用于表征成人型弥漫性浸润性胶质瘤微环境的数字空间分析
2022年9月13日
蛋白质组失调在弥漫性浸润性胶质瘤的扩散过程中起着重要作用，但仍有多种相关蛋白质尚未被鉴定。数字空间分析技术（DSP）为高效、高通量地表征可能参与浸润性胶质瘤侵袭与迁移的候选蛋白质的差异表达提供了一种有效方法。
数字空间分析（Digital Spatial Profiling，DSP）为进行空间分层的蛋白质定量提供了一种高效的方法。该技术的实施使我们能够表征肿瘤不同区域及其微环境中的蛋白质表达情况。DSP 的一个关键特征是其多重检测能力，可实现高通量的数据处理。
定义自定义感兴趣区域的能力为数据分析额外提供了空间维度。数字空间分析技术（DSP）可应用于任何样本，其中对蛋白质或RNA表达进行空间定量可能有助于阐明病理或生理过程。这在肿瘤学中尤为重要，因为不同区域的靶标差异可能与恶性生长或侵袭相关。
演示该操作的人员为组织技术员 Scott Palisoul 和基因组技术员 Rachael Barney。制备切片时，首先从每份活检样本中取出数个直径两毫米的组织芯，放入同一个组织微阵列蜡块中。从该蜡块上切下四微米厚的切片，并将其贴附于玻璃载玻片上。
将每张载玻片放入载玻片托架垫圈内，在60摄氏度下孵育30分钟。在半自动免疫组化系统中，向一号位置的容器中每张载玻片加入150 µL洗涤缓冲液，并额外加入5 mL死体积，保持盖子打开。在二号位置的容器中加入等量的封闭液。
将试剂容器托盘装入仪器中。在“标记物”字段的下拉框中选择“处理IHC”，然后选择封闭溶液名称。所有玻片处理完成后，点击“关闭”。
然后点击“打印标签”，勾选“所有尚未打印的载玻片标签”，再点击“打印”。将标签粘贴至载玻片顶部。将载玻片放入载玻片托盘中，确保样本面和标签面朝上。
按下 LED 按钮以降下托盘，并让仪器开始扫描和识别载玻片。点击“开始”按钮以启动实验。当运行完成后，当 LED 按钮闪烁绿色时，按下该按钮。
从仪器中取出托盘，小心地将每张玻片上的盖片取下。将玻片放入1X磷酸盐缓冲液中。去除多余的缓冲液，并用疏水笔在每张组织切片周围画线，以形成疏水屏障。
通过每张载玻片加入八微升抗体，并用缓冲液W补足至终体积200微升，配制抗体PC寡核苷酸溶液。然后将抗体PC寡核苷酸溶液加至载玻片上，在4摄氏度下孵育过夜。孵育结束后，将载玻片置于湿盒中，并用1X TBST洗涤三次，每次10分钟。
在室温下用 4% 多聚甲醛后固定 30 分钟，随后用 1× TBST 洗涤两次，每次 5 分钟。在室温下加入 SYTO 13 核染料染色 15 分钟，然后用 1× TBST 洗涤两次。将鼠标悬停在控制中心的“数据采集”上，选择“新建”或“继续运行”。
将载玻片放入载玻片架中，标签朝向使用者。放下载玻片托盘夹，确保组织在长条形窗口中可见。加入 6 mL 缓冲液 S。按照控制中心中的提示操作。
使用 x 和 y 滑块在不同轴之间缩放，以划定扫描区域。选择扫描，待扫描进行至整个定义的目标区域成像完毕。生成 20 倍图像。
通过为每个组织核心选择三个直径为250微米的等尺寸圆形感兴趣区域（ROI）来定义ROI。单击“退出扫描工作区”按钮以确认ROI。然后等待紫外光将寡核苷酸从抗体上切割下来。
完成清洗仪器程序后，选择“新建数据采集”以继续使用当前的载玻片或板。通过双击板图标区域打开最终板窗口。输入杂交编码试剂盒的批号，然后点击“更新”。
然后单击“完成”。根据提示拆下玻片架和收集板。将玻片储存在 TBST 中，或用液体介质和盖玻片覆盖，以长期保存。
使用透气封板膜密封反应板，并将吸出液置于热循环仪中，65摄氏度、开盖条件下干燥。加入7 µL焦碳酸二乙酯处理过的水并混匀。室温孵育10分钟，然后快速离心。
通过选择适当的探针 R 和探针 U 的计算公式，并按照文本方案中描述的公式进行计算，制备探针缓冲液混合物。将 84 微升探针缓冲液混合物加入每个杂交编码试剂盒中。在新的 96 孔杂交板中，将 8 微升每种杂交编码预混液分别加入指定行的全部 12 个孔中。
从DSP收集板中转移7 µL至杂交板的对应孔中。进行热封，离心混匀，并在67 °C下孵育过夜。孵育结束后，将板置于冰上冷却，并进行短暂离心。
将每个孔中的杂交产物汇集至一条排管中，轻轻吹打每个孔5次。离心后，将排管放入分析系统。在DSP仪器上，将CDF文件保存至U盘，并将数据转移至数字分析仪。
在屏幕上，点击“开始处理”。选择“高灵敏度”，然后点击“下一步”。针对含有样品的孔数，点击“全选”，然后点击“完成”，接着在电子邮件通知页面点击“下一步”。
然后点击“开始”。当预处理工作站完成后，密封试剂盒并将其转移至数字分析仪。按下“开始计数”。
选择阶段位置。按下“加载现有 CDF 文件”，并选择先前上传的文件。按下“完成”。
再次选择“阶段位置”，按下“完成”，然后点击“开始”以运行程序。将分析系统中报告基因计数转换文件的ZIP文件保存至U盘，并将该U盘插入DSP仪器中。
在 DSP 控制中心，将鼠标悬停在数据收集上，然后点击上传账户。选择相应的 ZIP 文件。在 DSP 控制中心点击记录。
要查看队列中的扫描结果，请选择“将所选扫描添加到队列”，然后进入“我的分析队列”。将鼠标悬停在控制中心的“数据分析”选项上，选择“从队列创建新研究”。对胶质母细胞瘤样本进行了 DSP 实验，并以热图形式展示结果。
每一行代表一个蛋白质靶点，每一列对应一个感兴趣的区域。表达水平通过颜色范围表示，蓝色表示低表达，红色表示高表达。同一行内颜色的变化反映了蛋白质在不同区域的异质性，提示可能存在与蛋白质差异表达相关的空间关联。
在此实验中，S100 和 CD-56 普遍高表达，因为它们是神经标志物。变异程度最大的标志物包括 B7-H3、KI-67、CD-44 和纤维连接蛋白，这些标志物已知与肿瘤增殖、迁移和转移相关。从大量候选靶标中，DSP 可识别出具有显著区域差异的靶标。
这为研究与变异相关的因素及其在疾病中的意义奠定了基础。
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概述
数字空间分析（DSP）是一种强大的技术，可用于量化肿瘤及其微环境不同区域中的蛋白质表达。该方法有助于加深我们对蛋白质组失调在弥漫性浸润性胶质瘤中作用的理解，特别是在其侵袭和迁移过程中的作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 肿瘤学
- 蛋白质组学
背景
- 蛋白质组失调在胶质瘤的扩散过程中至关重要。
- 许多参与胶质瘤侵袭的蛋白质仍未被鉴定。
- DSP 技术可实现对蛋白质表达的高通量分析。
- 了解区域性的蛋白质差异可为治疗策略提供依据。
研究目的
- 表征胶质瘤中差异性蛋白质表达。
- 鉴定参与胶质瘤侵袭的候选蛋白质。
- 利用DSP实现高效的蛋白质空间定量。
使用的方法
- 用于蛋白质定量的数字空间分析技术（Digital Spatial Profiling, DSP）。
- 具备高通量数据处理的多重检测能力。
- 可自定义感兴趣区域以进行空间分析。
- 将数字空间分析技术应用于肿瘤样本以获得病理学见解。
主要结果
- DSP 可有效表征肿瘤不同区域间的蛋白质表达。
- 鉴定出的蛋白质可能与胶质瘤的侵袭和生长相关。
- 高通量处理可提高数据分析效率。
- 空间定量分析可提供关于肿瘤微环境的深入见解。
结论
- DSP 是研究胶质瘤生物学的有力工具。
- 了解蛋白质表达模式有助于胶质瘤研究。
- 进一步鉴定蛋白质可能发现新的治疗靶点。
常见问题
行业重要性概述
数字空间分析（Digital Spatial Profiling, DSP）可实现对成人型弥漫性浸润性胶质瘤中空间上 distinct 的肿瘤区域及微环境区域进行高分辨率、多重蛋白质表达定量。该技术填补了空间蛋白质组学分型领域的一项关键空白，有助于在发现与转化研究的交汇层面推进机制性风险降低和靶点验证。DSP 提供的空间分辨数据可为神经肿瘤学研发中的靶点选择及项目组合筛选提供预测性信心支持。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可检测与肿瘤增殖和侵袭相关的空间异质性蛋白靶点。
- 通过绘制肿瘤及其微环境区域内蛋白异质性分布，支持功能靶点的验证。
- 通过揭示候选生物标志物的区域特异性表达模式，助力机制层面的风险降低。
- 提高对具有空间限制性或富集表达特征的靶点进行优先排序的预测可信度。
筛选与检测方法开发
- 制备经过验证的组织微阵列，用于下游多重分析工作流程。
- 标准化定量空间蛋白质组学输出，以实现可重复的检测方法开发。
- 可在定义的兴趣区域（ROIs）内对蛋白质组合进行高通量筛选。
- 支持对化合物在空间上不同的肿瘤微环境中的效应进行可靠评估。
转化与临床前研究
- 将空间蛋白质组学数据与疾病相关区域对齐，为转化生物标志物策略提供依据。
- 通过关联蛋白质异质性与肿瘤生物学，实现从发现到临床前验证的连续性研究。
- 基于空间分辨的靶点表达谱，支持风险调整后的研发推进决策。
- 通过阐明肿瘤微环境对肿瘤进展的贡献，降低转化研究的风险。
流程与工作流整合
DSP 通过实现空间分辨的假设检验、靶点验证和生物标志物比对，融入了从发现到临床前研究的连续过程，推动胶质瘤研究的发展。
- Discovery Biology：通过蛋白质表达的空间定位，支持假设验证和通路解析。
- Screening：提供可重复的定量结果，用于检测就绪性评估及不同条件间的比较。
- Analytics：提供多重测量和热图可视化，以评估区域性的蛋白质异质性。
- Translational Research：将空间蛋白质组学特征与疾病相关生物学及生物标志物开发相连接。
- Enterprise Reuse：建立可重复使用的平台，用于在多种肿瘤模型中开展空间蛋白质组学分析。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点选择的预测可信度，降低机制上的不确定性。
- 操作价值：标准化空间蛋白质组学工作流程，以实现可重复性和可扩展性。
- 战略价值：支持基于充分信息的立项/终止决策，实现资本高效的投资组合管理。
- 组合影响：支持基于风险调整的空间验证靶点的优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备空间蛋白质组学、组织微阵列构建和荧光显微镜方面的专业知识。
- 需要能够使用DSP仪器、多重抗体面板以及先进的数据分析基础设施。
- 需要跨团队对感兴趣区域（ROI）的选择和数据分析解读流程进行标准化。
- 针对不同肿瘤类型或组织结构可能需要进行方法调整。
- 通量和抗体面板规模可能受限于可用试剂和仪器的承载能力。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:08
Preparation of Slides and Semi‐Automated IHC System
2:50
Antibody Incubation and Nuclei Staining
3:39
Fluorescence Visualization, ROI Identification, and UV Photocleavage
5:17
Protein Readout and Data Analysis
7:51
Results: Digital Spatial Profiling on Glioblastoma Samples
8:47
Conclusion
