Name: 用于表征成人型弥漫性浸润性胶质瘤微环境的数字空间剖析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T12:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 了解数字空间剖析技术用于表征弥漫性浸润性胶质瘤微环境中的蛋白质表达差异。该方法可识别与肿瘤侵袭相关的候选蛋白，为神经肿瘤学研究提供高通量空间定量分析工具。

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作者感谢达特茅斯希区柯克医疗系统病理科与实验室医学部的临床基因组学与先进技术实验室提供的支持。作者还感谢达特茅斯癌症中心病理科共享资源，该资源获得了美国国家癌症研究所癌症中心支持基金 5P30 CA023108-37 的资助。

以下方案遵循达特茅斯-希契科克人类研究伦理委员会的指导原则。已获得提供组织样本的患者的知情同意。有关本方案中使用的所有材料、试剂、设备和软件的详细信息，请参见材料表部分。
1. 载玻片制备17
<ol>
	<li>获取或制备来自成人型弥漫性浸润性胶质瘤的人体组织福尔马林固定、石蜡包埋样本。 
	注意：本实验中使用了三例胶质母细胞瘤患者活检样本的石蜡包埋组织块。</li>
	<li>构建组织微阵列（TMA）蜡块。从每例活检样本中取出多个直径2 mm的组织芯，植入同一个TMA蜡块中（图1，顶部）。将TMA蜡块切成4 µm厚的切片，贴附于玻璃载玻片上。将每张载玻片放入载玻片托架垫圈内。在60 °C下孵育30分钟。</li>
</ol>
2. 免疫组化半自动系统的准备与软件配置（用于载玻片的加载与运行）17
<ol>
	<li>准备试剂。点击 试剂配制 按钮。单击 添加 在 设置 表。
	<ol>
		<li>通过在其中输入名称来注册一种洗涤缓冲液 名称 领域。选择 辅助的 在 类型 领域。点击 保存.</li>
		<li>使用相同的步骤（根据实际情况进行相应修改，例如在以下情况中）重复操作以配制封闭溶液 名称 视野），但选择 一抗 在 类型 领域。在下拉框中选择所需的方案 默认染色方案 和 默认HIER方案选择一个 默认酶反应方案 如有需要，可选择此选项（本方案中该选项框留空）。点击 保存.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>注册 检测系统，由一个条形码 试剂容器托盘. 扫描 的 条形码.
	<ol>
		<li>开始输入试剂系统的详细信息 添加研究试剂系统 窗口。键入 a 名称 用于检测系统。</li>
		<li>输入一个 有效期. 重点 的 第一行 的 试剂 图表和 扫描 的 条形码 30 mL的新款 试剂容器，此时条形码将填充至第1行。</li>
		<li>将容器置于位置1 检测系统. 在下拉框中选择洗涤缓冲液的名称 试剂 柱并单击 添加重复上述步骤，依次在后续各列中加入其他试剂，包括封闭液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置 免疫组化蛋白质实验方案 点击 实验方案设置. 选中与所需方案对应的行，然后点击 复制。输入 名称 并填写其他任何相关字段 编辑实验方案属性 窗口
	<ol>
		<li>选择该复选框 显示洗涤步骤确认 增量（分钟） 和 分配类型 每种试剂的字段均正确10 分钟 对于 封闭液，0 分钟 对于 洗涤缓冲液，以及 150 µL 每个 分配类型）。点击 保存.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备实验。将位置1的容器装满 洗涤缓冲液. 每张载玻片加入150 µL，死体积为5 mL；保持盖子打开。对位于位置2的容器重复上述步骤，该容器应装入 封闭液该容器每张载玻片应含有150 µL，死体积为350 µL。
	<ol>
		<li>加载 试剂容器托盘 上机。让系统执行容器识别和体积确认操作。点击 载玻片设置 | 添加研究. 输入 研究编号 和 研究名称 并选择 150 µL 下 分配体积 的 理想方案 在 制备方案 下拉菜单烘烤与脱蜡 建议）突出显示该研究并点击 添加载玻片.</li>
		<li>选择 测试组织 下 组织类型 | 150 µL 在……下方 分配体积 | 单通道 和 常规 从 染色模式 下拉框。选择一个 过程 (免疫组织化学 （针对本研究）| 该 封闭液名称 在下拉框中 标记物 领域 IHC DSP 实验方案 在 染色 领域 实验方案 标签 | *烘烤与脱蜡 用于 制备 | *HIER 20 分钟，使用 ER1 用于 HIER。静置 酶 现场空白样</li>
		<li>对每张载玻片重复此过程。点击 关闭 完成后，点击 打印标签检查 当前研究尚未打印全部载玻片标签 并点击 打印将标签贴在载玻片的顶部。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加载并运行切片。将切片放置于切片托盘上，确保样本面和标签面朝上。放置 盖玻片 将载玻片推入载片架中，确保载玻片方向正确，标签朝下。将载片架装入仪器。
	<ol>
		<li>按压 LED 按钮以降低托盘，使仪器开始扫描和识别载玻片。单击 开始 开始实验的按钮。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>完成实验。按下 LED 当按钮闪烁绿色时，表示运行完成，此时取出仪器中的托盘，小心地从每张载玻片上取下覆盖片。将载玻片置于1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，去除多余缓冲液，再用疏水笔在每张组织切片周围画线，形成疏水屏障。</li>
</ol>
3. 抗体孵育与细胞核染色17
<ol>
	<li>选择一组抗体以定位目标抗原（本实验所用抗体见表1）。 
	注意：每种抗体已与一段带有紫外光可切割片段（PC-oligo）的DNA寡核苷酸共价连接，该寡核苷酸可特异性识别对应抗体（索引寡核苷酸，图2）。</li>
	<li>配制工作浓度的抗体-PC-oligo溶液：每张切片加入8 µL每种抗体（按1:40稀释），用封闭试剂作为稀释液，使每张切片总体积达到200 µL。4 °C孵育过夜（图3，步骤1）。 
	注意：此步骤中也可向溶液中添加形态学标记物、生物染料或荧光标记抗体。</li>
	<li>次日，将切片置于考普林瓶中，用1x TBS-T缓冲液洗涤3次，每次10分钟。随后在室温下用4%多聚甲醛固定30分钟，再用1x TBS-T缓冲液洗涤2次，每次5分钟。</li>
	<li>加入SYTO13核染色剂（用1x TBS缓冲液按1:10稀释），室温孵育15分钟。用1x TBS-T缓冲液洗涤2次后，将切片保存于1x TBS-T缓冲液中。</li>
</ol>
4. 在 DSP 仪器上进行荧光可视化、ROI 鉴定和紫外光解17
<ol>
	<li>在控制中心将鼠标悬停于数据采集上，然后选择新建/继续运行。</li>
	<li>将切片放入切片架中，标签朝向用户。放下切片托盘夹，确保组织在长条形窗口中可见。 加入 6 mL 缓冲液 S。</li>
	<li>按照控制中心中的提示操作。使用X-和Y-滑块在不同轴之间缩放，以划定扫描区域。选择扫描。让扫描持续进行，直至整个定义的目标区域完成成像。</li>
	<li>生成 20 倍图像。通过自动或手动方式定义感兴趣区域（ROI）（图 3，步骤 2）。为遵循本方案，为每个组织芯选择三个尺寸相同、呈圆形的 ROI（直径为 250 µm）（图 4，底部）。 
	注意：ROI 的大小和形状可自定义。每个切片中可选择多个 ROI。本实验中，ROI 为手动定义。</li>
	<li>单击退出扫描工作区按钮以确认 ROI。等待紫外光将寡核苷酸从抗体上解离。</li>
	<li>当清洗仪器过程完成后，选择新建数据采集以继续使用当前切片或微孔板；否则选择移除切片和微孔板。</li>
	<li>在控制中心右下角双击微孔板图标区域，打开完成微孔板窗口。如果已知杂交（Hyb）编码包批号（#），请输入该编号并单击更新（此步骤中为可选项）。单击完成。</li>
	<li>根据提示拆下切片架和收集板。将切片储存在 TBS-T 中。如果切片长时间不使用，应覆盖水性介质并加盖盖玻片。</li>
</ol>
5. 蛋白质检测17
<ol>
	<li>使用透气封膜，在热循环仪中于65 °C下将吸出液干燥（仪器盖子保持打开状态）。加入7 µL经焦碳酸二乙酯处理的水并混匀。室温孵育10分钟，然后快速离心。</li>
	<li>从表2中选择合适的Probe R和Probe U计算公式，以指导探针/缓冲液混合液的配制。根据本实验中杂交所需的Hyb Codes数量，应用如下公式（1）。混匀后立即快速离心。 
	# Hyb Codes 探针R工作母液 探针U工作母液 杂交缓冲液 n = _______ (n × 8 µL) = _____ µL + (n × 8 µL) = ______ µL + (n × 80 µL) = _____ µL （1）</li>
	<li>向每个待使用的Hyb Code Pack中加入84 µL探针/缓冲液混合液。轻弹混匀后快速离心。在新的96孔杂交板中，将每种Hyb Code主混合液各8 µL加入指定行的全部12个孔中。</li>
	<li>从DSP收集板中转移7 µL液体至杂交板的对应孔中，轻轻混匀。热封后快速离心。然后在67 °C下过夜孵育。将板置于冰上冷却，再进行一次快速离心。</li>
	<li>将每个孔中的杂交产物汇集至一条排管中，用移液器轻柔吹打每孔5次以充分混匀。盖紧排管后离心。将未混合的剩余杂交产物于-80 °C冷冻保存。将排管载入分析系统。</li>
	<li>将CDF文件保存至U盘，然后将数据从DSP仪器传输至数字分析仪。通过完成以下步骤完成设置：
	<ol>
		<li>将耗材和混合样品加载到前处理工作站上。在屏幕上点击开始处理。选择高灵敏度，然后点击下一步。针对有样品的孔数点击全选，然后点击| 完成 | 下一步，设置电子邮件通知，最后点击| 开始。</li>
		<li>当前处理工作站运行完成后，密封检测盒并转移至数字分析仪。点击开始计数，选择载台位置，点击加载已有CDF文件，并选择先前上传的文件。点击完成，再次选择载台位置，点击完成 | 开始以运行程序。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将分析系统生成的报告计数转换文件的压缩包保存至U盘，然后将U盘插入DSP仪器。在DSP控制中心中，将鼠标悬停于数据采集，然后点击上传计数，并选择相应的压缩文件。</li>
</ol>
6. 数据分析17
<ol>
	<li>在DSP Control Center中点击Records。要查看队列中的扫描数据，请选择Add Selected Scans to Queue | My Analysis Queue。将鼠标悬停在Control Center中的Data Analysis选项上，然后选择New Study from Queue。</li>
	<li>从Task Bar Options中选择QC。可继续使用默认值，或根据需要进行调整。选择Run QC并查看Results Grid。点击Run QC以继续并创建新数据集，将数值归一化至阳性杂交对照。</li>
	<li>将新标签导入XLSX文件。在Scans面板中选择Manage Annotations，下载模板，插入标签，然后导入该文件。</li>
	<li>可选：运行QC后，可使用其他工具栏选项进一步调整数据。使用Visualizations面板中的工具绘制转换后的数据图。</li>
	<li>在Visualizations面板中，通过灰色下拉参数框设置每个图表的参数。在图表中选择特定区域，可在Scans面板中高亮显示相应片段，右键单击以生成标签或分组。在Dataset Summary中，查看来自Normalization、Scaling及其他选项的图表，用于分析和展示。</li>
	<li>通过点击Save图标保存可视化结果；在Summary下查看已保存的可视化内容。点击Export (.svg)按钮以.svg格式导出可视化图像。点击Export (.xlsx)按钮导出可视化所基于的数据。将鼠标悬停在第二个面板中的数据集名称上，然后点击export图标，可导出该特定数据集中的所有数据。</li>
</ol>

<ol><li>Pedersen, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migratory+patterns+of+lac-z+transfected+human+glioma+cells+in+the+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Migratory patterns of lac-z transfected human glioma cells in the rat brain.</a> International Journal of Cancer. 62 (6), 767-771 (1995).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+white+matter+tracts+by+glioma+stem+cells+is+regulated+by+a+NOTCH1-SOX2+positive-feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop.</a> Nature Neuroscience. 22 (1), 91-105 (2019).</li>
<li>Iwadate, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transition+in+glioblastoma+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Letters%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transition in glioblastoma progression.</a> Oncology Letters. 11 (3), 1615-1620 (2016).</li>
<li>Tao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomics+and+prognosis+analysis+of+epithelial-mesenchymal+transition+in+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Genomics and prognosis analysis of epithelial-mesenchymal transition in glioma.</a> Frontiers in Oncology. 10, 183(2020).</li>
<li>Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neurocentric+perspective+on+glioma+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A neurocentric perspective on glioma invasion.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).</li>
<li>Barthel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma%3A+molecular+signature+and+crossroads+with+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+and+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">Glioma: molecular signature and crossroads with tumor microenvironment.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 1 (1), 53-75 (2021).</li>
<li>Ziegler, D. S., Kung, A. L., Kieran, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-apoptosis+mechanisms+in+malignant+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Anti-apoptosis mechanisms in malignant gliomas.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (3), 493-500 (2008).</li>
<li>Berghoff, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+death+ligand+1+expression+and+tumor-infiltrating+lymphocytes+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Programmed death ligand 1 expression and tumor-infiltrating lymphocytes in glioblastoma.</a> Neuro-Oncology. 17 (8), 1064-1075 (2015).</li>
<li>Merritt, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+digital+spatial+profiling+of+proteins+and+RNA+in+fixed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue.</a> Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).</li>
<li>Van, T. M., Blank, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+user%27s+perspective+on+GeoMxTM+digital+spatial+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Immuno-Oncology+Technology%22%5BJournal%5D)">A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling.</a> Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).</li>
<li>Garcia-Pardo, M., Calles, A. ROS-1 NSCLC therapy resistance mechanism. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGarcia-Pardo%2C+M+%22Precision+Cancer+Medicine%22">Precision Cancer Medicine</a>. , Online (2021).</li>
<li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+spatial+profiling+of+individual+glomeruli+from+patients+with+anti-neutrophil+cytoplasmic+autoantibody-associated+glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Digital spatial profiling of individual glomeruli from patients with anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody-associated glomerulonephritis.</a> Frontiers in Immunology. 13, 831253(2022).</li>
<li>Bergholtz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+for+spatial+profiling+for+breast+cancer+research+with+the+GeoMx+digital+spatial+profiler%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the GeoMx digital spatial profiler.</a> Cancers. 13 (17), 4456(2021).</li>
<li>Brady, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inter-+and+intra-tumor+heterogeneity+of+metastatic+prostate+cancer+determined+by+digital+spatial+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Inter- and intra-tumor heterogeneity of metastatic prostate cancer determined by digital spatial gene expression profiling.</a> Nature Communications. 12 (1), 1426(2021).</li>
<li>Kulasinghe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+digital+spatial+profiling+of+the+tumor+microenvironment+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed digital spatial profiling of the tumor microenvironment of head and neck squamous cell carcinoma patients.</a> Frontiers in Oncology. 10, 607349(2021).</li>
<li>Wang, D. Y. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Case+study%3A+Digital+spatial+profiling+of+metastatic+clear+cell+carcinoma+reveals+intra-tumor+heterogeneity+in+epithelial-mesenchymal+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Case study: Digital spatial profiling of metastatic clear cell carcinoma reveals intra-tumor heterogeneity in epithelial-mesenchymal gradient.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>GeoMx DSP. Automated slide preparation user manual. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22GeoMx+DSP%22">GeoMx DSP</a>. , nanoString Technologies. Seattle, Washington. (2022).</li>
<li>Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+bioimaging+of+single-cell+spatial+profiles+for+precision+cancer+diagnostics+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Precision+Oncology%22%5BJournal%5D)">Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics.</a> NPJ Precision Oncology. 4, 11(2020).</li>
<li>Wolchok, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overall+survival+with+combined+nivolumab+and+ipilimumab+in+advanced+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Overall survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma.</a> New England Journal of Medicine. 377 (14), 1345-1356 (2017).</li>
<li>Blank, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neoadjuvant+versus+adjuvant+ipilimumab+plus+nivolumab+in+macroscopic+stage+III+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neoadjuvant versus adjuvant ipilimumab plus nivolumab in macroscopic stage III melanoma.</a> Nature Medicine. 24 (11), 1655-1661 (2018).</li>
<li>Matthews, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-enriched+hyaluronan+binding+%28BEHAB%29%2Fbrevican+cleavage+in+a+glioma+cell+line+is+mediated+by+a+disintegrin+and+metalloproteinase+with+thrombospondin+motifs+%28ADAMTS%29+family+member%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Brain-enriched hyaluronan binding (BEHAB)/brevican cleavage in a glioma cell line is mediated by a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs (ADAMTS) family member.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (30), 22695-22703 (2000).</li>
<li>Paganetti, P. A., Caroni, P., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+infiltration+into+central+nervous+system+tissue+in+vitro%3A+involvement+of+a+metalloprotease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma infiltration into central nervous system tissue in vitro: involvement of a metalloprotease.</a> Journal of Cell Biology. 107, 2281-2291 (1988).</li>
<li>Beliën, A. T., Paganetti, P. A., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-type+1+matrix+metalloprotease+%28MT1-MMP%29+enables+invasive+migration+of+glioma+cells+in+central+nervous+system+white+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Membrane-type 1 matrix metalloprotease (MT1-MMP) enables invasive migration of glioma cells in central nervous system white matter.</a> Journal of Cell Biology. 144 (2), 373-384 (1999).</li>
<li>Coulie, P. G., Vanden Eynde, B. J., vander Bruggen, P., Boon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+antigens+recognized+by+T+lymphocytes%3A+At+the+core+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour antigens recognized by T lymphocytes: At the core of cancer immunotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 14 (2), 135-146 (2014).</li>
<li>Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccines+for+cancer+prevention%3A+a+practical+and+feasible+approach+to+the+cancer+epidemic%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Vaccines for cancer prevention: a practical and feasible approach to the cancer epidemic.</a> Cancer Immunology Research. 2 (8), 708-713 (2014).</li>
<li>Sharma, P., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+immune+checkpoint+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The future of immune checkpoint therapy.</a> Science. 348 (6230), 56-61 (2015).</li>
<li>Chen, L., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-PD-1%2FPD-L1+therapy+of+human+cancer%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Anti-PD-1/PD-L1 therapy of human cancer: past, present, and future.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3384-3391 (2015).</li>
<li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma-Associated+stromal+cells+stimulate+glioma+malignancy+by+regulating+the+tumor+immune+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Glioma-Associated stromal cells stimulate glioma malignancy by regulating the tumor immune microenvironment.</a> Frontiers in Oncology. 11, 672928(2021).</li>
<li>Ishii,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+characterization+of+the+tumorigenic+%26%2334%3Bperi-necrotic+niche%26%2334%3B+harboring+quiescent+stem-like+tumor+cells+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Histological characterization of the tumorigenic &#34;peri-necrotic niche&#34; harboring quiescent stem-like tumor cells in glioblastoma.</a> PLoS One. 11 (1), 0147366(2016).</li>
<li>Lewis, C. E., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+role+of+macrophages+in+different+tumor+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments.</a> Cancer Research. 66 (2), 605-612 (2006).</li>
<li>NanoString. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CosMx+Spatial+Molecular+Imager%3A+True+Single-Cell+In+Situ+Solution%5BTitle%5D)+AND+%22NanoString%22%5BJournal%5D)">CosMx Spatial Molecular Imager: True Single-Cell In Situ Solution.</a> NanoString. , (2022).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

鉴于可能影响胶质瘤侵袭性的蛋白质具有多样性，且其中一些蛋白质尚未被发现，高通量蛋白质定量方法是一种理想的技术手段。此外，由于肿瘤样本中的空间数据通常与差异表达相关18，将空间分析整合到蛋白质定量方法中可实现更有效的分析。
DSP 的高通量方法还可用于类似鸟枪法的策略，这非常适用于发现潜在的新型疾病生物标志物以及治疗反应的标志物。在两项关于黑色素瘤的研究中，DSP 被用于评估伊匹单抗联合纳武单抗治疗与纳武单抗单药治疗的反应19，以及伊匹单抗联合纳武单抗新辅助治疗与标准辅助治疗的对比20。在这两项研究中，治疗后对多种蛋白质靶标的 DSP 分析显示关键免疫标志物的相对表达存在差异，提示这些标志物可能作为治疗反应的潜在生物标志物发挥作用。
DSP 还有助于确定复杂分子水平过程的最终病理学意义。例如，侵袭性胶质瘤的一个显著特征是其直接穿过细胞外基质（ECM）迁移的倾向，且其迁移路径通常受到血管和...

弥漫性浸润性胶质瘤是成人中最常见的恶性脑肿瘤，且 invariably 致命。胶质瘤细胞在脑内广泛迁移的倾向性给治疗带来了重大挑战。其扩散机制涉及定向迁移和不受控制的侵袭。研究表明，侵袭性胶质瘤细胞表现出沿白质纤维束趋向性迁移的特性1，近期研究进一步指出这些纤维束的脱髓鞘化是一种主动的、促肿瘤发生的特征2。这种侵袭过程由上皮-间质转化介导，胶质瘤细胞通过下调编码细胞外基质蛋白和细胞黏附分子的基因表达，获得间质样特性，从而增强迁移能力，并促进其在肿瘤微环境中的播散3,4,5。
在分子水平上，已有研究证实多种维持细胞稳定性和与免疫原性组分相互作用的蛋白质功能受到破坏6。浸润性胶质瘤已知会抑制具有抗凋亡特性（如 PTEN）的蛋白质表达7，同时还会过表达促进逃避免疫系统识别的蛋白质（如 PD1/PDL1）8。这些复杂通路的失调增强了肿瘤发生能力，并提高了恶性潜能。
在侵袭性胶质瘤样本中，本研究旨在评估细胞生长、存活、增殖以及微环境结构完整性相关关键蛋白在侵袭性与非侵袭性组分之间的差异表达。此外，我们还致力于研究具有主动免疫原性作用的蛋白质的差异调控，以揭示宿主免疫防御功能受损如何增强胶质瘤增殖和侵袭潜能的机制。这一点尤为重要，因为近期大量研究已表明，恶性肿瘤中免疫标志物及失调驱动因子可作为免疫治疗的靶点。在参与免疫监视和免疫应答的众多蛋白质中识别出可行的治疗靶点，需要采用高灵敏度且全面的研究方法。
鉴于可研究的候选蛋白质种类繁多，我们寻求一种类似于免疫组织化学但具有更高数据处理效率的方法。在癌症生物学领域，数字空间分析（DSP）已发展成为一种强大的技术，在蛋白质组分析与定量方面相较于其他工具具有重要优势。DSP 的显著特征是其高通量多重检测能力，可在同一样本中同时研究多种不同蛋白质，这使其与标准但低重数的技术（如免疫组织化学，IHC）形成重要区别9,10。DSP 的多重检测特性并未牺牲其作为定量与分析工具的准确性，已有研究通过将 DSP 与 IHC 进行比较证实了这一点。例如，在对非小细胞肺癌标本进行蛋白质组定量时，DSP 所得结果与 IHC 相似11。此外，DSP 提供可自定义的区域选择功能，用户可手动划定进行蛋白质组分析的特定区域，这一优势优于全切片多重检测方法10,12。因此，在单次处理过程中，DSP 即可通过对多个感兴趣区域内的多种蛋白质靶标进行检测，实现多层次的分析。
DSP 在多种不同的病理条件下具有应用价值。在肿瘤学分析中，DSP 尤其具有优势，因为空间异质性可能与细胞转化及差异性蛋白表达相关。例如，DSP 已被用于比较乳腺癌与其邻近肿瘤微环境的蛋白质组学特征。这对于理解该肿瘤的自然病程及其进展，以及潜在的治疗反应具有重要意义13。其他体现 DSP 多功能性的情境包括：在前列腺癌中对蛋白质多样性进行空间定量分析14，在头颈部鳞状细胞癌中将免疫细胞标志物表达与疾病进展相关联15，以及揭示区分转移性与原发性透明细胞卵巢癌的上皮-间质蛋白表达梯度16。通过应用 DSP，我们能够表征可能影响胶质瘤发生及侵袭行为的蛋白质空间分布特征。

<table><tbody><tr><td>BOND 研究检测系统</td><td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td><td>DS9455</td><td>含有试剂托盘中开放式容器的开放式检测系统</td></tr><tr><td>BOND 洗涤液</td><td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td><td>AR950</td><td>用于洗涤固定组织的 10 倍浓缩缓冲液</td></tr><tr><td>缓冲液 W</td><td>NanoString, Seattle, WA</td><td>contact company</td><td>封闭试剂</td></tr><tr><td>Cy3 偶联试剂盒</td><td>Abcam, Cambridge, UK</td><td>AB188287</td><td>Cy3 荧光抗体偶联试剂盒</td></tr><tr><td>GeoMx 数字空间分析仪（DSP）</td><td>NanoString, Seattle, WA</td><td>contact company</td><td>用于成像和表征蛋白质与 RNA 靶标的系统</td></tr><tr><td>GeoMx DSP 仪器缓冲液试剂盒</td><td>NanoString, Seattle, WA</td><td>100471</td><td>GeoMx DSP 缓冲液试剂盒（包含样本处理和制备所需缓冲液）</td></tr><tr><td>GeoMx 杂交编码包_蛋白质</td><td>NanoString, Seattle, WA</td><td>121300401</td><td>用于运行 GeoMx DSP 实验的对照</td></tr><tr><td>GeoMx 免疫细胞面板（Imm Cell Pro_Hs）</td><td>NanoString, Seattle, WA</td><td>121300101</td><td>针对人类免疫细胞及免疫肿瘤学靶点的蛋白质模块</td></tr><tr><td>GeoMx 泛肿瘤面板（Pan-Tumor_Hs）</td><td>NanoString, Seattle, WA</td><td>121300105</td><td>针对多种人类肿瘤类型及上皮-间质转化标志物的蛋白质模块</td></tr><tr><td>GeoMx 蛋白质切片制备 FFPE</td><td>NanoString, Seattle, WA</td><td>121300308</td><td>用于 GeoMx DSP 蛋白质分析的样本制备试剂</td></tr><tr><td>LEICA Bond RX</td><td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany</td><td>contact company</td><td>全自动免疫组化染色仪</td></tr><tr><td>主试剂盒——12 次反应</td><td>NanoString, Seattle, WA</td><td>100052</td><td>与 nCounter 分析系统配合使用的材料和试剂</td></tr><tr><td>nCounter 分析系统</td><td>NanoString, Seattle, WA</td><td>contact company</td><td>用于多重靶标表达定量的自动化系统（需与 GeoMx DSP 联用）</td></tr><tr><td>TMA Master II</td><td>3DHistech Ltd., Budapest, Hungary</td><td></td><td>用于构建组织微阵列块</td></tr></tbody></table>

用于表征成人型弥漫性浸润性胶质瘤微环境的数字空间分析

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

弥散性浸润性胶质瘤由于肿瘤扩散的浸润特性，常伴随较高的发病率和死亡率。这类肿瘤在形态上具有复杂性，其自身及异质性微环境中的蛋白质组均表现出高度变异性。多种关键信号通路中参与维持细胞稳定性及微环境结构完整性的蛋白质发生失调，进一步增强了这些肿瘤的恶性潜能。尽管已有大量针对胶质瘤的群体水平和单细胞分析研究，但这些蛋白质组学数据在空间分布上的分层信息仍相对匮乏。明确致瘤因子和免疫细胞群体在肿瘤实质、侵袭边缘及微环境之间的空间分布差异，有助于深入理解肿瘤增殖与播散的潜在机制。数字空间蛋白分析技术（Digital spatial profiling, DSP）正是一种强大的技术手段，可为这些重要的多层次分析提供坚实基础。
数字空间谱型分析（DSP）是一种可在组织样本中用户指定的空间区域内高效定量蛋白质表达水平的方法。DSP 非常适用于研究不同区域内部及之间多种蛋白质的差异性表达，支持多层面的定性和定量分析。DSP 实验流程系统性强且操作简便，可实现对蛋白质组学数据的定制化空间分析。在本实验中，组织微阵列由存档的胶质母细胞瘤穿刺核心样本构建而成。随后，选择一组特异性抗体，靶向样本中感兴趣的蛋白质。这些抗体预先偶联了可被紫外光（UV）裂解的DNA寡核苷酸，随后与组织样本在4℃孵育过夜。在荧光显微镜下观察抗体信号后，于样本中划定用于定量蛋白质表达的兴趣区域（ROIs）。接着，将紫外光照射至各个兴趣区域，使DNA寡核苷酸发生裂解。裂解后的寡核苷酸被微量吸取并分别计数，从而实现基于空间位置的相应蛋白质定量。

图4展示了在胶质母细胞瘤样本上进行的DSP实验的代表性结果。图中显示了一个热图，用于说明如何通过DSP软件以可视化方式呈现数据。每一行代表一个蛋白质靶标，每一列对应一个感兴趣区域。颜色从蓝色到红色表示表达水平从低到高。同一行内颜色的差异反映了不同区域间蛋白质表达的异质性，提示可能存在与蛋白质差异表达相关的空间分布特征。例如，在本实验中，S100和CD56在所有区域均呈现高表达，因为它们是神经标记物。
变异程度最高的标志物包括 B7-H3、Ki-67、CD44 和纤连蛋白。这些标志物分别与肿瘤增殖、迁移和转移具有重要关联。因此，在恶性肿瘤核心、恶性浸润区域以及非恶性组织样本之间，这些标志物表现出区域性的差异是合理的。此外，也可进行数值化数据表示；可导出包含各 ROI 内每种蛋白标志物表达值的表格文件，用于数学和统计分析。该表达值由 DSP 提供的数字计数功能生成，该功能可定量每个 ROI 内微吸取的 PC-寡核苷酸（图 1 和 <strong class="xfig...

蛋白质组失调在弥漫性浸润性胶质瘤的扩散过程中起着重要作用，但仍有多种相关蛋白质尚未被鉴定。数字空间分析技术（DSP）为高效、高通量地表征可能参与浸润性胶质瘤侵袭与迁移的候选蛋白质的差异表达提供了一种有效方法。

弥漫性浸润性胶质瘤由于肿瘤呈浸润性扩散，常导致较高的发病率和死亡率。它们在形态学上……

数字空间分析（Digital Spatial Profiling，DSP）为进行空间分层的蛋白质定量提供了一种高效的方法。该技术的实施使我们能够表征肿瘤不同区域及其微环境中的蛋白质表达情况。DSP 的一个关键特征是其多重检测能力，可实现高通量的数据处理。定义自定义感兴趣区域的能力为数据分析额外提供了空间维度。数字空间分析技术（DSP）可应用于任何样本，其中对蛋白质或RNA表达进行空间定量可能有助于阐明病理或生理过程。这在肿瘤学中尤为重要，因为不同区域的靶标差异可能与恶性生长或侵袭相关。演示该操作的人员为组织技术员 Scott Palisoul 和基因组技术员 Rachael Barney。制备切片时，首先从每份活检样本中取出数个直径两毫米的组织芯，放入同一个组织微阵列蜡块中。从该蜡块上切下四微米厚的切片，并将其贴附于玻璃载玻片上。将每张载玻片放入载玻片托架垫圈内，在60摄氏度下孵育30分钟。在半自动免疫组化系统中，向一号位置的容器中每张载玻片加入150 µL洗涤缓冲液，并额外加入5 mL死体积，保持盖子打开。在二号位置的容器中加入等量的封闭液。将试剂容器托盘装入仪器中。在“标记物”字段的下拉框中选择“处理IHC”，然后选择封闭溶液名称。所有玻片处理完成后，点击“关闭”。然后点击“打印标签”，勾选“所有尚未打印的载玻片标签”，再点击“打印”。将标签粘贴至载玻片顶部。将载玻片放入载玻片托盘中，确保样本面和标签面朝上。按下 LED 按钮以降下托盘，并让仪器开始扫描和识别载玻片。点击“开始”按钮以启动实验。当运行完成后，当 LED 按钮闪烁绿色时，按下该按钮。从仪器中取出托盘，小心地将每张玻片上的盖片取下。将玻片放入1X磷酸盐缓冲液中。去除多余的缓冲液，并用疏水笔在每张组织切片周围画线，以形成疏水屏障。通过每张载玻片加入八微升抗体，并用缓冲液W补足至终体积200微升，配制抗体PC寡核苷酸溶液。然后将抗体PC寡核苷酸溶液加至载玻片上，在4摄氏度下孵育过夜。孵育结束后，将载玻片置于湿盒中，并用1X TBST洗涤三次，每次10分钟。在室温下用 4% 多聚甲醛后固定 30 分钟，随后用 1× TBST 洗涤两次，每次 5 分钟。在室温下加入 SYTO 13 核染料染色 15 分钟，然后用 1× TBST 洗涤两次。将鼠标悬停在控制中心的“数据采集”上，选择“新建”或“继续运行”。将载玻片放入载玻片架中，标签朝向使用者。放下载玻片托盘夹，确保组织在长条形窗口中可见。加入 6 mL 缓冲液 S。按照控制中心中的提示操作。使用 x 和 y 滑块在不同轴之间缩放，以划定扫描区域。选择扫描，待扫描进行至整个定义的目标区域成像完毕。生成 20 倍图像。通过为每个组织核心选择三个直径为250微米的等尺寸圆形感兴趣区域（ROI）来定义ROI。单击“退出扫描工作区”按钮以确认ROI。然后等待紫外光将寡核苷酸从抗体上切割下来。完成清洗仪器程序后，选择“新建数据采集”以继续使用当前的载玻片或板。通过双击板图标区域打开最终板窗口。输入杂交编码试剂盒的批号，然后点击“更新”。然后单击“完成”。根据提示拆下玻片架和收集板。将玻片储存在 TBST 中，或用液体介质和盖玻片覆盖，以长期保存。使用透气封板膜密封反应板，并将吸出液置于热循环仪中，65摄氏度、开盖条件下干燥。加入7 µL焦碳酸二乙酯处理过的水并混匀。室温孵育10分钟，然后快速离心。通过选择适当的探针 R 和探针 U 的计算公式，并按照文本方案中描述的公式进行计算，制备探针缓冲液混合物。将 84 微升探针缓冲液混合物加入每个杂交编码试剂盒中。在新的 96 孔杂交板中，将 8 微升每种杂交编码预混液分别加入指定行的全部 12 个孔中。从DSP收集板中转移7 µL至杂交板的对应孔中。进行热封，离心混匀，并在67 °C下孵育过夜。孵育结束后，将板置于冰上冷却，并进行短暂离心。将每个孔中的杂交产物汇集至一条排管中，轻轻吹打每个孔5次。离心后，将排管放入分析系统。在DSP仪器上，将CDF文件保存至U盘，并将数据转移至数字分析仪。在屏幕上，点击“开始处理”。选择“高灵敏度”，然后点击“下一步”。针对含有样品的孔数，点击“全选”，然后点击“完成”，接着在电子邮件通知页面点击“下一步”。然后点击“开始”。当预处理工作站完成后，密封试剂盒并将其转移至数字分析仪。按下“开始计数”。选择阶段位置。按下“加载现有 CDF 文件”，并选择先前上传的文件。按下“完成”。再次选择“阶段位置”，按下“完成”，然后点击“开始”以运行程序。将分析系统中报告基因计数转换文件的ZIP文件保存至U盘，并将该U盘插入DSP仪器中。在 DSP 控制中心，将鼠标悬停在数据收集上，然后点击上传账户。选择相应的 ZIP 文件。在 DSP 控制中心点击记录。要查看队列中的扫描结果，请选择“将所选扫描添加到队列”，然后进入“我的分析队列”。将鼠标悬停在控制中心的“数据分析”选项上，选择“从队列创建新研究”。对胶质母细胞瘤样本进行了 DSP 实验，并以热图形式展示结果。每一行代表一个蛋白质靶点，每一列对应一个感兴趣的区域。表达水平通过颜色范围表示，蓝色表示低表达，红色表示高表达。同一行内颜色的变化反映了蛋白质在不同区域的异质性，提示可能存在与蛋白质差异表达相关的空间关联。在此实验中，S100 和 CD-56 普遍高表达，因为它们是神经标志物。变异程度最大的标志物包括 B7-H3、KI-67、CD-44 和纤维连接蛋白，这些标志物已知与肿瘤增殖、迁移和转移相关。从大量候选靶标中，DSP 可识别出具有显著区域差异的靶标。这为研究与变异相关的因素及其在疾病中的意义奠定了基础。

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Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

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