全基因组范围内的转录因子-DNA 结合相互作用分析：一种针对Candida albicans的全面CUT&RUN方法与数据分析流程

本方案详细描述了从转录因子编码基因的表位标记，到计算数据分析的全部实验步骤，通过CUT&RUN技术在白色念珠菌中进行全基因组范围的转录因子-DNA结合相互作用分析。该技术比传统的ChIP-chip和ChIP-seq方法更易于操作、速度更快、灵敏度更高、成本更低，并能提供更高质量的数据。尽管本方案是针对从生物膜或浮游培养物中分离的白色念珠菌细胞所开发的，但其几乎可适用于任何状态良好的白色念珠菌细胞，并具有良好的可适配性。

孵育细胞悬液后，取5 µL等分试样加入新的PCR管中。向5 µL分离的细胞核以及先前在4 °C保存的5 µL完整细胞等分试样中，分别加入1 µL的Calcofluor White和1 µL的SYTO 13。在30 °C避光孵育30分钟。

使用荧光显微镜目视检查分离细胞核的完整性和纯度。观察显示明显SYTO 13染色的分离细胞核，并确保钙荧光白染料未对细胞壁产生染色。以完整细胞作为对照，重复检查钙荧光白染料对细胞壁的染色情况。

将试管置于磁力架上，静置直至悬液完全澄清。用移液器弃去上清液。加入50 µL抗体缓冲液，通过移液轻轻混匀。

向各管中加入三微升抗GFP多克隆抗体，在4摄氏度下于旋转摇床中孵育两小时。在室温下以100 × g短暂离心五秒，将各管置于磁力架上。待悬液澄清后，用移液器弃去上清液。

当含有珠子的离心管仍置于磁力架上时，直接向珠子中加入 200 µL 冰冷的细胞通透缓冲液。使用移液器弃去上清液。用冰冷的细胞通透缓冲液重复洗涤两次。

向每管中加入 50 µL 冰冷的细胞通透缓冲液，通过移液轻轻混匀。向每个样品中加入 2.5 µL 蛋白 AG-MNase，通过移液混匀。将样品置于 4 °C 的摇床中，孵育 1 小时。

将条状管在室温下以100 × g短暂离心5秒，然后将管子置于磁力架上。待裂解液澄清后，用移液器弃去上清液。保持含有磁珠的管子仍在磁力架上，直接向磁珠中加入200 µL预冷的细胞通透缓冲液。

使用移液器弃去上清液。用预冷的细胞通透缓冲液重复洗涤两次。向样品中加入 100 µL 预冷的细胞通透缓冲液，轻轻吹打混匀五次。

根据制造商的说明，从电泳槽中取出凝胶模具并打开。小心地将凝胶从模具中取出，放入含有100毫升1×TBE缓冲液的凝胶托盘中。向托盘中加入10微升核酸凝胶染料，并轻轻摇晃。

用铝箔覆盖以避光，室温静置孵育 10 分钟。随后用 100 毫升去离子自来水将凝胶冲洗两次。使用琥珀色滤光片覆盖，在蓝光照射下成像凝胶。

对于每个文库，切取凝胶中略高于约125个碱基对的明显接头二聚体条带、并位于400个碱基对梯形标记下方的区域。使用22号针头在0.65毫升离心管底部穿孔，并将穿孔后的管子放入一个无菌的2毫升微量离心管中。将凝胶切片转移至置于2毫升微量离心管内的穿孔管中。

将含有0.65毫升穿刺管和样品的2毫升微量离心管在室温下以10,000 × g离心2分钟，以收集2毫升微量离心管内的凝胶浆液。向凝胶浆液中加入300 µL预冷的凝胶洗脱缓冲液。在室温下于旋转混合仪上混合至少3小时或过夜。

将所有液体和凝胶状悬液转移至0.22微米滤柱中，在室温下以10,000 × g离心一分钟。通过点击GitHub页面上的绿色“Code”按钮，随后选择“Download ZIP”选项，下载CUT&RUN分析的源代码。将文件夹解压缩至本地计算机的相应位置。

安装 Conda 环境并仅执行一次。Conda 安装完成后，使用相关命令创建虚拟环境。每次执行此工作流程时，均需激活该虚拟环境。

通过使用荧光细胞壁染料和核酸染料对对照完整细胞及分离的细胞核进行染色观察，评估细胞壁消化情况和细胞核完整性。与未观察到细胞壁染色的分离完整细胞核相比，对照完整细胞中的细胞核和细胞壁均显示出荧光标记。该图显示了使用毛细管电泳仪分析的CUT&RUN转录因子文库。

成功的 CUT&RUN 转录因子文库中富集了小于 200 个碱基对的短片段。质量不佳的 CUT&RUN 转录因子文库则表现出对大片段 DNA 的富集。本文中的图示显示，在 CUT&RUN 鉴定出的所有 Ndt80 结合位点中，Ndt80 DNA 结合基序均得到富集，表明该方法鉴定出的额外峰很可能是真实的 Ndt80 结合位点。

比较分析表明，CUT&RUN 方法在生物膜形成过程中检测到了 Ndt80 和 Efg1 大多数已知的结合事件。总体而言，Ndt80 和 Efg1 的结合位点与先前发表的染色质免疫沉淀（ChIP）数据重叠，并且部分位点仅通过 CUT&RUN 方法被鉴定出来。该技术使我们能够显著拓展并加快针对转录调控网络以及白色念珠菌的研究进程。