用新的 0.22 微米滤器过滤每种溶液。首先，用 2 毫克/毫升的胶原酶溶液消化清洗后的颅盖骨 15 分钟，然后弃去消化液。

接下来，将纯化的样品在 4 毫克/毫升的胶原酶溶液中消化三次，每次 15 分钟。然后，收集消化液并保存。将消化液通过 70 微米细胞筛过滤，并将滤液在 300 × g 下离心 5 分钟。

用含有10% FBS和青霉素-链霉素双抗溶液的完全MEM α培养基重悬细胞沉淀。计数后将细胞接种至10厘米培养皿中。在37°C、含5% CO₂的培养箱中培养三天。

随后，用 0.25 胰蛋白酶 EDTA 在 37 摄氏度下消化细胞。消化完成后，计数并将细胞接种于 24 孔细胞培养板中，每孔加入含 10% FBS 和青霉素-链霉素双抗溶液的完全 MEM α 培养基。每种细胞类型在每种基质上至少接种四个孔，每种细胞类型还需额外接种至少三个孔用于检测前的细胞计数。

将细胞在37摄氏度下培养过夜。从小鼠（8周龄）中去除肌肉和结缔组织并收集股骨和胫骨后，用锋利的剪刀剪去并丢弃骨骼的两端。用装有23号针头的注射器吸取15毫升含10%胎牛血清、青霉素-链霉素双抗溶液和10%CGM 14 12条件培养基的完全MEM α培养基，冲洗一侧股骨和一侧胫骨中的骨髓至新的10厘米培养皿中。

将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中置于培养皿中进行培养。三天后弃去培养基，并用D-PBS冲洗细胞。在37摄氏度下用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化贴壁细胞，作用5分钟。

离心后，将细胞沉淀重悬于BMM培养基中。按照先前所述步骤，计数并接种细胞至24孔细胞培养板中。在开始检测前，于37°C条件下在BMM培养基中培养过夜。

用 D-PBS 将额外孔中的细胞洗涤两次。用 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 解离细胞。将 20 微升消化后的细胞重悬于 D-PBS 中。

使用 20 微升吖啶橙和碘化丙啶染色液，通过自动细胞计数仪测定活细胞数量，并记录结果。用 D-PBS 将检测孔板中的细胞洗涤两次。在 RAM 指定的组织培养罩内，向每个检测孔中加入 500 微升预热的培养基。

用封口膜密封培养板后，将细胞置于指定的RAM培养箱中，在37摄氏度下孵育4小时。孵育期间，将滤纸剪成圆形小片，其尺寸略大于1.5毫升微量离心管管盖内部区域，并将滤纸紧密地插入管盖内。向每根离心管中加入200微升1摩尔的高氯酸，并向管盖内装入的滤纸上加入20微升氢氧化钠。

孵育细胞后，将每孔中的 400 微升培养基转移至已准备好的离心管中，并立即盖紧管盖。将离心管置于室温下的试管架中静置一小时。在孵育的同时，为每根离心管准备一个闪烁瓶，并向其中加入 4 毫升闪烁液。

将每张滤纸转移至闪烁瓶中，在室温下孵育30分钟。对组织培养罩、水浴锅、冰箱、培养箱、水槽、地面以及任何其他工作区域进行擦拭检测，以检查是否存在潜在的放射性物质污染。将擦拭纸放入含有闪烁液的闪烁瓶中。

使用闪烁计数器测量闪烁瓶中碳14的放射活性，并记录读数结果。如有必要，根据辐射安全指南对工作环境进行去污处理。该图比较了颅骨原代前成骨细胞与骨髓来源巨噬细胞（BMMs）对底物的氧化作用。

原代细胞经传代并在完全MEM α培养基中培养过夜后，通常可达到80%至90%的融合度，并呈现其特征性形态。颅骨前成骨细胞明显大于BMMs。底物氧化实验结果表明，每种底物的氧化速率在颅骨前成骨细胞中均显著高于BMMs，这可能提示前成骨细胞通过氧化磷酸化产生更高的能量。

插入的第三张滤纸应略大于1.7毫升离心管管盖。该方法可与氧气消耗测定联合使用，以确定细胞中氧化磷酸化和乳酸生成的总体速率。本方案可用于确定在不同分化阶段或疾病状态下细胞对底物的利用情况。

基于这些知识，我们可以开发针对代谢紊乱的干预措施。