Name: 肝组织3D细胞培养模型中组蛋白翻译后修饰的全球水平定量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: 学习使用液相色谱质谱联用技术对C3A肝细胞三维球状体培养物中的组蛋白翻译后修饰进行全球水平定量分析。该方法可同时检测数百种修饰，为研究癌症和衰老等疾病中的染色质动态变化提供可靠的生理学相关模型。

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Sidoli 实验室衷心感谢白血病研究基金会（Hollis Brownstein 新研究者研究资助）、AFAR（Sagol 网络老年组学奖）、Deerfield（Xseed 奖）、Relay Therapeutics、默克公司以及美国国立卫生研究院院长办公室（1S10OD030286-01）的支持。

1. 缓冲液与试剂的配制
<ol>
	<li>细胞培养基（用于HepG2/C3A细胞）：在含4.5 g/L葡萄糖的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中加入胎牛血清（FBS）（10% v/v）、非必需氨基酸（1% v/v）、L-谷氨酰胺补充剂（1% v/v）和青霉素/链霉素（0.5% v/v）。培养基在4 °C下保存，最多保存2周。</li>
	<li>200 mM丁酸钠（NaBut）溶液：配制10 mL时，将220.18 mg NaBut溶于10 mL ddH2O中。分装成1 mL每份，于-20 °C保存。细胞处理前，使用0.45 mm注射器滤器过滤溶液，并将1 mL过滤后的溶液加入9 mL细胞培养基中，得到20 mM的工作浓度。</li>
	<li>100 mM琥珀酸钠（NaSuc）溶液：配制10 mL时，将162.05 mg NaSuc溶于10 mL ddH2O中。分装成1 mL每份，于-20 °C保存。细胞处理前，使用0.45 mm注射器滤器过滤溶液，并将1 mL过滤后的溶液加入9 mL细胞培养基中，得到10 mM的工作浓度。</li>
	<li>冷的0.2 M H2SO4：配制1 L时，将10 mL浓H2SO4加入990 mL HPLC级水中。4 °C保存。</li>
	<li>冷丙酮 + 0.1%盐酸（HCl）：将浓HCl（0.1% v/v）加入丙酮中。4 °C保存。</li>
	<li>100 mM NH4HCO3溶液，pH 8.0：配制1 L时，将7.91 g NH4HCO3溶于1 L HPLC级水中。分装成50 mL每份，于-20 °C保存。</li>
	<li>0.1%三氟乙酸（TFA）溶液：将浓TFA（0.1% v/v）加入HPLC级水中。4 °C保存。</li>
	<li>60%乙腈/0.1% TFA溶液：将HPLC级乙腈（60% v/v）加入HPLC级水中，然后向该溶液中加入浓TFA（0.1% v/v）。4 °C保存。</li>
	<li>2% HPLC级乙腈 + 0.1%甲酸：将HPLC级乙腈（2% v/v）加入HPLC级水中，然后向该溶液中加入浓甲酸（0.1% v/v）。</li>
	<li>80% HPLC级乙腈 + 0.1%甲酸：将HPLC级乙腈（80% v/v）加入HPLC级水中，然后向该溶液中加入浓甲酸（0.1% v/v）。</li>
</ol>
3D 培养系统的制备
注意：不同的细胞（无论是原代细胞还是永生化细胞）具有不同的培养特性，因此不同类型的细胞在形成球状体方面可能存在差异。本实验方案是针对使用生物反应器和一种创新的三维细胞培养系统进行 HepG2/C3A 细胞球状体的形成而建立的。
<ol>
	<li>使用标准培养基，将细胞以单层形式培养至80%融合度。</li>
	<li>用HBSS洗涤细胞（75 cm2培养瓶使用5 mL），然后加入5 mL用HBSS稀释的0.05%胰蛋白酶-EDTA（1:2稀释），在37 oC、5% CO2条件下孵育5分钟。</li>
	<li>在显微镜下观察细胞脱落情况，并通过加入3 mL胎牛血清（FBS）或含5%-10% FBS的培养基中和胰蛋白酶活性。</li>
	<li>计数细胞数量，并将细胞悬液稀释至最终体积不超过1.5 mL，细胞浓度为1 × 106个细胞。</li>
	<li>用0.5 mL培养基洗涤超低吸附24孔圆底板（每孔含多个微孔），以平衡该培养板。将培养板在3,000 × g条件下离心5分钟，以去除孔表面的气泡。</li>
	<li>将细胞悬液转移至培养板中，在120 × g条件下离心3分钟。</li>
	<li>将培养板置于37 oC、5% CO2条件下孵育24小时，以形成球状体。同时，通过向湿度室加入25 mL无菌水、向细胞室加入9 mL培养基，对生物反应器进行平衡。</li>
	<li>将生物反应器置于回转式培养箱（clinostat incubator）中旋转，在37 oC、5% CO2条件下孵育24小时。</li>
</ol>
3. 生物反应器中球状体的培养
注意：为了保持类球体的结构，操作3D结构时应使用宽孔枪头。
<ol>
	<li>使用1 mL宽口吸头轻轻吹打，将类球体从超低吸附培养板上解离，并转移至经组织培养处理的培养皿中。</li>
	<li>用0.5 mL预温的生长培养基洗涤培养板，并将洗液转移至同一培养皿中。</li>
	<li>通过显微镜评估类球体的质量，并挑选形态良好的类球体。高质量的类球体应具有均匀的大小、致密性和圆形度。</li>
	<li>将类球体转移至已平衡的生物反应器中，反应器内预先加入5 mL新鲜生长培养基。转移类球体后，用新鲜生长培养基完全充满生物反应器。</li>
	<li>将生物反应器放入旋转式培养箱（clinostat incubator），调节转速至10–11 rpm。</li>
	<li>每2–3天更换一次培养基，移除10 mL旧培养基，并加入10 mL新鲜培养基。</li>
	<li>根据类球体的生长情况调整转速，随着类球体尺寸和数量的增加而逐步提高转速。</li>
	<li>培养18天后，类球体即可用于处理和/或收集。</li>
</ol>
4. 类球体处理与收集
注意：在本实验方案中，采用丁酸钠（NaBut）和琥珀酸钠（NaSuc）处理 HepG2/C3A 细胞球，以分别评估组蛋白乙酰化和琥珀酰化修饰水平。
<ol>
	<li>配制含有适当工作浓度化合物的培养基（例如，20 mM 的 NaBut 或 10 mM 的 NaSuc）。将生物反应器中的培养基更换为处理后的培养基。 
	注意：为建立对照条件，可在添加处理剂之前收集足够数量的类球体用于实验，或指定一个生物反应器用于培养未处理的类球体。</li>
	<li>在经过足够的处理时间后（例如，NaSuc 处理为 48 小时至 1 周，NaBut 处理为 48–72 小时），收集类球体用于蛋白质组学分析。 
	注意：采用本方案进行组蛋白提取时，需收集包含约 1 × 106 个细胞的六个至八个类球体。
	<ol>
		<li>通过顶部端口从生物反应器中移除 3–5 mL 培养基。</li>
		<li>打开前端端口，使用 1 mL 宽口吸头取出类球体，并将其放入微量离心管中。</li>
		<li>在 100 × g 条件下离心类球体 5 分钟，并弃去上清液。 
		注意：生物反应器中的培养基可更换后将反应器重新放回培养箱，以进行进一步处理或恢复培养。</li>
		<li>用 200 µL HBSS 清洗类球体以去除 FBS。在 100 × g 条件下离心 5 分钟，移除上清液。 
		&#8203;注意：类球体可在 -80 oC 下保存直至后续处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 组蛋白提取
注意：组蛋白中含有大量碱性氨基酸残基，可与其具有磷酸骨架的 DNA 紧密相互作用。由于组蛋白是细胞核中最碱性的蛋白质之一，因此使用冰冻硫酸（0.2 M H2SO4）提取时，杂质污染极少。非组蛋白会在强酸中沉淀。随后使用高浓度三氯乙酸（TCA），稀释至终浓度为 33%，以从硫酸溶液中沉淀组蛋白。在整个组蛋白提取过程中，所有样品、试管和试剂均需保持在冰上。
<ol>
	<li>向细胞沉淀（约 10–20 µL）中加入五倍体积（约 100 µL）的预冷 0.2 M H2SO4，上下吹打以充分打散沉淀并释放组蛋白。</li>
	<li>在 4 oC 条件下，将离心管置于恒定旋转或振荡环境中孵育最多 4 小时。 
	注意：对于重悬后体积大于 500 µL 的样品，孵育 2 小时即可充分提取组蛋白（更长时间孵育可能导致其他碱性核蛋白被共同提取）；对于重悬后体积小于 200 µL 的样品，需孵育 4 小时以获得更佳得率。</li>
	<li>在 4 °C 下以 3,400 x g 离心 5 分钟。将上清液转移至新离心管中，后续弃去沉淀。</li>
	<li>加入预冷的浓三氯乙酸（TCA），使其终浓度为 25%–33%（v/v）（例如，120 µL 上清液中加入 40–60 µL 预冷 TCA），通过反复倒置离心管数次混匀。</li>
	<li>在 4 oC 条件下，将离心管置于恒定旋转或振荡环境中孵育至少 1 小时。 
	注意：对于起始沉淀量较小的样品，建议过夜孵育。</li>
	<li>在 4 oC 下以 3,400 x g 离心 5 分钟。用移液器小心吸除上清液；吸取时避免接触管壁或沉淀。 
	&#8203;注意：组蛋白会沉积在离心管的管壁及底部。位于管底最下方形成的白色不溶性沉淀主要含有非组蛋白及其他生物分子。</li>
	<li>使用玻璃巴斯德吸管，以预冷的含 0.1% HCl 的丙酮（约 500 µL/管）清洗离心管（管壁及沉淀）。</li>
	<li>在 4 oC 下以 3,400 x g 离心 5 分钟。通过翻转离心管弃去上清液。</li>
	<li>使用玻璃巴斯德吸管，以 100% 预冷丙酮（约 500 µL/管）清洗离心管（管壁及沉淀）。在 4 oC 下以 3,400 x g 离心 5 分钟。</li>
	<li>通过翻转离心管弃去上清液，并用移液器吸出残留丙酮。打开管盖，在实验台面上风干样品约 20 分钟。</li>
	<li>随后进行丙酰化处理，或于 -80 oC 保存样品以备后续使用。</li>
</ol>
第一轮衍生化反应
注意：使用胰蛋白酶消化组蛋白会导致产生过短的肽段，这些肽段在传统的蛋白质组学检测体系中难以被鉴定。因此，使用丙酸酐对未修饰和单甲基化赖氨酸残基的ε-氨基进行化学衍生化。这使得胰蛋白酶的蛋白水解作用仅限于C端的精氨酸残基。对于96孔板中的样品，建议使用多通道移液器和试剂储液槽进行试剂吸取（图2A）。衍生化步骤也在消化后进行，以标记肽段的游离N端，增加肽段的疏水性，从而增强其在反相色谱中的保留能力。
<ol>
	<li>将样品重悬于 20 µL 含 15%-20% 乙腈的 100 mM 碳酸氢铵溶液（pH 8.0）中。涡旋振荡 15 秒，然后在 1,000 × g 离心 30 秒。</li>
	<li>若样品数量为八个或以上，将每份重悬的样品转移至 96 孔板中。 
	注意：若样品未转移至 96 孔板，则可在步骤 6.3–6.7、7.1–7.5 和 8.1–8.5 中使用单通道移液器。</li>
	<li>在通风橱中，使用多通道移液器加入 2 µL 丙酸酐。上下吹打 5 次以混匀。</li>
	<li>迅速使用多通道移液器加入 10 µL 氢氧化铵。上下吹打 5 次以混匀。 
	注意：丙酸是丙酸酐与肽段中游离氨基反应的副产物，可能导致样品 pH 下降。可通过向样品中以 1:5（v/v）的比例加入氢氧化铵，将 pH 重新调至 8。</li>
	<li>使用 pH 试纸确认 pH 为 8。若 pH &#60; 8，加入 1 µL 氢氧化铵进行调节；若 pH &#62; 8，加入 1 μL 甲酸或乙酸进行调节。当 pH &#62; 10 时，可能发生 pKa 较高的其他氨基酸残基的标记反应。</li>
	<li>室温孵育 10 分钟。</li>
	<li>重复步骤 6.3–6.6。进行两轮组蛋白丙酰化可确保接近完全的反应效率。</li>
	<li>将 96 孔板置于真空离心浓缩仪中干燥，直至所有孔完全干燥（约 9 小时）。</li>
	<li>继续进行胰蛋白酶消化，或于 -80 oC 保存样品以备后续使用。</li>
</ol>
7. 组蛋白消化
注意：组蛋白通过胰蛋白酶消化成肽段，胰蛋白酶在精氨酸和赖氨酸残基的羧基端进行切割。然而，由于丙酰化修饰了赖氨酸残基，因此只有精氨酸残基被切割（图2B）。
<ol>
	<li>制备胰蛋白酶溶液（25 ng/µL，溶于50 mM NH4HCO3，&#160;pH 8.0）。向每个样品中加入20 µL胰蛋白酶溶液（500 ng）。
	<ol>
		<li>配制50 mM NH4HCO3 溶液时，将100 mM NH4HCO3 溶液与HPLC级水按1:1（v/v）比例稀释。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用pH试纸确认pH值为8。若pH &#60; 8，加入1 µL氢氧化铵调节；若pH &#62; 8，加入1 µL甲酸或乙酸调节。</li>
	<li>室温下消化过夜，或在37 oC孵育6–8小时。</li>
	<li>若条件允许，在消化约3小时后检测pH值，因其可能已下降。若pH &#60; 8，加入1 µL氢氧化铵调节。</li>
	<li>额外加入5 µL浓度为50 ng/µL的胰蛋白酶溶液（250 ng），继续消化反应。</li>
	<li>进入第二轮丙酰化步骤，或将样品于-80 oC保存至后续使用。</li>
</ol>
8. 肽段N端的衍生化
注意：组蛋白肽段N端的丙酰化可提高最短肽段在反相液相色谱中的保留能力（例如组蛋白H3的第3-8位氨基酸），因为丙酰基团增加了肽段的疏水性。
<ol>
	<li>在通风橱内，使用多通道移液器加入 2 µL 丙酸酐。上下吹打 5 次以混匀。</li>
	<li>使用多通道移液器迅速加入 10 µL 氢氧化铵。上下吹打 5 次以混匀。 
	注意：丙酸是丙酸酐与肽段中游离胺基反应的产物，可能导致样品 pH 下降。可通过向样品中以 1:5（v/v）的比例加入氢氧化铵，使 pH 恢复至 8。</li>
	<li>使用 pH 试纸确认 pH 为 8。若 pH &#60; 8，可加入 1 µL 氢氧化铵进行调节；若 pH &#62; 8，可加入 1 μL 甲酸或乙酸进行调节。当 pH &#62; 10 时，可能发生 pKa 较高的其他氨基酸残基的标记反应。</li>
	<li>室温孵育 10 分钟。</li>
	<li>重复步骤 8.1–8.4。进行两轮组蛋白丙酰化可确保接近完全的反应效率。</li>
	<li>在真空浓缩仪中干燥微孔板，直至所有孔完全干燥（约 9 小时）。</li>
	<li>进入脱盐步骤，或在 -80 oC 下保存样品以备后续使用。</li>
</ol>
9. 脱盐与样品纯化
注意：样品中存在的盐类会干扰质谱分析。在电喷雾过程中，盐类也会被离子化，并可能抑制肽段的信号。盐类可在肽段上形成离子加合物，导致带加合物的肽段具有不同的质荷比&#160;。这会降低肽段的信号强度，并阻碍其正确鉴定与定量。脱盐步骤的实验装置如图2C所示。
<ol>
	<li>在磁力搅拌器上开始混合HLB树脂（50 mg/mL，溶于100%乙腈中）。</li>
	<li>确保在96孔聚丙烯滤板下方放置一个96孔收集板，用于收集穿流液。</li>
	<li>向滤板每孔中加入70 µL HLB悬浮液。轻轻开启真空泵，防止溅出。弃去穿流液。</li>
	<li>用100 µL 0.1% TFA洗涤树脂。轻轻开启真空泵，防止溅出。弃去穿流液。</li>
	<li>将每个样品重悬于100 µL 0.1% TFA中。检测pH值，应约为2–3。</li>
	<li>将每个样品加入对应孔中。轻轻开启真空泵，防止溅出。弃去穿流液。</li>
	<li>用100 µL 0.1% TFA洗涤。轻轻开启真空泵，防止溅出。弃去穿流液。</li>
	<li>将收集板更换为新的96孔收集板。</li>
	<li>每孔加入60 µL 60%乙腈/0.1% TFA。轻轻开启真空泵，防止溅出。收集穿流液，并在真空浓缩仪中干燥。</li>
	<li>继续进行LC-MS/MS分析，或在-80 oC保存样品直至使用。</li>
</ol>
10. 组蛋白肽段分析  通过 液相色谱-质谱联用
<ol>
	<li>准备高效液相色谱（HPLC）所用的流动相。流动相 A（MPA）：2% HPLC 级乙腈 + 0.1% 甲酸。流动相 B（MPB）：80% HPLC 级乙腈 + 0.1% 甲酸。</li>
	<li>按以下条件设置 HPLC 方法：（1）在 30 分钟内，MPB 从 4% 升至 34%；（2）在 5 分钟内，MPB 从 34% 升至 90%；（3）等度洗脱，90% MPB 持续 5 分钟。推荐使用以下色谱柱参数：C18 填料，粒径 3 µm，内径 75 µm，柱长 20–25 cm。对于内径为 75 µm 的纳米柱，设置流速为 250–300 nL/min。
	<ol>
		<li>若 HPLC 未设置在上样前自动平衡色谱柱的程序，则需增加以下步骤：（4）在 1 分钟内，MPB 从 90% 降至 4%；（5）等度洗脱，4% MPB 持续 10 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置质谱采集方法。
	<ol>
		<li>确保仪器在每个扫描周期开始时进行一次完整的全扫描质谱（full MS scan）。建议使用高分辨率仪器（例如轨道阱或飞行时间分析器），以便在信号提取过程中利用其高质量精度。然而，低分辨率仪器也可使用，如先前文献所述27,28。</li>
		<li>确保每次全扫描质谱后进行 16 次 MS/MS 扫描，每次隔离宽度为 50 m/z，覆盖 m/z 范围 300–1100。例如，第一次扫描应隔离 m/z 300–350 的信号，第二次为 m/z 350–400，依此类推。如条件允许，MS/MS 扫描也应采用高分辨率采集，但相较于全扫描质谱，较低分辨率亦可满足要求（因碎片离子质量较小，相对于完整离子）。</li>
		<li>HPLC 方法将产生峰宽约为 3–40 秒的色谱信号；为确保准确的信号定量，质谱仪每个色谱峰至少应完成 10 个扫描周期（即扫描周期不超过 3 秒）。</li>
		<li>若使用捕获型质谱分析器（如轨道阱、离子阱），需将离子注入时间上限设置为 &#60;200 ms；对于其他分析器（如四极杆、飞行时间），由于其扫描速度较快，此参数通常无需特别关注。可能需要进行初步测试。 
		注：有关组蛋白肽段分析的质谱方法更多细节，可参考以下文献27,28,29。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将样品重悬于 10 µL MPA 中，相当于消化后的组蛋白样品浓度约为 1 µg/µL。若同一批次中所有样品均采用相似的稀释倍数和上样体积，则精确上样量并非关键因素（且实际评估也较困难）。</li>
	<li>将 1 µL 样品加载至 HPLC 色谱柱中。</li>
	<li>运行步骤 10.1–10.3 中设定的 LC-MS/MS 方法。</li>
</ol>
11. 数据分析
<ol>
	<li>将质谱原始数据文件导入专用于峰面积积分的软件中。 
	注意：EpiProfile30,31 在本研究中采用该软件，且通常推荐使用，因其针对已知组蛋白肽段的可靠峰面积提取进行了优化。然而，也可使用其他可免费获取的提取离子色谱分析软件，例如 Skyline32,33 是合适的。</li>
	<li>将特定（未）修饰肽段的相对丰度计算为单个肽段面积与其所有修饰形式总面积的比值。可使用 EpiProfile 等软件30,31 已包含用于信号提取的肽段文库。否则，可手动或自动生成目标肽段文库 通过 使用常规蛋白质组学流程进行肽段鉴定。</li>
</ol>

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<li>Sidoli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+resolution+data-independent+acquisition+in+an+LTQ-orbitrap+allows+for+simplified+and+fully+untargeted+analysis+of+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Low resolution data-independent acquisition in an LTQ-orbitrap allows for simplified and fully untargeted analysis of histone modifications.</a> Analytical Chemistry. 87 (22), 11448-11454 (2015).</li>
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</ol>

作者无竞争性财务利益。

组蛋白翻译后修饰（PTMs）的分析与典型的蛋白质组学分析流程有根本性差异。大多数组蛋白PTMs的生物学功能仍不明确，因此诸如基因本体（Gene Ontology）或通路数据库等注释资源尚不可用。目前已有一些资源可将组蛋白修饰与负责其催化的酶，或含有能够结合这些PTMs结构域的蛋白质相关联（例如HISTome36）。此外，当组蛋白PTMs的全局水平发生变化时，可以推测染色质的整体状态。例如，组蛋白乙酰化或其他酰化修饰（如琥珀酰化）水平的整体升高通常与染色质去凝聚状态相关37,38。
质谱分析可提供有关这些修饰的更详细信息，例如其在氨基酸序列上的精确定位。在本方案中，采用串联质谱（MS/MS）采集技术来鉴定和定量组蛋白翻译后修饰（PTMs），这对于生物学意义的解读至关重要。例如，组蛋白H3第4位赖氨酸的三甲基化（H3K4me3）富集于活跃转录基因的启动子区域39，而相同类型的...

自20世纪90年代末以来th 一个多世纪以来，细胞培养系统一直被用作研究人体外细胞生长与发育的模型1,2它们的使用还被拓展到研究组织和器官在健康与疾病状态下的功能。1,3悬浮细胞（如血细胞）在培养皿或培养瓶中可无缝且可互换地生长，因为它们不会形成三维（3D）结构。 体内源自实体器官的细胞可在二维（2D）或三维（3D）培养系统中生长。在2D培养中，细胞以单层形式贴附于平坦表面生长。2,4二维细胞培养系统具有指数生长和快速倍增的特点，通常倍增时间为24小时至数天5在三维系统中，细胞生长形成复杂的细胞间相互作用，更紧密地模拟了类似组织的聚集体，并以其能够达到动态平衡为特征，其倍增时间可长达1个月或更久5.
本文介绍了一种在旋转细胞培养系统中生长三维球状体的创新方法，该系统可模拟微重力环境6这是美国国家航空航天局（NASA）在20世纪90年代推出的一种细胞培养系统的简化衍生版本。7该方法可最大限度地减少现有技术（如旋转烧瓶）中产生的剪切力，从而提高类球体的可重复性。6此外，旋转式生物反应器可增强活性营养物质的扩散，最大限度地减少在悬滴细胞培养等系统中因培养基更换不切实际而产生的坏死现象6这样，细胞可在几乎不受干扰的条件下生长，从而形成与在组织中生长的细胞相关的结构和生理特征。以这种方式培养的C3A肝细胞（HepG2/C3A）不仅具有超微结构细胞器，还产生了与在体内观察到的水平相当的ATP、腺苷酸激酶、尿素和胆固醇 体内1,2此外，在二维与三维细胞培养系统中生长的细胞表现出不同的基因表达模式83D球形培养的C3A肝细胞基因表达分析显示，这些细胞表达多种肝脏特异性蛋白以及参与调控肝脏功能关键通路的基因。8先前的研究表明，二维培养中指数生长期细胞的蛋白质组与三维球状体培养中处于动态平衡状态的细胞的蛋白质组存在差异5这些差异包括细胞代谢，而细胞代谢反过来会影响细胞的结构、功能和生理特性5二维培养细胞的蛋白质组富含与细胞复制相关的蛋白质，而三维球状体的蛋白质组则更富集于肝脏功能相关蛋白。5.
3D 球状体培养的细胞因其较慢的复制速率，能更准确地模拟与染色质状态及修饰相关的特定现象&#160;（例如组蛋白剪切）9）。组蛋白剪切是一种不可逆的组蛋白翻译后修饰（PTM），可导致组蛋白N端尾部部分发生蛋白水解性切割。尽管其生物学功能仍在讨论中10,11,12,13很明显，HepG2/C3A 细胞在培养成球状体时可模拟其在原代细胞和肝组织中的存在情况，而贴壁培养的扁平细胞则不能9这一点至关重要，因为染色质状态及其修饰主要通过调控基因的可及性，从而调节基因的表达和DNA的读取14组蛋白翻译后修饰通过影响组蛋白组装成的核小体的净电荷，直接调控染色质状态，或通过招募染色质的“书写”、“阅读”和“擦除”蛋白，间接发挥作用。14迄今为止已鉴定出数百种组蛋白PTMs15，进一步支持了染色质是 &#34;组蛋白密码&#34; 用于细胞解读DNA的机制16然而，大量翻译后修饰组合的鉴定15，以及发现组蛋白PTMs的组合通常具有与单独存在的PTMs不同的生物学功能（例如Fischle等）17），表明仍需开展更多工作来破译该 &#34;组蛋白密码&#34;.
目前，组蛋白PTM分析主要基于利用抗体的技术（例如蛋白质印迹、免疫荧光，或染色质免疫沉淀后接测序[ChIP-seq]）或质谱法（MS）。基于抗体的技术具有高灵敏度，能够提供组蛋白修饰在全基因组范围内定位的详细信息，但在研究稀有PTM或多种PTM共存的情况时常常受限18,19,20。相比之下，MS更适合高通量、无偏倚地鉴定和定量单个及共存的蛋白质修饰，尤其是组蛋白18,19,20。正因如此，本研究及多个其他实验室已优化了用于分析组蛋白肽段（自下而上MS）、完整组蛋白尾部（中等向下MS）以及全长组蛋白蛋白（自上而下MS）的质谱流程21,22,23。
以下是培养 HepG2/C3A 类球体并对其进行组蛋白肽段分析（自下而上质谱法，bottom-up MS）的实验流程，该分析通过纳米液相色谱与串联质谱在线联用（nLC-MS/MS）完成。via 首先培养二维细胞，收获细胞后转移至生物反应器中，使其开始形成类球体（图1）。培养18天后，使用丁酸钠或琥珀酸钠处理类球体，以提高组蛋白乙酰化和琥珀酰化修饰的相对丰度。值得注意的是，三维培养物与平面培养物一样，均可接受基因毒性化合物处理；事实上，近期多项研究指出，三维培养条件下细胞的毒理学反应比二维平面培养更接近原代组织24,25。随后在指定时间点收集细胞，并进行细胞核分离。接着，按照 Garcia 等人首次建立的方案26，在胰蛋白酶消化前后分别使用丙酸酐对组蛋白进行提取和衍生化处理。该步骤可生成适合通过反相色谱（C18）在线分离并由质谱检测的肽段。最后，对组蛋白肽段进行鉴定与定量分析，并以多种方式呈现所得数据，以实现更全面的生物学解读。

<table><tbody><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>0.5-20 &amp;micro;L型移液器吸头</td><td>BRAND</td><td>13-889-172（Fisher Scientific）</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>2239480</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L 多通道移液器</td><td>BRAND</td><td>BR7059000（Millipore Sigma）</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 注射器</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>14-817-31（Fisher Scientific）</td><td>鲁尔锁扣尖端，刻度至 12 mL</td></tr><tr><td>10, 20, 200 和 1000 &amp;micro;L 单通道移液器</td><td>Eppendorf</td><td>14-285-904（Fisher Scientific）</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;micro;L型移液器吸头</td><td>Rainin</td><td>30389164</td><td></td></tr><tr><td>18 G 注射器针头</td><td>Air-Tite</td><td>14-817-100（Fisher Scientific）</td><td>3&quot; 长度，0.05&quot; 直径</td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L 多通道移液器</td><td>康宁</td><td>4082</td><td></td></tr><tr><td>2-200 &amp;micro;L型移液器吸头</td><td>品牌</td><td>Z740118（Millipore Sigma）</td><td></td></tr><tr><td>24孔超低吸附微孔板</td><td>康宁</td><td>07-200-602</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;&amp;nbsp; U形细胞培养瓶</td><td>康宁</td><td>461464U</td><td>未处理，带通气帽</td></tr><tr><td>96孔带裙边板</td><td>Axygen</td><td>PCR-96-FS-C（Corning）</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Fisher Scientific</td><td>A949-1</td><td>丙酮应冷用</td></tr><tr><td>碳酸氢铵（NH₄HCO₃）&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;HCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6141-25G</td><td></td></tr><tr><td>氨水溶液</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC423300250</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养级水</td><td>康宁</td><td>25-055-CV</td><td></td></tr><tr><td>ClinoReactor</td><td>CelVivo</td><td>10004-12</td><td>用于三维细胞培养的生物反应器</td></tr><tr><td>ClinoStar</td><td>CelVivo</td><td>N/A</td><td>Clinostat CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 用于三维细胞培养的培养箱</td></tr><tr><td>控制单元</td><td>CelVivo</td><td>N/A</td><td>ClinoStar 设置用平板电脑</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>康宁</td><td>17-205-CV</td><td>含4.5 g/L葡萄糖和丙酮酸钠的1×溶液，不含L-谷氨酰胺和酚红</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>康宁</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>甲酸</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>通风橱</td><td>Mott</td><td>N/A</td><td>Model 7121000</td></tr><tr><td>巴斯德玻璃吸管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-8B</td><td>9&quot;，带棉塞的，硼硅酸盐玻璃，非无菌</td></tr><tr><td>谷氨酰胺补充剂</td><td>康宁</td><td>25-015-CI</td><td>200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺</td></tr><tr><td>汉克&amp;rsquo;Hanks' 平衡盐溶液 (HBSS)</td><td>康宁</td><td>21-022-CV</td><td>不含钙、镁和酚红的1X溶液</td></tr><tr><td>HPLC级乙腈</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 级水</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6-1</td><td></td></tr><tr><td>盐酸（HCl）</td><td>Fisher Scientific</td><td>A481-212</td><td></td></tr><tr><td>冰</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸</td><td>康宁</td><td>25-025-CI</td><td>100倍浓度溶液</td></tr><tr><td>Oasis HLB 树脂</td><td>Waters</td><td>186007549</td><td>亲水-亲脂平衡（HLB）树脂与30&amp;micro;m 粒径</td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 质谱仪</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td><td>高分辨率质谱仪</td></tr><tr><td>Oro-Flex I 聚丙烯滤板</td><td>Orochem</td><td>OF1100</td><td>96孔聚丙烯滤板，带10 &amp;micro;M PE 滤芯</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>康宁</td><td>30-002-CI</td><td>100倍浓度溶液</td></tr><tr><td>pH试纸</td><td>Hydrion</td><td>Z111848（Sigma-Aldrich）</td><td>0-13 pH 试纸</td></tr><tr><td>移液枪</td><td>Eppendorf</td><td>Z666467（Millipore Sigma）</td><td></td></tr><tr><td>多微孔毛细管</td><td>Molex</td><td>50-110-7740（Fisher Scientific）</td><td>带有聚酰亚胺涂层的柔性熔融石英毛细管，75 &amp;micro;M ID x 363 &amp;micro;M OD</td></tr><tr><td>无菌聚苯乙烯10 mL刻度吸管</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367549</td><td></td></tr><tr><td>丙酸酐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240311-50G</td><td></td></tr><tr><td>冷藏离心机</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>75-217-420</td><td></td></tr><tr><td>Reprosil-Pur 树脂</td><td>MSWIL</td><td>R13.AQ.0003</td><td>120 &amp;Aring; 孔径，C18-AQ 相，3 &amp;micro;M 磁珠尺寸</td></tr><tr><td>旋转器</td><td>Clay Adams</td><td>25477（American Laboratory Trading）</td><td>Nutator Mixer 1105</td></tr><tr><td>测序级修饰胰蛋白酶</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>丁酸钠</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A11079</td><td></td></tr><tr><td>琥珀酸钠二碱</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14160-100G</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac 真空浓缩仪（1.5 mL 微型离心管）</td><td>天才</td><td>20249（American Laboratory Trading）</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac 真空浓缩仪（96 孔）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15308325</td><td>Savant SPD1010</td></tr><tr><td>无菌操作台</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>1375</td><td>II类，A2型</td></tr><tr><td>硫酸（H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-004-375</td><td>Baker 分析用 ACS 试剂</td></tr><tr><td>经组织培养处理的100 mm × 20 mm培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-23</td><td></td></tr><tr><td>三氯乙酸（TCA）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AC421451000</td><td>将100%（w/v）样品重悬于HPLC级水中</td></tr><tr><td>三氟乙酸（TFA）</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI28904</td><td>测序级</td></tr><tr><td>96孔真空抽滤装置</td><td>Millipore</td><td>MAVM0960R</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z258415</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Fisher Scientific</td><td>FSGPD10</td><td></td></tr><tr><td>宽口移液器吸头 1000 &amp;micro;L</td><td>Axygen</td><td>14-222-703（Fisher Scientific）</td><td></td></tr><tr><td>宽口吸头 200 &amp;micro;L</td><td>Axygen</td><td>14-222-730（Fisher Scientific）</td><td></td></tr></tbody></table>

三维肝组织细胞培养模型中组蛋白翻译后修饰的全局定量分析

Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue

哺乳动物细胞的平面培养是一种广泛应用的技术 体外 理解细胞生理学的一种方法，但该系统在模拟实体组织时存在局限性，因其细胞增殖速度 unnatural 地过快。这在模拟成熟染色质时尤为突出，因为快速增殖的细胞常处于 DNA 复制阶段，并表现出异质性的多倍体群体。下文介绍一种利用三维（3D）细胞培养系统建模、处理和分析静息状态染色质修饰的工作流程。根据本方案，肝细胞癌细胞系在提供主动营养扩散和低剪切力的培养箱中培养，形成可重复的 3D 球状体。使用丁酸钠和琥珀酸钠处理后，分别诱导组蛋白乙酰化和琥珀酰化水平升高。组蛋白乙酰化与琥珀酰化水平的升高与更为开放的染色质状态相关。随后收集球状体以分离细胞核，并从中提取组蛋白，用于分析其翻译后修饰。组蛋白分析通过以下步骤进行 通过 液相色谱与串联质谱在线联用，随后通过内部开发的计算流程进行分析。最后，展示了用于研究组合式组蛋白修饰频率与分布的数据呈现示例。

在此方案中，HepG2/C3A 球状体经 20 mM NaBut 和 10 mM NaSuc 处理，二者均影响组蛋白 PTM 的整体水平（图3A）。随后在单残基水平上鉴定并定量组蛋白PTMs 通过 MS/MS 采集（图3B).
当样本以重复形式运行时，可进行统计分析，以评估样品间翻译后修饰（PTM）的倍数变化富集程度以及观察结果的可重复性。所示数据表明，在经 NaBut 处理的类球体中，乙酰化修饰的肽段富集程度高于对照组（图 3C）；而经 NaSuc 处理的样品中，赖氨酸琥珀酰化修饰的组蛋白肽段相对丰度更高（图 3D）。这些计算在电子表格程序中完成，具体方法详见另一篇文献34。特定组蛋白修饰的整体增加情况可通过雷达图更直观地呈现，即使保留了所分析修饰位点的详细信息，也能更清晰地观察...

本方案概述了如何利用三维细胞培养系统在接近生理状态下建模、处理和分析染色质修饰。

哺乳动物细胞的平面培养是一种广泛使用的体外研究细胞生理学的方法，但该系统在模拟实体组织...

已有研究表明，全局染色质动态变化在多种疾病状态（如癌症和衰老）中发挥着重要的介导作用。我们的实验方案提供了一个符合生理相关性的模型，可用于研究这一过程。目前，实验室对组蛋白翻译后修饰（PTM）的标准分析通常局限于使用基于抗体的检测方法，每次仅能检测一种特定的PTM。通过液相色谱-质谱联用技术分析组蛋白翻译后修饰，可使我们在单次实验中检测数百种翻译后修饰的丰度。本实验操作将由来自实验室的博士后Stephanie Stransky、研究生Ronald Cutler和研究技术员Julie Kim分别进行演示。首先，使用标准培养基将细胞以单层形式培养至80%汇合度。然后用HBSS洗涤细胞。加入5毫升用HBSS稀释的0.05%胰蛋白酶-EDTA。将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育5分钟。使用显微镜检查细胞脱落情况。计数细胞后，用新鲜培养基稀释细胞悬液。加入0.5毫升培养基，以平衡一个超低吸附的24孔圆底板，每孔内含多个微孔。然后以3000 × g离心培养板，以去除板表面的气泡。接着将先前制备的细胞悬液转移至24孔板中，并在120 × g下离心3分钟。检查24孔板中的细胞，随后将培养板置于37°C、含5%二氧化碳的环境中孵育24小时，以形成球状体。同时，为平衡生物反应器，向湿度室中加入 25 毫升无菌水，并向细胞室中加入 9 毫升培养基。将生物反应器置于旋转式离心模拟器培养箱中，在 37°C、5% CO₂ 条件下孵育 24 小时。使用 1 毫升宽口吸头轻轻吹打，从超低吸附 24 孔板上分离类球体，并将其转移至组织培养皿中。为选择足够优质的类球体，需在显微镜下检查其质量。高质量的类球体应具有均匀的大小、致密性和圆形度。向已平衡的生物反应器中加入五毫升新鲜培养基，并将类球体转移至其中。然后用新鲜的培养基完全填充生物反应器，并将生物反应器置于转速为10至11 RPM的旋转培养箱中。每两到三天更换一次培养基，用新鲜培养基替换10毫升旧培养基。随着这些类球体的尺寸和数量增加，逐步提高培养箱的旋转速度。获得球状体沉淀后，向沉淀中加入五倍体积的预冷0.2摩尔硫酸，用移液器反复吹打以破坏沉淀并释放组蛋白。离心获得上清液后，加入预冷的浓三氯乙酸，使终浓度达到25%至30%（体积比）。通过轻轻颠倒离心管数次混匀，然后按照文中所述进行离心。弃去上清液后，使用玻璃巴氏吸管，用约 500 µL 冷丙酮和 0.1% 盐酸洗涤沉淀物及管壁，然后在 4 °C 条件下以 3,400 × g 离心 5 分钟。随后将离心管倒置以弃去上清液。使用玻璃巴氏吸管加入 500 µL 100% 冷丙酮洗涤沉淀物，并按前述方法再次离心。弃去上清液后，小心地用移液枪彻底去除丙酮，并将样品在敞盖条件下干燥约20分钟。将沉淀物重悬于20微升含有15%至20%乙腈的100毫摩尔/升、pH为8的碳酸氢铵溶液中。涡旋混匀后，在1000 × g离心30秒使悬浮液沉降。对于八个或更多样本，将每个重悬的样本转移至96孔板中。然后在通风橱中加入2 µL丙酸酐，通过移液吹打混合5次。迅速加入10 µL氢氧化铵，再次通过移液吹打混合5次。在磁力搅拌器上混合HLB树脂。然后将70 µL HLB悬浮液加入置于96孔收集板上的96孔滤板的每个孔中。弃去滤过液后，用100 µL含0.1%三氟乙酸的溶液洗涤树脂。将每个样品重悬于 100 微升 0.1% 三氟乙酸中后，将每个样品加入各孔中，并使用真空装置防止溅出。弃去滤过液后，用 100 微升 0.1% 三氟乙酸洗涤样品，并将滤板置于新的收集板上。接着，向每孔中加入 60 微升含 0.1% 三氟乙酸的 60% 乙腈溶液，并用真空装置防止溅出。收集流穿部分，并在真空浓缩仪中干燥。将干燥后的收集板放入高效液相色谱仪中，按照文中所述运行液相色谱-串联质谱（LC/MS/MS）方法。本研究中，观察了以三维球状体形式培养的C3A肝细胞中常见组蛋白翻译后修饰的相对丰度。在组蛋白蛋白衍生的肽段中，也可观察到单个氨基酸残基上的翻译后修饰。用丁酸钠处理类球体可增加组蛋白乙酰化的相对丰度，而用琥珀酸钠处理则增强组蛋白残基的琥珀酰化。该方法还展示了丁酸钠处理后组蛋白乙酰化的分布模式，以及琥珀酸钠处理后组蛋白琥珀酰化的分布模式。结果还显示了不同组蛋白修饰之间的组合模式。当组蛋白H3衍生肽段的第9位赖氨酸残基含有两个甲基时，丁酸钠处理显著增强了该肽段第14位赖氨酸残基的乙酰化水平；但当第9位赖氨酸残基含一个或三个甲基时则无此效应。此外，还计算了H3衍生肽段中各单个修饰以及多种翻译后修饰组合的相对丰度。在组蛋白 H4 来源的肽段中，也观察到丁酸钠处理后翻译后修饰的组合模式。同样，丁酸钠处理导致乙酰化水平显著升高。应特别注意尽量减少类球体在实验台上的暴露时间，并在脱盐步骤中防止样品洒出。该工作流程可用于在比快速增殖的贴壁细胞培养更接近生理状态的模型中探索实体组织中的染色质结构。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

肝组织3D细胞培养模型中组蛋白翻译后修饰的全球水平定量

我们描述了一组用于分析H1连接子组蛋白表达水平的检测方法。通过基于随机引物的逆转录反应，随后进行实时PCR，可对各个H1基因的mRNA进行定量检测；而H1组蛋白的蛋白质定量则通过高效液相色谱（HPLC）分析实现。...

哺乳动物连接组蛋白亚型的表达分析

质谱技术的进步使得对多种组织中蛋白质表达和修饰的高通量分析成为可能。结合亚细胞组分分离技术和疾病模型，定量质谱分析与生物信息学方法能够揭示生物系统中的新特性。本文所述方法用于分析心脏疾病背景下与染色质相关的蛋白质，且可轻松适用于其他人类疾病的体内模型。...

疾病中染色质蛋白质组的定量分析

本方案概述了一种利用质谱法（MS）全面表征组蛋白翻译后修饰的整合工作流程。该流程包括从细胞培养物或组织中纯化组蛋白、组蛋白衍生化与消化、采用纳米流速液相色谱进行质谱分析，以及数据分析的详细说明。本方案设计可在2至3天内完成。...

使用自下而上质谱法分析组蛋白翻译后修饰的完整工作流程：从组蛋白提取到数据分析

本文的目的是提供一份全面、系统的指南，用于高效纯化组蛋白H3和H4，并定量分析乙酰化组蛋白残基。...

组蛋白H3和H4蛋白的纯化及细胞与脑组织中乙酰化组蛋白修饰的定量

本方案重点介绍从速冻组织中制备染色质的方法，适用于交联染色质免疫沉淀（X-ChIP）后续进行定量PCR分析（X-ChIP-qPCR）或高通量测序（X-ChIP-seq）。...

从冷冻嵌合肝组织中提取染色质用于染色质免疫沉淀分析

本研究描述了一种利用细胞核内流式细胞术对分离自脑组织的小胶质细胞进行全基因组组蛋白修饰定量的实验方案。本研究还包含了用于数据采集的小胶质细胞分离方案。...

利用核内流式细胞术定量分析分离的小鼠脑小胶质细胞中组蛋白全局翻译后修饰

基于液相色谱、捕集离子淌度质谱和飞行时间质谱（LC-TIMS-ToF MS/MS）的分析工作流程，用于高置信度和高重复性的“自下而上”组蛋白修饰分析，并依据主要参数（保留时间 [RT]、碰撞截面 [CCS] 和精确质荷比...

使用液相色谱、捕获离子淌度谱和飞行时间质谱进行组蛋白修饰筛选

本方法描述了一种简单且快速的组蛋白蛋白异构体表征与研究策略。...

利用二维-毛细管等电聚焦/十二烷基硫酸钠凝胶电泳揭示组蛋白蛋白异构体

本方案可从多种临床样本中高效提取组蛋白，用于后续通过液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）进行翻译后修饰分析。通过实现对关键组蛋白修饰的可靠检测，该方法可作为大规模临床队列中全面表观遗传学分析的重要工具。...

从临床样本中提取组蛋白用于质谱法进行表观遗传学分析

本文介绍了一种利用同位素双联标记策略和ArgC酶解实现单细胞组蛋白翻译后修饰分析自动化的实验方案。该工作流程能够以单细胞分辨率对染色质异质性和表观遗传响应进行定量、可重复且高灵敏度的分析。...

用于单细胞组蛋白翻译后修饰多重分析（sc-hPTM2）的自动化样本制备

本方案介绍了一种全面的成像流程，用于在完整肝组织中可视化并建模肝星状细胞的形态。该方法结合利用小鼠遗传学对成纤维细胞进行荧光标记， 原位 基于肝脏灌注的组织制备，以及改良的iDISCO组织透明化方法，以实现光学透明。...

在小鼠肝纤维化模型中绘制肝星状细胞形态

学习使用液相色谱质谱联用技术对C3A肝细胞三维球状体培养物中的组蛋白翻译后修饰进行全球水平定量分析。该方法可同时检测数百种修饰，为研究癌症和衰老等疾病中的染色质动态变化提供可靠的生理学相关模型。

三维肝组织细胞培养模型中组蛋白翻译后修饰的全局定量分析

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