菌根图谱作为探索红羊茅（Festuca rubra）和玉米（Zea mays）根部定殖模式与真菌策略的工具

MycoPatt 方法可深入探索根部的丛枝菌根定殖情况。菌根图谱能够指示真菌的扩展情况，并以特定模式呈现每种结构的实际位置。菌根定殖可在1%的分辨率下进行客观分析。

每条根段都会被自动转换为数字矩阵，并生成包含大量定殖参数的数据库。首先，将根系从冰箱中取出，放置在工作台上于室温下解冻。进行根系透明处理时，将一株植物的全部根系放入一个30至50毫升的容器中，然后用自来水配制10%的氢氧化钠溶液，并倒入容器中，直至完全浸没根系。

剧烈振荡容器一到两分钟，使透明溶液在根系中均匀分散。将根系置于透明溶液中静置48小时。根系清洗时，将容器中的内容物通过筛网过滤。

用自来水将根部冲洗数次，直至完全去除透明溶液。接着将冲洗后的根部放入干净的容器中用于染色。然后用自来水配制5%至5%的墨水醋溶液。

将其倒入容器中，直至浸没根部，然后摇晃一到两分钟。部分脱色需48小时后，用自来水冲洗染色的根部一到两分钟。剧烈摇动容器，以去除多余的染色液。

重复该步骤，直至根部清晰，可用于显微镜观察。进行根部分段时，将染色后的根置于带刻度的切板上，将根切割成一厘米长的片段。

为每种变异体选择15个区段。接着，将根系在载玻片上铺开以制备区段，使用覆膜袋覆盖根系，并从边缘开始轻轻压碎。使用软质塑料工具将根系在载玻片上展平。

小心取下覆膜袋，并用盖玻片覆盖样本。用移液器将水滴加到载玻片的一角，让水缓慢扩散至整个载玻片。用纸巾吸去多余的水分。

进行显微分析时，使用配备高分辨率相机的显微镜。从切片的一端开始分析，逐个拍摄每个显微视野。

对于粗根使用10倍或40倍放大倍数，对于细根使用40倍放大倍数。拍摄后，使用能够允许根部各段真实重组的编码对每张图像重命名。使用演示软件设计图像拼接的绘图板，并将宽度设置为比图像宽度宽两到三厘米。

拍摄15张图片后，按拍摄顺序（从第1张到第15张）将同一区段的所有图像依次叠加，重建根区段的完整长度。接着，使用垂直对齐功能将图像居中对齐，确保每张图像与前一张图像连续衔接。在所有图片上放置一个10×150的网格，覆盖整个根区段。

此外，在每张图片上放置一个 10×10 的网格，在该网格的每个单元格中，如果可见丛枝菌根（arbuscular mycorrhizal，AM）结构，则填入 1 至 6 的数字；若无 AM 结构存在，则留空。添加一个表格，其网格宽度为 10 个单元格，长度为 150 个单元格。根据图片的宽度调整表格的宽度，然后调整表格的长度以包含所有图片。

在对菌根定殖进行评分时，使用特定编号对菌根形态学方法中描述的每种结构类型进行评分：菌丝记为1，丛枝记为2，泡囊记为3，孢子记为4，辅助细胞记为5，侵入点记为6。对先前应用的网格中每个细胞内观察到的每种菌根结构进行评分。

评分完成后，将所有获得的分数输入 MycoPatt 电子表格中。使用复制粘贴功能，将演示文稿中的所有分数转移至名为“Raw Data”的第一个工作表中。在进行主要分析时，使用名为“Parameters”的第三个工作表，以三种不同形式分别将结果以百分比形式可视化。

使用 A 到 K 列分析每个 15 个 10×10 方格的水平定植图像，M 到 W 列分析垂直定植图像，Y 到 AI 列分析横向定植图像以及最终的平均定植率。随后，应用各参数对应的定义和公式。为生成和提取菌根图谱，请在名为“Graphs”的第二个工作表中查看将菌根结构代码转换为颜色后所得的图像。

然后将图表工作表中的结果图像导出为图片，并利用图例中的颜色编码分析菌根分布模式。在菌根图谱分析中，需识别出最重要的结构及其组合方式。接着描述在所分析根系中观察到的菌根定殖模式，随后根据根中观察到的结构发育情况、分枝模式以及丛枝泡囊的发育特征，阐述其菌根定殖策略。

本方案提供了玉米（Zea mays）和红羊茅（Festuca rubra）中菌根结构的详细信息，菌根结构与根细胞之间具有良好的对比度。以往不成功的透明和染色步骤导致红羊茅（Festuca rubra）和玉米（Zea mays）中菌根结构的显微图像不清晰。通过观察菌根定殖模式，可全面探究其定殖机制；本方法实现了对玉米（Zea mays）和红羊茅（Festuca rubra）定殖模式与策略的深入、微观尺度的分析，并额外提供了定殖参数的可视化表达。

在玉米（Zea mays）中，观察到定殖潜力高度依赖于植物的发育阶段而发生显著波动；然而，在红羊茅（Festuca rubra）中，定殖过程发生在根内，菌丝网络的发育与根系较低的生长速度相关。MycoPatt 适用于绘制任何植物中丛枝菌根的定殖图谱，也有助于全面探究定殖机制，并评估真菌沿根系分布的定殖策略。