用于表征成人型弥漫性浸润性胶质瘤微环境的数字空间剖析

数字空间分析（DSP）提供了一种有效的空间分层蛋白质定量方法。它的实施使我们能够表征肿瘤和微环境不同区域的蛋白质表达。DSP的一个关键特性是其多路复用能力，可实现高吞吐量数据处理。

定义自定义感兴趣区域的能力还为数据分析提供了空间维度。DSP 可应用于任何在空间上定量蛋白质或 RNA 表达可能有助于阐明病理或生理过程的样品。这在肿瘤学中尤其重要，因为区域靶标变异性可能与恶性生长或侵袭相关。

展示该程序的将是组织技术专家Scott Palisoul和基因组技术专家Rachael Barney。为了准备载玻片，首先从每个活检中取出几个两毫米的核心，并将它们放入单个组织微阵列块中。从块上切割四微米的部分，并将它们安装在载玻片上。

将每张载玻片放在载玻片支架垫圈内，并在 60 摄氏度下孵育 30 分钟。在半自动IHC系统中，每张载玻片用150微升洗涤缓冲液加上5毫升死体积填充位置一的容器，并保持盖子打开。在位置二的容器中填充相同量的封闭溶液。

将试剂容器托盘装载到机器上。选择"处理 IHC"，然后在"标记"字段的下拉框中选择阻止解决方案名称。完成所有幻灯片后，单击"关闭"。

然后单击"打印标签"，并选中"所有尚未打印的幻灯片标签"，然后单击"打印"。将标签粘贴到幻灯片的顶部。将载玻片装载到载玻片托盘上，确保样品和标签朝上。

按下 LED 按钮降低托盘，让仪器开始扫描和识别载玻片。单击"开始"按钮开始实验。运行完成后，按下 LED 按钮，使其呈绿色闪烁。

从仪器上取下托盘，然后小心地从每张幻灯片上提起盖板。将载玻片放入1X磷酸盐缓冲盐水中。去除多余的缓冲液，并用疏水笔勾勒出每个组织切片的轮廓，以形成疏水屏障。

通过每张载玻片添加 8 微升每种抗体并使用缓冲液 W 达到 200 微升的最终体积来制备抗体 PC 寡核苷酸溶液。然后将抗体PC寡核苷酸溶液涂在载玻片上，并将载玻片在4摄氏度下孵育过夜。孵育后，将载玻片放入加湿的托盘中，并在1X TBST中洗涤三次10分钟。

在室温下在4%多聚甲醛中后固定30分钟，然后在1X TBST中洗涤两次5分钟。在室温下加入 SYTO 13 核染色剂 15 分钟，然后用 1X TBST 洗涤两次。将鼠标悬停在控制中心的数据收集上，然后选择新建或继续运行。

将载玻片放在载玻片支架中，标签朝向用户。降低滑动托盘夹，确保组织在细长的窗口中可见。加入六毫升缓冲液S.按照控制中心的提示操作。

使用 x 和 y 滑块在不同轴之间缩放，以描绘要扫描的区域。选择"扫描"，并允许扫描继续，直到对整个定义的目标区域进行成像。生成 20 倍图像。

通过为每个组织核心选择三个直径为 250 微米的相同大小的圆形 ROI 来定义 ROI。通过单击退出扫描工作区按钮批准投资回报率。然后等待紫外线将寡核苷酸从抗体中切割出来。

完成清洁仪器过程后，选择"新建数据收集"以继续处理当前载玻片或孔板。双击板图标区域打开最终的板窗口。输入杂交码包批号，然后单击更新。

然后点击完成。按照提示拆下载玻片支架和收集板。将载玻片储存在TBST中，或用水性介质和盖玻片覆盖它们以长期储存。

使用渗透密封密封板，并在顶部打开的热循环仪中以65摄氏度的温度干燥吸气物。加入七微升焦碳酸二乙酯处理的水并混合。在室温下孵育 10 分钟，然后快速旋转。

通过选择适当的探针R和探针U方程来制备探针缓冲液混合物，应用文本协议中所述的公式。向每个杂交代码包中加入 84 微升探针缓冲液混合物。在新鲜的 96 孔杂交板中，将 8 微升每种杂交代码预混液加入指定行的所有 12 孔中。

将7微升从DSP收集板转移到杂交板中的相应孔中。热封，旋转板，并在67摄氏度下孵育过夜。孵育后，将板在冰上冷却，然后进行快速旋转。

将每个孔的杂交产物汇集到带管中，轻轻移液每个孔五次。向下旋转，并将带管装入分析系统。在DSP仪器上，将CDF文件保存到USB驱动器上，然后将数据传输到数字分析仪。

在屏幕上，按开始处理。选择高灵敏度，然后选择下一步。按全选以获取含样品的孔数，然后按完成，然后在电子邮件通知上按下一步。

然后点击开始。制备站完成后，密封小柱并将其转移到数字分析仪中。按开始计数。

选择舞台位置。按加载现有 CDF 文件，然后选择以前上传的文件。按完成。

再次选择舞台位置，按完成，然后启动以运行程序。将报告器计数转换文件的 ZIP 文件从分析系统保存到 USB 驱动器。将驱动器插入 DSP 计算机。

在 DSP 控制中心中，将鼠标悬停在数据收集上，然后单击上传帐户。选择相关的 ZIP 文件。单击DSP控制中心中的记录。

要查看队列中的扫描，请选择"将所选扫描添加到队列"，然后选择"我的分析队列"。通过将鼠标悬停在控制中心的数据分析选项上，从队列中选择新算例。对胶质母细胞瘤样本进行DSP实验，结果可视化为热图。

行代表蛋白质靶标，每列对应于一个感兴趣区域。表达级别由颜色范围表示，从蓝色（表示低表达）到红色（表示高表达）。一行内颜色的变异性反映了区域蛋白质的异质性，并表明可能与差异蛋白质表达的空间关联。

在这个实验中，S100和CD-56普遍很高，因为它们是神经标记。变异性最大的标志物包括 B7-H3、KI-67、CD-44 和纤连蛋白，已知它们与肿瘤增殖、迁移和转移有关。从大量的候选目标中，DSP可以识别出那些表现出显着区域差异的目标。

这为研究与变异性相关的因素及其与疾病的相关性奠定了基础。